1、無菌取樣技術本單元講述了無菌取樣操作， 在討論無菌取樣的原因和采集方法之前， 必須 要理解“無菌的”的這一術語，“無菌”一般用于取樣中，意味著取樣過程中， 避免操作引起污染。一個無菌樣品的采集，應該通過這樣一種方式，即：在收集 過程中，本身應避免污染，然后放入消毒容器中。無菌樣品的采集基本是為了支持、針對工廠的衛生條件狀況的檢查結果。一、檢驗前的準備工作：1包裝無菌取樣的工具：擁有正確的采取產品或加工過程的無菌取樣器械工具是至關重要的的。 除非 使用合適的采集工具， 否則樣品的完整性會被懷疑， 甚至樣品毫無意義。 為了避 免沒有合適的取樣工具，建議建立一個無菌取樣的分析清單，來收集取樣工具。

2、如果可能盛樣品的容器在最初進入加工區之前應當被預先標識， 象樣品號、取樣 日期、取樣人等。 這樣可以使在不同的工廠條件下的樣品取樣更為方便一些。 附 加樣品號碼一般在樣品采集中被正式確定下來，因此不用預先標明。人員的工具設施， 象工作服、發網或消毒處理過的清潔的鞋靴必須具備有助 于證明采集者沒有污染到食物產品或樣品。2生產線樣品 In-Line Samples ：生產線樣品一般是指原材料， 原料生產用水、 包裝材料或其他任何使用在生 產線的材料。生產線樣品的采集一般用來確定細菌污染源是否來自于原材料或加工序中 的某些地方。3環境樣品：環境樣品用細菌拭子， （注：細菌拭子樣品不能給出測出微生物的

3、定時結 果，因為樣品非常小，顯著微生物會經常丟失），棉拭子的取樣部位一般來自于 食品接觸面，地板噴濺物。墻壁、頂部管道和檢驗中考察的其他潛在污染源程序， 并且記錄可能的聯系， 在環境樣品來源和食物產品的污染方面， 可以使樣品具有 意義，并且是提倡這樣做的，例如：地面噴濺水：工人從有地面污水的地方走過后又回到加工區域嗎？墻壁：墻壁上面和在制品上面有昆害蟲嗎？天花板：冷凝物或噴漆有無掉落到產品上或被發現與產品相接觸？4某些準備干冰：（有的稱為 gel backs ）如果使樣品在貯運過程中保持冷卻， 一些種類的制冷劑是必需的。 檢查觀看 干冰袋子是否有接觸， 如果泄漏可能污染樣品， 你也可以用濕冰，

4、 濕冰可以由工 廠提供，然而取樣前必須清楚這一點， 如果想保持樣品冷凍， 干冰應在檢驗前獲 得。盒子或制冷皿：檢驗員需要貯藏、 運輸他們的樣品， 如果樣品不需冷凍， 那么用一個盒子即 可，但如果樣品需要冷卻， 一個標準的制冷皿或保溫箱是必須使用的， 一般來講 制冷皿隨帶著一個塑料袋， 樣品可以放還袋子里， 制冷劑象干冰， 等可以放置在 袋外，這樣樣品被冰污染的可能性就被避免了。滅菌容器：從塑料袋到滅菌的加侖漆桶，可以用于有銳利邊面的產品如蟹、蝦等。取樣工具：取樣工具包括：茶匙、角匙、尖嘴鉗、 fovceps tongs 量筒和燒杯，工具的 類型一般由取樣產品來決定。所有取樣設施和容器的滅菌日期

5、應當被檢查、 滅菌時間應當在儀器設施的標 簽和包裝上標明， 一些儀器設施可以在當地實驗室滅菌處理或購買滅菌儀器， 在 當地實驗室滅菌的儀器設施一般可以保持至少兩個月，過期后設施必須重新滅 菌。滅菌手套：滅菌手套在采樣中并非必須啟用， 如果一個產品在樣品收集過程中必須被接 觸，那么最好讓工廠生產線的工人來做（加工處理產品的工人），將樣品放入收 集容器中， 既然工人在生產過程中處理接觸產品， 那么我們就不能認為他們對產 品又有附加的污染。當用手套時必須用一種避免污染的方式戴上， 手套的大小必須適合工作的需 要。無菌棉拭子：一般用于拭取儀器設施和工廠環境區域，使用棉拭子一般有一個正確的程 序，打開棉

