1、21、p73及PTEN在頭頸部多原發癌中的表達及意義【摘要】目的討論p21、p73與PTEN在頭頸部多原發癌組織中的表達與意義。方法采用免疫組織化學方法對30例頭頸部多原發癌患者的42份標本、42例頭頸部單發癌及30例來源于頭頸部的正常上皮組織標本中p21、p73與PTEN蛋白表達進展檢測，并將檢測結果作統計學分析。結果p21、p73與PTEN蛋白在頭頸部多原發癌組織中陽性表達率分別為69.05、57.14和71.43；在單原發癌組陽性表達率分別為76.19、40.48和76.19；在正常上皮組織中陽性表達率分別為96.66、13.33和100.00。在多原發癌及單發癌組織中p21與PTEN蛋

2、白失表達率以及p73蛋白過表達率均顯著高于正常上皮組織P0.05；三個指標在多原發癌與單發癌組織中的表達差異均無統計學意義。結論p21與PTEN蛋白失表達以及p73蛋白表達上調，參與頭頸部多原發癌和單發癌的形成機制，但還不能認為其在頭頸部多原發癌與單發癌形成中的作用有差異?！娟P鍵詞】多原發癌頭頸部腫瘤p21p73PTEN免疫組織化學Keyrds:ultiplepriaryaners;Headandnekneplass;p21;p73;PTEN;Iunhistheistry多原發癌是指機體同時或相繼發生兩個或兩個以上彼此無關系的癌腫。頭頸部多原發癌患者日趨增多，已成為影響頭頸部腫瘤患者5年生存率

3、重要因素之一。有研究說明，腫瘤的形成是一個多因素、多步驟的包含多個癌基因和抑癌基因參與的累積和協同的分子事件，原癌基因激活和抑癌基因失活及細胞內信號傳導紊亂被認為是腫瘤發生開展的基矗目前國內有關頭頸部多原發癌的研究還局限在對腫瘤的臨床和細胞病理學分析上，國外學者對頭頸部多原發癌發生開展的分子機制研究也主要集中在p53和ylinD等少數目的基因上，尚未能找到明確的公認的致病因素,而p21、p73及PTEN基因突變和/或表達異常與多種腫瘤的發生開展相關。我們搜集近年來30例頭頸部多原發癌患者的42份石臘標本，并設立頭頸部單發癌和正常上皮源性組織作為對照，采用免疫組織化學方法檢測p21、p73及PT

4、EN在頭頸部多原發癌的表達情況，旨在討論p21、p73及PTEN在頭頸部多原發癌發病中的作用，報告如下。1資料與方法1.1標本1.1.1實驗組搜集福建醫科大學第二臨床醫學院19922022年間，30例確診為頭頸部多原發癌患者的病理活檢、或手術切除的癌組織石蠟包埋標本30例，經挑選剔除腫瘤發生部位不在頭頸部的先證癌或第二癌組織標本，以及非上皮源性的腫瘤組織標本后，入選標本42份。發病部位：喉部11份，下咽4份，鼻咽2份，鼻竇5份，腭部2份，舌8份，頰部3份，甲狀腺2份，食管2份，腮腺、鼻背皮膚及鰓裂囊腫惡變各1份。42份標本中鱗狀細胞癌38份，腺癌4份。多原發癌的診斷采用arren與Gates推

5、薦的標準：1每種腫瘤須有組織學檢查確定為惡性；2每種腫瘤需有正常組織間隔；3排除一種腫瘤為另一種腫瘤的轉移灶。同時結合參考文獻1,癌的診斷包括不同組織病理類型或滿足以下條件：1兩種腫瘤都局限在原發部位；2腫瘤間無直接連接；3無遠處轉移；4異時癌假如缺乏具有決定性的組織病理學上差異，第二癌與先征癌必須有2?或2?以上的正常組織間隔，或發生在3年及3年以后。1.1.2對照組1搜集福建醫科大學第二臨床醫學院19972001年間確診的頭頸部單發癌癌組織石蠟包埋標本42例。入選條件為隨訪至少3年以上無腫瘤復發或患第二原發癌，并與實驗組的腫瘤病理類型、分化程度、發生部位及TN分期匹配；2隨機搜集20002

