1、第二章固液分離和細胞破碎第一節發酵液的預處理一、發酵液過濾特性的改變:培養液的組成：水 70-80% +固體細胞及碎片20-30%（對微生物發酵）+少量的代謝成物+細胞破裂后的內容物+殘存的培養基成分:微生物發酵液的特性為：發酵產物濃度較低，大多為1-10%，懸浮液中大部分是水；懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；固體粒子可壓縮性大；液相粘度大，大多為非牛頓型流體；性質不穩定，隨時間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。預處理的目的（1）改變發酵液的物理性質，促進從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液 分離器的效率；（2）盡可能使產物轉入便于后處理的某一相中（多數為液相）；

2、（3）除去發酵液中的部分雜質，以利于后續各步操作。:發酵液預處理的方法：A加熱法A調整pHA凝聚與絮凝A使用惰性助濾劑1.加熱法最簡單和價廉的預處理方法，即將懸浮液加熱到所需溫度并保溫適當時間?？捎行Ы档蛻腋∫旱酿ざ?，并加速聚集作用以去除某些雜蛋白；降低懸浮液的最終體積，調整pHpH值直接影響發酵液中某些物質的電離度和電荷性質，適當調節pH值可改善其過濾特性。在 膜過濾中，發酵液中的大分子物質易與膜發生吸附，通過調整pH值改變易吸附分子的電荷性 質，即可減少堵塞和污染；細胞、細胞碎片及某些膠體物質等在某個pH值下也可能趨于絮凝 而成為較大顆粒，有利于過濾的進行。凝聚與絮凝采用凝聚和絮凝技術能有

3、效改變細胞、細胞碎片及溶解大分子物質的分散狀態，使其聚結成較 大的顆粒，便于提高過濾速率。另外，還能有效地除去雜蛋白和固體雜質，提高濾液質量。凝聚一在投加的化學物質（如鋁、鐵的鹽類或石灰等）作用下，膠體脫穩并使粒子相互聚 集成1mm大小塊狀凝聚體的過程。絮凝一 在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用， 使膠體顆粒交聯成網，形成10mm大小絮凝團的過程。（1） 凝聚發酵液中的細胞、菌體或蛋白質等膠體粒子雙電層的結構使膠粒之間不易 聚集而保持穩定的分散狀態。陽離子對帶負電荷的膠粒凝聚能力的次序為：Al3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+常用的凝聚劑電解質有：硫酸鋁Al2（

4、SO4）318H2O（明磯）氯化鋁AlCl36H2O三氯化鐵FeCl3硫酸亞鐵FeSO4.7H2O石灰；ZnSO4； MgCO3（2）絮凝絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質量可高達數萬至一千萬以上，長鏈狀結 構，其鏈節上含有許多活性官能團，包括帶電荷的陰離子（如-COOH）或陽離子（如-NH2） 基團以及不帶電荷的非離子型基團。它們通過靜電引力、范德華引力或氫健的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。當一個高分子聚合物的許多鏈節分別吸附在不同的膠粒表面上，產生橋架聯結時，就形成了較 大的絮團，這就是絮凝作用。（3）混凝對于帶負電荷的菌體或蛋白質來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠

5、粒雙電層電位 和產生吸附橋架的雙重機理；對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機理才能提高過濾效果，這 種包括凝聚和絮凝機理的過程，稱為混凝。加入助濾劑一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。懸浮液中大量的細微膠體粒子被吸附 到助濾劑的表面上，改變了濾餅結構，降低了過濾阻力。常用的助濾劑有：硅藻土、纖維素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。使用硅藻土時，通常細粒用量為500 g/m3;中等粒度用量為700 g/m3;fi粒用量為700-1000 g/m3。加入反應劑加入反應劑和某些可溶性鹽類發生反應生成不溶性沉淀，如CaSO4, AlPO4等。生成的沉淀