6、拭子剝掉表皮， 然后必須小心的放在試管頭上， 注意不要沾染棉拭子 的外端； 下一步擦拭要取樣的部位， 象案板頭或頂部管道， 然后從試管頭上小心 翼翼地將拭子放入將其全部堆入直到試管中部。滅菌全包裝袋：袋子必須購買滅菌的， 使用時只需撕掉封頭， 用提供的地方張開袋子， 將樣 品放入，然后將袋子頂端卷起，用線繩扎實牢；底部應當折疊兩次，以便線繩不 會穿透塑料袋，導致樣品泄露。當樣品收集時， 樣品采集時的條件例如產品的溫度、 地點等， 連同扦樣樣品 號嘜頭，一并記錄入檢驗員的注釋說明中， 取樣的樣品可以從樣品號、 采集日期、 附加樣品號，最初調查人和其他鑒別信息事區分。當采集無菌樣品時，一條最重要的

7、規則是：千萬別污染樣品。這需要樣品采集人非常小心地采集所有附加樣品，確保不違反這條規則。二、取樣方案微生物檢驗的特點是一個以小份樣品的檢測結果來說明一大批食品衛生質 量，因此，用于分析的樣品的代表性至關重要，也即樣品的數量、大小和性質對 結果判定產生重大影響。 要保證樣品的代表性首先要有一套科學的抽樣方案， 其 次使用正確的抽樣技術，并在樣品的保存和運輸過程中保持樣品的原有狀態。一般說來，進出口貿易合同對食品抽樣量有明確規定的，按合同規定抽樣； 進出口貿易合同沒有具體抽樣規定的， 可根據檢驗的目的， 產品及被抽樣品批的 性質和分析方法的性質確定抽樣方案。 目前最為流行的抽樣方案為 ICMSF推

8、薦的 抽樣方案和隨機抽樣方案， 有時也可參照同一產品的品質檢驗抽樣數量抽樣， 或 按單位包裝件數 N 的開平方值抽樣。 無論采取何種方法抽樣， 每批貨物的抽樣數 量不得少于 5 件。對于需要檢驗沙門氏菌的食品， 抽樣數量應適當增加， 最低不 少于 8 件。ICMSF推薦的抽樣方案ICMSF的采樣設想及其基本方法用于分析所抽樣品的數量、 大小和性質對結果會產生很大影響。 在某些情況 下用于分析的樣品可能代表所抽“一批”（ lot ）樣品的真實情況，這適合于可 充分混合的液體，如牛奶和水。在“多批”（ Lots 或“ batchers ”）食品的情況下就不能如此抽樣，因為 “一批”容易包含在微生物

9、的質量上差異很大的多個單元。 因此在選擇抽樣方案 之前，必須考慮諸多因素（ ICMSF， 1986），包括：檢驗目的產品及被抽樣品的性質分析方法ICMSF提出的采樣基本原則，是根據（ 1）各種微生物本身對人的危害程度 各有不同。（ 2）食品經不同條件處理后，其危害度變化情況：降低危害度； 危害度未變；增加危害度，來設定抽樣方案并規定其不同采樣數。目前，加 拿大、以色列等很多國家已采用此法作為國家標準。 在進行詳細敘述之前， 先解 釋四個代號：n：系指一批產品采樣個數c：系指該批產品的檢樣菌數中，超過限量的檢樣數，即結果超過合格菌數 限量的最大允許數。m：系指合格菌數限量，將可接受與不可接受的數

10、量區別開。M：系指附加條件，判定為合格的菌數限量，表示邊緣的可接受數與邊緣的 不可接受數之間的界限。1ICMSF的采樣方法有些實驗室在每批產品中， 僅采一個檢樣進行檢驗， 該批產品是否合格， 全 憑這個檢樣來決定。 ICMSF方法與此不同，它是從統計學原理來考慮，對一批產 品，檢查多少檢樣，才能夠有代表性， 才能客觀地反映出該產品的質量而設定的。 ICMSF方法中包括二級法及三級法兩種。二級法只設有 n、及 m值，三級法則 有 n、c、m及 M值。 M即附加條件后判定合格的菌數限量。（1）二級抽樣方案。自然界中材料的分布曲線一般是正態分布，以其一點 作為食品微生物的限量值， 只設合格判定標準

