1、新一代基因測序技術原理及其在醫(yī)學中應用新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第1頁 新一代基因測序技術(Next Generation Sequencing Technologies)是一系列在后問世新DNA測序技術。這些新技術使用不一樣以往化學測序法，依靠高度并行基因序列讀取方式，取得了令人難以置信DNA測序高通量。新一代基因測序技術能在數(shù)天內完成第一代基因測序技術花費1O年完成人類基因組測序。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第2頁 自問世起，不停發(fā)展新一代基因測序技術（NGS）在生物醫(yī)學領域引發(fā)了許多突破性發(fā)覺，推進了基因組學革命，促進新學科創(chuàng)建，如個人基因組學，細菌基因組流行病學

2、。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第3頁 基因測序技術起源與發(fā)展 新一代基因測序技術平臺介紹 新一代基因測序技術臨床應用 腫瘤分子診療領域 腫瘤研究領域 遺傳病篩查領域 傳染病研究領域 細菌基因組流行病領域新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第4頁基因測序技術起源與發(fā)展20世紀70年代早期，分別在幾個獨立試驗室，以不一樣方法實現(xiàn)了基因測序 直到1977年，可靠基因測序方法Sanger測序法和MaxamGilbert測序法才問世 Sanger測序法因為其試劑高效低毒，因而得到不停改進，深入發(fā)展成依靠染色自動化分析基因測序法 ，完成了第一個人類基因組序列圖譜。該基因組序列圖譜不但能夠幫助

3、快速識別單個基因，而且為探索研究人類基因組主要區(qū)域提供了便利 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第5頁Sanger測序法不足對常規(guī)DNA測序來說太昂貴，太耗時。伴隨各種動植物基因組數(shù)據(jù)大量產(chǎn)生，科學家開始專注于基因個體多樣性，并嘗試用新方法來描述個體基因組 因為成本和測序數(shù)據(jù)輸出量限制，用Sanger測序法獲取不一樣個體基因組進行大規(guī)模對比研究是不可行 從起，一系列新DNA測序技術，名為“新一代基因測序技術”， 不停得到開發(fā)，在生物醫(yī)學領域引發(fā)了許多突破性發(fā)覺，并徹底改變了基因組測序領域發(fā)展 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第6頁自動化Sanger方法被認為是“第一代”基因測序技術

4、“新一代基因測序技術” (Next Generation Sequencing Technologies，NGS) 相對Sanger法，新一代基因測序技術主要優(yōu)點是能夠快速，低價地提供巨量基因序列數(shù)據(jù)。它們每次測序運行能讀取堿基數(shù)高達百億。 能夠代替生物晶片去對基因定性、定量分析。 能夠快速測序全基因組，大規(guī)模對比研究不一樣個體基因組成為可能；新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第7頁起開始面世一系列新DNA測序技術有統(tǒng)一名稱 “新一代基因測序技術”。實際上各種新一代基因測序技術化學測序方法有著顯著不一樣，不過有3個共同特征 ：1. 新一代基因測序技術都能夠同時處理以百萬計基因序列讀取，這也

5、是它們能高通量地測序基因原因。 2. 新一代基因測序技術經(jīng)過PCR擴增創(chuàng)建它們基因序列讀取片段庫，勞動強度大大低于傳統(tǒng)使用載體克隆Sanger測序。 3. 與自動化Sanger測序技術相比，新一代基因測序技術所產(chǎn)生讀長都比較短(35700堿基)。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第8頁NGS技術平臺介紹 Roche(454)GS FLX基因測序技術 首先對目標DNA酶切短鏈進行油包水PCR擴增，然后以擴增DNA酶切短鏈為模版來合成新DNA。當對應三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)被加入到新合成DNA鏈上時，添加熒光素酶能產(chǎn)生光。依據(jù)閃光次序以及對應加入dNTP，測序儀所攜帶軟件就能夠創(chuàng)建目標D

6、NA模板詳細序列信息。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第9頁Sanger法是依據(jù)核苷酸在某一固定點開始，隨機在某一個特定堿基處終止，而且在每個堿基后面進行熒光標識，產(chǎn)生以A、T、C、G結束四組不一樣長度一系列核苷酸，然后在尿素變性PAGE膠上電泳進行檢測，從而取得可見DNA堿基序列。新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第10頁諾貝爾獎得主Frederick Sanger和Walter Gilbert 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第11頁新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第12頁新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第13頁IlluminaGenome Analyzer測