6、能 防止菌絲體粘結，使菌絲具有塊狀結構，沉淀本身可作為助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固, 改善過濾性能。如發酵液中含有不溶性多糖物質，用酶將其轉化為單糖，以提高過濾速率；如萬古霉素用淀粉作培養基，發酵液過濾前加入0.025%的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5% 硅藻土助濾劑，可提高過濾效率5倍。二、發酵液的相對純化發酵液中的雜質高價無機離子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）雜蛋白在采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力，在有機溶劑法或雙水相萃取時，易產生乳化現象，使兩相分離不清。在常規過濾或膜過濾時，易使過濾介質堵塞或受污染，影響過濾效率。在預處理時，應盡量除去這些物質。（一）

7、高價無機離子的去除方法1）Ca2+ 草酸、草酸鈉，-形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸）；2）Mg2+三聚磷酸鈉，形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡合物；3）Fe3+黃血鹽（亞鐵氤化鉀），一普魯士蘭沉淀（二）雜蛋白的去除方法沉淀法蛋白質一般以膠體狀態存在于發酵液中。在酸性溶液中帶正電荷；在堿性溶液中帶負電荷。在某一 pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點。1）酸堿調節，使蛋白質與鹽或離子形成沉淀。在酸性溶液中，蛋白質與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，蛋白質與一些陽離子，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。變性法加熱，大

8、幅度調節pH值，加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。不足之處a.加熱法只適合于對熱較穩定的目的產物；極端pH值也會導致某些目的產物失活，且要消耗大量酸堿；。.有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數量較少的場合。吸附法加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質而除去。例如：在四環素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協同作用生成亞鐵氧化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附 蛋白質；在枯草桿菌發酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質、菌體及 其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。第二節液分離工程及設備第二節液分離工程及設備、固液分離的方法A重力沉降B浮選通氣，產生氣泡，使固體附著在氣泡表面除去。用于固液比

9、重差小、直徑530日m顆粒的分離，污水處理C旋液分離懸浮液以較高速度沿切線方向進入旋風分離器輕相由分離器中央排出，重相由分離器下部排出，但不適合直徑5 U m顆粒去除（可用絲網分離器）。介質過濾霉菌和放線菌為絲狀菌，體形較大，發酵液采用過濾方法；細菌和酵母菌為單細胞，體形較小，其發酵液采用高速離心分離，如對發酵液進行預處理，也可用 過濾進行固液分離。微生物發酵液中含有大量菌體、細胞或細胞碎片以及殘余的固體培養基成分。過濾就是將懸浮在發酵液中的固體顆粒與液體進行分離的過程。在過濾操作中，要求濾速快、濾液澄清，并且有高的收率。E,離心在液相非均一系統中，利用離心力達到液-液、液-固、液-液-固分離

10、的方法，統稱為離心分離。優點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好；缺點：設備投資高、能耗大。離心機種類：碟片式離心機、管式離心機、傾析式離心機。離心分離因數：又稱為離心力強度，表示在離心機中產生的離心加速度與自 由下降的加速度之比。3.其他固液分離方法1）切向流過濾,又稱錯流過濾 交叉過濾和十字流過濾，是一種維持恒壓下高速過濾的技術。其操作特點是使懸浮液在過濾介質表面作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質表面的固體（濾 餅）移走。2）雙水相萃取 向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成 密度不同的兩相，輕相中富含某種高分子化合物，重相中富含鹽類或另一種高分子化合

11、物，從而達 到分離和提純某種高分子化合物的目的。3）吸附法 向細胞碎片懸浮液中加入某種固體吸附劑，或者用細胞碎片懸浮液通過裝有吸附劑 的固定床，即可達到除去細胞碎片的目的。主要的問題是很難選擇合適的吸附劑，以保證目的產物 不被吸附而損失。第三節細胞破碎方法破碎率：被破碎細胞的數量占原始細胞數量的百分數。N0:原細胞數，N： 破碎后殘存的正常細胞。N0和N的可通過直接計數和間接計數法得到。3.2細胞破碎理論1）、細胞破碎Cb凍脹 D破壁破膜細胞破碎方法A壓撞 Cb凍脹 D破壁破膜細胞破碎方法3.3機械破碎法:細胞在機械作用下受到壓縮和剪切而破碎。細胞越小，所 需的壓縮和剪切力越大，越難破碎。高壓