6、001年間福建醫科大學第二臨床醫學院確診的頭頸部良性上皮組織石蠟包埋標本30例。1.2主要試劑鼠抗人p21單克隆抗體工作液、鼠抗人p73單克隆抗體濃縮液、鼠抗人PTEN單克隆抗體濃縮液、即用型SP試劑盒及DAB顯色試劑盒。以上試劑均購自北京中杉金橋生物技術。1.3免疫組織化學檢測檢測步驟按SP試劑盒說明書進展。每一標本作4?厚切片4張，1張作HE染色，另3張分別行p21、p73及PTEN蛋白免疫組化染色。另選的陽性組織切片作陽性對照，PBS代替一抗作空白對照。陽性細胞染色為胞核或胞漿棕黃色著色。陽性細胞計數：先在低倍鏡下選取有代表性視野再在高倍鏡下計數，每例計數4個高倍視野至少200個細胞，計

7、算陽性細胞占總計數細胞的百分率。結果判斷：陽性細胞數5%為陰性-，陽性細胞數5為陽性。1.4統計學處理各組間表達率的差異采用2檢驗，0.05為差異有統計學意義，利用SPSS11.0統計軟件處理。2結果2.1p21在三種組織中的表達情況p21在頭頸部多原發癌和單發癌的癌組織以及正常上皮組織中的陽性表達定位于細胞核，呈黃色至棕黃色顆粒狀著色；陽性細胞呈巢狀或散在分布彩圖3。頭頸部多原發癌及單發癌的癌組織中p21陽性表達率明顯低于正常上皮組織，其差異有統計學意義，而多原發癌與單發癌間無統計學意義表1。多原發癌與單發癌；單發癌與正常上皮；多原發癌與正常上皮比擬2.2p73在三種組織中的表達情況p73在

8、頭頸部多原發癌和單發癌的癌組織及正常上皮組織中的陽性表達也定位于細胞核彩圖4。多原發癌及單發癌的癌組織中陽性p73表達率明顯高于正常上皮組織，其差異有統計學意義；而在多原發癌與單發癌間差異無統計學意義表2。陽性陰性陽性率2值P值多原發癌多原發癌與單發癌；單發癌與正常上皮；多原發癌與正常上皮比擬2.3PTEN的表達情況PTEN在頭頸部多原發癌和單發癌的癌組織及正常上皮組織中的陽性表達主要定位于細胞核，少數細胞定位于細胞質，呈黃色至棕黃色顆粒狀著色彩圖5。頭頸部多原發癌及單發癌的癌組織中PTEN陽性表達率明顯低于正常上皮組織，其差異有統計學意義；而在多原發癌與單發癌間差異無統計學意義表3。陽性陰性

9、陽性率2值P值多原發癌4230120.05單原發癌4232100.05正常上皮3030100.0010.2850.01多原發癌與單發癌；單發癌與上皮組織；多原發癌與上皮組織比擬3討論3.1p21、p73及PTEN的構造和生物學功能p21基因是1993年發現的一種腫瘤抑制基因，定位于6p21.2，編碼一個由164個氨基酸組成蛋白質，體外翻譯產物為21KD。正常細胞中，P21蛋白與細胞周期蛋白依賴激酶ylindependentkinase，DK、細胞周期蛋白ylin及增殖細胞核抗原prliferatingellnulearantigen，PNA以四聚體形式存在。低濃度的P21蛋白作為DK的聚集因子

10、，正性調節DK功能而推動細胞周期進程，促進G1期向S期轉化，但高程度表達的P21蛋白與ylin競爭性地與DK結合而抑制該激酶活性，使細胞周期停滯于G1期而不進人S期，從而抑制細胞增殖或誘導細胞凋亡。國內外文獻對p21在多種頭頸部腫瘤細胞中表達情況均有報道，王敏等2實驗結果顯示p21在不同類型鼻咽癌中有不同程度的表達下調或不表達，隨著鼻咽癌分化程度的下降,p21愈傾向于弱表達或不表達。Jeannn等3研究說明，p21在喉癌組織中陽性表達率增高，那么患者的5年生存率下降，認為p21的陽性表達率可作為判斷喉癌患者預后指標之一。以上研究顯示p21失表達或低表達與頭頸部多種腫瘤的發生開展相關。p73基因

11、是1997年發現的p53家族新成員，定位于1p36.3,編碼產物是相對分子量為73?KD的P73蛋白。Fnteaggi等4的研究分析了p73和p53激活后H1299細胞的基因表達,結果顯示P73和P53蛋白激活共同的和不同的基因，證實P73和P53蛋白在靶基因結合方面具有同源性，但二者的功能具有很大的差異。p73和p53之間可能存在某種互相作用，野生型P53表達程度下降，p73表達程度增高。p73基因在腫瘤細胞中很少突變，在正常組織是單等位基因表達5，而在多數腫瘤細胞如胃癌、膀胱癌呈雙等位基因表達，蛋白表達較正常組織顯著增高6，7。p73從其能誘導細胞周期阻滯和凋亡的功能來看，具有一定的抑制腫