7、序技術 對目標DNA酶切短鏈進行擴增是經(jīng)過橋式PCR來完成。經(jīng)過PCR擴增后，芯片上目標DNA片段簇被用來做為模版來合成新DNA鏈，四個差異化標識熒光dNTP為每個目標DNA片段簇復制提供原料。一旦單個dNTP被加入新合成DNA末端，此dNTP差異化標識熒光就會被讀取并統(tǒng)計，由此實現(xiàn)邊合成邊測序。當DNA延伸步驟完成，測序儀所攜帶電腦軟件程序就會分析每個目標DNA簇序列，并完成各個短鏈序列對齊，以及目標基因組組合 。新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第14頁新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第15頁 近年來，Illumina企業(yè)在基因測序儀行業(yè)一直占據(jù)主導地位，其產(chǎn)品占據(jù)60市場份額。

8、推出IlluminaGA測序儀，HiSeq2000,就是一個標準高通量大規(guī)模平行基因測序典范。HiSeq2000一次測序耗時為10天，能完成600億個堿基正確測序，試劑成本僅為24 000美元。Illumina企業(yè)在年推出測序儀，MiSeq，針對較小試驗室和臨床診療市場，其數(shù)據(jù)輸出量小于推出HiSeq200。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第16頁Biosystems SOLID 基因測序儀 該測序技術采取了獨特以四色熒光標識寡核苷酸連續(xù)連接反應為基礎測序方法。詳細操作也是開始于油包水PCR擴增連接在微珠上目標DNA酶切短鏈。擴增后，用共價鍵把微珠及其擴增目標DNA短鏈連接到芯片表面，

9、然后放置到SOLID基因測序儀緩沖液測試槽內進行DNA測序。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第17頁新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第18頁Pacific BioSciences企業(yè)PacBio RS測序儀 采取熒光素標識dNTPs進行單分子實時測序，又稱為SMRT技術(single molecule，real-time)，所以該企業(yè)PacBio RS為第3代DNA測序儀。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第19頁SMRT技術將DNA聚合酶固化在每個稱為ZMW 小池里，僅照射ZMW 底部30 nm區(qū)域，實時檢測熒光素標識4種核苷酸摻入。利用其專有SMRT 芯片(SMRT c

10、el1)，內含約75 000個ZMW，所以能夠同時對近75 000個單分子進行平行測序。不一樣于傳統(tǒng)方法將熒光素標識在核苷酸堿基上，SMRT技術核苷酸標識在磷酸鏈上，防止了染料基團干擾DNA聚合酶活性；一個核苷酸摻入后，DNA聚合酶切斷磷酸鏈，釋放出染料分子，降低了干擾信號。這些技術確保了PacBio RS能夠進行單分子實時測序，讀長在1 000 bp以上，反應時間從30 min到1 d。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第20頁新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第21頁Life Technologies企業(yè)Ion Torrent PGM 測序平臺 自然條件下，DNA聚合酶將1個核苷

11、酸摻入DNA鏈中，就會釋放1個H+ ，該 H+ 所帶電荷改變了溶液pH值，可供離子探頭檢測分析。 Ion Torrent測序又被標榜為第4代測序技術。 無需熒光物質標識和使用高清楚度攝像頭，測序成本大幅降低，能在23 h內完成。 模板讀長較短是其缺點。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第22頁新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第23頁自以來，使用新一代測序儀臨床試驗數(shù)量有大幅度增加。有全基因組測序，也有全外顯子組測序，還有RNA測序和定向測序（targeted sequencing）。不論采取哪種測序方式，全部這些臨床試驗都是為了發(fā)覺致病遺傳異常，而且依據(jù)這些異常信息來指導臨床診療工

12、作。與此同時，這些信息也有利于生物制藥企業(yè)開發(fā)出更多靶向治療藥品，也能夠幫助了解一些藥品產(chǎn)生耐藥性原因。 新一代基因測序技術臨床應用 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第24頁新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第25頁 腫瘤分子診療領域 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第26頁BRCA是Breast Cancer Susceptibility Gene縮寫。BRCA基因變異最早被發(fā)覺與女性乳腺癌和卵巢癌發(fā)病有親密關系。BRCA1和BRCA2屬于抑癌基因，叫乳腺/卵巢腫瘤易感基因。正常細胞中，BRCA1和BRCA2能夠幫助DNA損傷修復和維護DNA完整，預防癌細胞產(chǎn)生。假如 BRC