12、勻漿機組織搗碎機超聲波法細菌磨珠磨法高壓勻漿破碎原理：主要利用細胞懸液在高壓作用下液相剪切力以及細 胞與固定表面的撞擊力而使之破碎。III特點：適用于酵母和大多數細菌細胞的破碎，不宜用于團狀或絲狀菌的 破碎；由于操作中溫度會 升高，需對料液作冷卻處理，保護目的產物 活性。III適合于工業上的大規模應用珠磨法破碎原理：利用在高速攪拌作用下，細胞和微球相 互磨擦碰撞而破碎。特點：適用范圍較廣；但有效能量利用率很低，設計操作時應充分考慮冷卻 系統的熱交換能力；影響破碎率的操作參數較多，過程優化設計較復雜。 珠磨機可用于酵母和細菌，但對真菌菌絲和藻類更合適.撞擊法破碎操作：細胞噴霧高速凍結300 m/

13、s氮氣流優點：A、細胞破碎僅發生在撞擊的一瞬間，破碎程度均勻，避免反復和過度破碎； 日、破碎的程度可無級調節，避免細胞內部結構的破壞，特別適合于細胞器的回收； C、實驗室和工業規模均可應用，細胞濃度在10-20%，實驗室規模的間歇處理能力在50-500 mL/h，工業規模的連續處理在10,000 mL/h以上。超聲波破碎超聲波破碎原理：超聲波作用下液體發生空穴化作用，產生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破 碎。優點：適合于多種細胞的破碎缺點：A、影響因素多，如振幅、黏度、表面張力、液體體積和流速、探頭材料和形狀B、 超聲產生超氧離子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、產熱大，需控溫；E、不易放大

14、， 僅應用于實驗室規模的細胞破碎。物理破碎法：主要通過各種物理因素使組織細胞破碎。反復凍融法于將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內冰 粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。冷熱變替法將材料投入沸水中，于90P左右維持數分鐘，立即置于冰浴中使 之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。滲透壓沖擊法細胞在高滲透壓介質中平衡后，再突然將其轉至低滲透壓環境中，水會 大量進入細胞，使細胞壁和膜脹破?；瘜W破碎法(3)化學破碎又稱化學滲透：其原理是利用化學或生化試劑(酶)改變細胞壁或 細胞膜結構，增大胞內物質的溶出速率；或者完全溶解細胞壁，形成原生質體后, 在滲透壓作用下使細胞膜

15、破裂而釋放胞內物質。優點：A、產品釋放的選擇性；日、提取速度和收效高；。、產品的破壞??；。、對外界環境，如pH和溫度等要求低；E、不殘留細胞碎片。有機溶媒法粉碎后的新鮮材料在02以下加入510倍量的丙酮，迅速攪拌均 勻，可破碎細胞膜，破壞蛋白質與脂質的結合。蛋白質一般不變性， 被脫脂和脫水成為干燥粉末。用少量乙醚洗，經濾紙干燥，如脫氫酶 等可保存數月不失去活性。自溶法將待破碎的鮮材料在一定pH和適當的溫度下，利用自身的蛋白酶將細胞破壞，使細胞內含物釋放出來。自體融解時需要時間，需加少量甲苯、氯仿等。應防止細菌污染。自體融解過程中pH顯著變化，隨時要調節pH。自溶溫度選在04,因自溶時間較長，不

16、易控制，所以制備活性蛋白質時較少用。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結晶化。1g菌 體加110mg溶菌酶，pH6.27.0 1h內完全溶菌。除溶菌酶外，蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細菌及植物細胞用。3.4物理法和化學法的比較物理破碎法缺點:冬高能、高溫、高噪音、高剪切力（四高），易使產品變性失活;B、非專一性，胞內產物均釋放，分離純化困難；C、細胞碎片大小不一，難分離?；瘜W破碎法缺點:A、費用高；日、引起新的污染，尤其是其他化學方法；C、一般只有有限的破碎，常需與其他物理法連用。3.5破碎方法的選擇選擇的一般原則A. 提取產物在細胞質內，用機械法破碎 日、提取產物在細胞膜附近，用化學法 。、提取產物與細胞膜和細胞壁結合，可采用化學法和機械法結合的方法破碎技術雜交研究應注意的問題入、雜交技術可產生很大優勢。日、破碎技