11、m值，超過 m值的，則為不合格品。 檢查在檢樣是否有超過 m值的，來判定該批是否合格。 以生食海產品魚為例 n=5， c=0， m=102，n=5即抽樣 5 個， c=0即意味著在該批檢樣中，未見到有超過 m值 的檢樣，此批貨物為合格品。（2）三級抽樣方案。設有微生物標準 m及 M值兩個限量如同二級法，超過 m值的檢樣，即算為不合格品。其中以 m值到 M值的范圍內的檢樣數， 作為 c值， 如果在此范圍內，即為附加條件合格，超過 M值者，則為不合格。例如：冷凍生 蝦的細菌數標準 n=5，c=3，m=101，M=102，其意義是從一批產品中， 取 5 個檢樣， 經檢樣結果，允許 3 個檢樣的菌數是

12、在 mM值之間，如果有 3 個以上檢樣 的菌數是在 mM值之間或一個檢樣菌數超過 M值者，則判定該批產品為不合 格品。（3） ICMSF對食品中微生物的危害度分類與抽樣方案說明為了強調抽樣與檢樣之間的關系， ICMSF已經闡述了把嚴格的抽樣計劃與食 品危害程度相聯系的概念（ ICMSF， 1986）。在中等或嚴重危害的情況下使用二 級抽樣方案，對健康危害低的則建議使用三級抽樣方案。ICMSF是將微生物的危害度、 食品的特性及處理條件三者綜合在一起進行食 品中微生物危害度分類的。 這個設想是很科學的， 符合實際情況的， 對生產廠及 消費者來說都是比較合理的。下面結合表 1 加以說明。表 1、 I

13、CMSF按微生物的危害度及食品處理進行情況分類級 別危害程度對象微生物食品經不同處理后的危害度減少（加熱）無變化（冷 凍品立刻進 食）增加危害度（未 加熱吃到吃前還 有一段時間）1. 食品的保藏細菌數例1例2例32. 輕度間接指大腸菌群n=5 c=3n=5 c=2n=5 c=1級標菌方大腸桿菌例4例5例6案金黃色葡萄球菌n=5 c=3n=5 c=2n=5 c=1（指標菌）3. 中度程度局 部傳播金黃色葡萄球菌蠟樣芽孢桿菌例7例8例9產氣莢膜梭菌n=7 c=2n=5 c=1n=10 c=11. 中度程度廣沙門氏菌副溶血例 10例 11例 12級泛傳播性弧菌致病性大方腸桿菌n=5 c=0n=10

14、c=0n=20 c=3案2. 嚴重程度肉毒梭菌例 13例 14例 15霍亂弧菌n=15 c=0n=30 c=10n=60 c=0傷寒沙門氏菌副傷寒沙門氏菌注：表中“減少”系指食品經加熱殺死污染的細菌無變化”系指微生物數不增減例如冷凍食品或干燥食品。增加”系指將食品保存在不良環境中使微生物易于繁殖和產毒。根據上表 15種情況的舉例， 1-3 可用三級法， 4-5 可用二級法來判定是否合考慮到以上 15 種情況，分別設定不同的取檢樣數及檢樣污染數，在 1-9 例 種檢樣需采 5個（ n=5），而污染檢樣數設定為 c=3，2，1。在 10-15 例用二級 法則不得檢出該致病菌 c=0。例如冷凍食品，

15、細菌數按例 2，大腸菌按例 5，金 黃色葡萄球菌按例 8，沙門氏菌按例 11 的二級法判定。對食品處理應酌情考慮， 例如生肉火腿中的金黃色葡萄球菌， 被腐敗菌所抑 制，不易發生食物中毒，適用例 7 和例 8。烹調加工后的熟肉，對腐敗菌沒有抵 抗力，則易發生食物中毒，適用例 9。加熱鹽腌的火腿，水分活性為 0.86 以下， 金黃色葡萄球菌有增殖的可能性，因此適用例 9。沙門氏菌水活性在 0、94 以下 不能繁殖，適用例 11，如上所述，應根據各種食品的危害度進行設定。ICMSF方法是以二級法、三級法和抽樣的概念為基礎，再將微生物的知識加進來，則可以提出各種食品的微生物標準。如表 2。為了安全，冷