13、A1/2產(chǎn)生基因變異，失去了這一保護，細胞產(chǎn)生癌變幾率大大增加。而BRCA2基因變異與男性乳腺癌，胰腺癌和前列腺癌有親密關系。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第27頁38歲美國女星Angelina Jolie在紐約時報上發(fā)表了我醫(yī)療選擇一文，稱因為自己攜帶有變異 BRCA1基因，醫(yī)生預計她患上乳腺癌風險高達87%，患上卵巢癌風險高達50%，她母親在56歲時死于癌癥。朱莉說切除術后，她患上乳腺癌風險已降至5%。未來有與安吉麗娜朱莉一樣擔憂女性就能夠借助 NGS技術進行BRCA檢測，提早采取相關辦法。新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第28頁遺傳病篩查領域 新一代測序技術對于新生兒孟德

14、爾式遺傳病篩查項目也很有幫助。臨床醫(yī)生們通常都會依據(jù)表型與基因型關系進行單基因遺傳檢測，以此來明確診療。不過孟德爾式遺傳病也能夠以非常復雜形式存在，同一個表型可能是由多個基因來決定，其中就有可能存在當前還未被發(fā)覺基因。在這種情況下單基因檢測就顯得無能為力了，新一代測序技術處理起這種問題來卻毫不費勁，能夠以極快速度完成這一切。新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第29頁腫瘤研究領域中應用全基因組測序 Parsons等利用新一代基因測序技術對22例多形性膠質母細胞進行測序新發(fā)覺大部分年輕膠質瘤病人和復發(fā)膠質瘤病人在IDH1位點上均頻發(fā)突變。 Lin等用大規(guī)模平行測序法檢測多形性膠質母細胞瘤和正常

15、腦組織基因，在多形性膠質母細胞瘤中篩選出4535個基因表示異常。 Lee等利用新一代基因測序技術對原發(fā)性肺癌和和相鄰正常組織完整序列進行比較發(fā)覺超出5萬個“點突變”，其中530個得到確認：深入觀察發(fā)覺激酶基因發(fā)生氨基酸突變概率較高。新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第30頁全基因組小分子RNA(miRNA)分析 傳統(tǒng)芯片技術在檢測miRNA時面臨序列短、高度同源等難題，而新一代基因測序技術利用miRNA序列短及其本身高通量優(yōu)勢，能發(fā)覺更多miRNA。 Schulte等利用SOLID新一代基因測序技術對良性和惡性神經(jīng)母細胞瘤中miRNA表示進行測序，經(jīng)過聚類分析提醒：二者miRNA表示差異顯

16、著，二者miRNA轉錄組也有顯著差異。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第31頁腫瘤全轉錄組分析 轉錄水平是調控腫瘤細胞增殖主要方法。在腫瘤發(fā)生和轉移中發(fā)揮主要作用。而利用新一代測序技術能高通量地判定腫瘤細胞中轉錄組改變，為腫瘤研究提供主要信息。 An等利用SOLID新一代基因測序技術對正常眼葡萄膜黑色素細胞和眼葡萄膜黑色素瘤細胞中全轉錄組進行檢測，經(jīng)過選擇性對5155個已注釋參加細胞通路、周期、凋亡和細胞黏附連接基因進行詳細分析判定出21個基因在正常眼葡萄膜黑色素細胞和眼葡萄膜黑色素瘤細胞中表示有差異這21個基因可能參加眼葡萄膜黑色素瘤發(fā)生。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第32頁基因甲基化檢測 基因甲基化已經(jīng)成為腫瘤分子生物學研究熱點之一，利用改良甲基化特異數(shù)字化核型分析法能敏感測出全基因組DNA甲基化位點，且含有高通量、低成本優(yōu)勢。 新一代基因測序技術原理及在醫(yī)學中的應用第33頁新一代基因測序技術在腫瘤研究中發(fā)展前景 新一代基因測序技術在腫瘤研究中處于起始階段，基本上局限于腫瘤分子生物學方面研究，經(jīng)過高通量大規(guī)模檢測腫瘤細胞中基因組及RNA水平改變來