12、瘤功能，但其在腫瘤中的表達狀態又不支持其“抑癌基因的作用。p73確實切功能還有待于進一步研究。3.2p21、p73及PTEN在頭頸部多原發癌、單發癌及正常上皮組織中的表達由于腫瘤診療技術的進步，頭頸部惡性腫瘤患者5年及遠期存活率的延長，其患第二原發癌的機率逐年增高。隨著分子生物學技術的不斷開展，近階段人們試圖從基因和蛋白程度來解釋多原發癌的發病機制。早在1953年Slaughter從組織病理學角度研究口腔腫瘤時提出了“區段性癌化fieldanerizatin理論，內容包括：(1)口腔腫瘤由多個癌前病變的病灶開展而來；2異常組織包繞腫瘤；3口腔腫瘤由多個互相獨立的病損灶組成并常常又互相交融；4手

13、術后持續存在的異常組織可解釋多原發癌及部分復發的成因。其本質即是多原發癌的多中心、多克隆起源學術。近年來已有學者應用分子生物學技術分析腫瘤相鄰的“正常組織和手術切緣組織以證明區段性病變的存在。Tabr等研究頭頸部腫瘤周圍肉眼“正常及手術切緣黏膜中p16、p53等多種抑癌基因雜合性缺失情況，38的病例顯示陽性結果，并在術后隨訪中觀察到手術切緣存在雜合性缺失的患者有腫瘤再發的情況，且再發腫瘤的表現出不同的生物學行為，因此認為在頭頸部腫瘤中存在“區段性癌化現象，并與多原發癌的發生有關14。Hann等15運用免疫組化方法分析105例頭頸部腫瘤患者的腫瘤組織及瘤旁上皮p53表達情況，結果顯示46.7%的

14、瘤旁上皮細胞存在p53高表達，第二癌的發生與瘤旁上皮細胞p53的過表達高度相關，認為至少部分第二癌的發生是因為黏膜的基因事件，即“區段性癌化的結果。近年來多原發腫瘤的單克隆起源學說被提出。alifan等16認為，惡性腫瘤及癌前病變周圍黏膜所檢測到的組織病理學異常與腫瘤細胞起源于同一克隆系，是區域性浸潤的結果；隨后的基因突變事件引起細胞表型改變和細胞分化，從而導致這一解剖區域細胞的多亞克隆性，其中某一惡性轉化細胞因其無限增殖的特性而開展成為腫瘤。在其它亞克隆株細胞上進一步的系列基因突變，那么導致多原發癌的發生。Tabr等對10例口腔、咽部多原發鱗狀細胞癌的先證癌和第二癌的癌細胞以及癌旁黏膜細胞行

15、檢測p53突變情況，對結果進展比照分析，認為大部分患者的先證癌和第二癌由同一癌前病變開展而來，起源于單一克隆細胞株；另有一部分患者的先證癌和第二癌那么起源于互相獨立的細胞克隆17。頭頸部多原癌發生開展的分子機制研究雖已獲得了一些成果，但還未形成公認的理論。本研究檢測p21、p73及PTEN在頭頸部多原發癌組織中的表達情況，并設立頭頸部單發癌和正常上皮組織作為對照。類似的研究說明，ylinD在上消化道多原發癌組織中的表達率高于單發癌，差異有統計學意義；p53的過表達率也有增高趨勢，但差異無統計學意義18。本研究結果顯示，在正常上皮組織p21和PTEN為高表達，p73為低表達。與正常上皮組織相比，多原發癌組和單發癌組均見有一定比例的p21、PTEN蛋白失表達和p73蛋白的過表達。以P0.05為差異顯著性界限，經統計學檢驗p21、p73和PTEN的陽性表達率在多原發癌組與正常上皮組、單發癌組與正常上皮組間差異均具有顯著性，而在多原發癌組與單發癌組間差異均無顯著性。這一結果顯示p21、PTEN的失表達以及p73的過表達在頭頸部腫瘤組織中是一些頻發事件，參與頭頸部腫瘤的形成機制。然而與單原發癌組相比，雖然多原發癌組p21、PTEN的失表達率以及p73的過表達率更高一些，三個指標同時顯示