16、凍生蝦加熱吃，減少危害度適用例 1、 4、 10。冷凍加工蝦， 為了不加熱就食，在解凍中有增強危害度的可能性，適用例 3、 6、 9、12，對象 微生物特別指定金黃色葡萄球菌腸毒素， 兩者雖菌數限量是相同的， 但情況有所 不同，分別適用 c=3，c=1，因此不依靠菌數限量，而用合格率來控制。表 2、 ICMSF蝦的微生物標準食品名稱檢查項目例級別nc菌數限量 /gmM冷凍生蝦細菌數1353106107大腸菌群43534400金黃色葡萄球菌435310332103冷凍烹調副溶血性弧菌10250102蝦細菌數3351106107大腸菌群63514400金黃色葡萄球菌93511032103副溶血性弧

17、菌122501024）. 隨機 抽樣方案在現場抽樣時， 可利用隨機抽樣表進行隨機抽樣。 隨機抽樣表系用計算機隨 機編制而成，包括一萬個數字。其使用方法如下：先將一批產品的各單位產品（如箱、包、盒等）按順序編號。如將一批600 包的產品編為 1、2600。隨意在表上點出一個數。查看該數字所在的行和列。如點在第 48 行、第 10 列的數字上。根據單位產品編號的最大位數（如 A1，最大為三位數），查出所在行的 連續列數字（如 A2所點數為第 48行、第 10、11和 12列，其數字為 245），則 編號與該數相同的那一份單位產品，即為一件應抽取的樣品。繼續查下一行的相同連續列數字（如按 A3、即第

18、 49行的第 10、11和 12 列的數字，為 608）。該數字所代表的單位產品為另一件應抽取的樣品。依次按 A4所述方法查下去。當遇到所查數超過最大編號數量（如第50行的第 10、11 和 12 列的數字為 931、大于 600）則舍去此數，繼續查下一行相 同列數，直到完成應抽樣品件數為止。三、抽樣方法確定了抽樣方案以后， 抽樣方法對抽樣方案的有效執行和保證樣品的有效性 代表性至關重要。 抽樣必須遵循無菌操作程序， 抽樣工具如整套不銹鋼勺子、 鑷 子、剪刀等應當高壓滅菌，防止一切可能的外來污染。容器必需清潔、干燥、防 漏、廣口、滅菌，大小適合盛放檢樣。抽樣全過程中，應采取必要的措施防止食 品

19、中固有微生物的數量和生長能力發生變化。 確定檢驗批， 應注意產品的均質性 和來源，確保檢樣的代表性。常見的抽樣方法有：1直接食用的小包裝食品：盡可能取原包裝，直到檢驗前不要開封，以防污染。2統裝或大容器包裝的液體食品：（1）抽樣前搖動或用滅菌棒攪拌液體，盡量使其達到均質；（2）抽樣時應先將抽樣用具浸入液體內略加漂洗，然后再取所需量的樣 品，裝人滅菌盛樣容器的量， 不應超過其容量的四分之三， 以便于檢驗前將樣品 搖勻；（3）取完樣品后，應用消毒的溫度計插入液體內測量食品的溫度，并作 記錄。盡可能不用水銀溫度計測量，以防溫度計破碎后水銀污染食品；4）如為非冷藏易腐食品，應迅速將所抽樣品冷卻至0- 43統裝或大容器包裝的固體和固體食品：（1）每份樣品應用滅菌抽樣器由幾個不同部位采取，一起放入一個滅菌 容器內；（2）注意不要使樣品過度潮濕，以防食品中固有的細菌增殖。4統裝或大容器包裝的冷凍食品（1）對大塊冷凍食品，應從幾個不同部位用滅菌工具抽樣，使之有充分 的代表性。（2）在將樣品送達實驗室前，要始終保持樣品處于