1、高表達(dá)Np73基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞生物學(xué)舉動的影響及其機(jī)制研究固然比年來對大腸癌治療的研究已經(jīng)獲得了很大希望，但始終不克不及改變其發(fā)病率和殞命率高的特點(diǎn)，對患者預(yù)后亦無顯著改進(jìn)。因此，本研究探究np73基因的高表達(dá)對大腸癌細(xì)胞生物學(xué)舉動的影響，為臨床防治大腸癌提供較可靠的理論根據(jù)。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1實行質(zhì)料1.3臺盼蘭活細(xì)胞記數(shù)測定細(xì)胞的增殖本領(lǐng)與細(xì)胞活力胰酶消化勞績細(xì)胞含懸浮及貼壁細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，以冷pbs懸浮，細(xì)胞濃度為1105/l。取9滴細(xì)胞懸液移入小試管內(nèi)，加1滴0.4%臺盼蘭事情液，混勻，在3in內(nèi)用血球記數(shù)板別離記數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。1.4細(xì)胞增殖曲線tt測定取對數(shù)生恒久細(xì)胞懸液20

2、0l/孔含2103個細(xì)胞接種至96孔板，于37、5%2、飽和濕度造就箱，每組天天取3個復(fù)孔，每孔參加20ltt5g/l造就4h后棄造就液，每孔參加二甲基亞砜(ds)200l，振蕩10in溶解結(jié)晶紫。酶聯(lián)免疫檢測儀測定490n波長各孔光汲取值a490值。1.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡1.6byden小室體外侵襲實行用改進(jìn)的byden小室法1：用人工基質(zhì)覆蓋illiellhaber濾膜上的微孔，向小室內(nèi)參加1105/l的細(xì)胞懸液,造就12h后取出濾膜,將下室面的細(xì)胞刮下，將膜結(jié)實，結(jié)晶紫染色細(xì)胞，高倍鏡下隨機(jī)取5個視野,計數(shù)細(xì)胞,取均勻值。1.8統(tǒng)計學(xué)要領(lǐng)數(shù)據(jù)效果以s表現(xiàn),接納t查驗,spss10.

3、0統(tǒng)計學(xué)軟件舉行闡發(fā)。2效果2.1臺盼蘭拒染實行2.2tt法測定細(xì)胞生長曲線tt效果表現(xiàn)，轉(zhuǎn)染np73的lv細(xì)胞較轉(zhuǎn)染空載體pdna3的lv細(xì)胞組和空缺比較組細(xì)胞生長顯著增快，差異有統(tǒng)計學(xué)意義p0.01，見圖1。圖1tt法測定細(xì)胞生長曲線2.3基因轉(zhuǎn)染對大腸癌細(xì)胞凋亡率的影響圖2np73轉(zhuǎn)染對lv細(xì)胞凋亡的影響2.4byden小室體外侵襲實行3討論研究表白np73由于n末了轉(zhuǎn)錄活化區(qū)缺失導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活化成效完全喪失,對p53和全長型p73的轉(zhuǎn)錄活化和促凋亡活性有顯著的負(fù)調(diào)治作用2,3,np73除與大腸癌的產(chǎn)生、生長干系嚴(yán)密外，對神經(jīng)母細(xì)胞瘤也是一個預(yù)示較差預(yù)后的分子標(biāo)記4。但在某些腫瘤中，如甲狀腺

4、腫瘤，np73卻有著按捺增殖的作用5,6。由于np73基因在差異的腫瘤中對細(xì)胞凋亡和血管天生的影響差異，因此本實行以np73基因在對大腸癌細(xì)胞的生長、凋亡率、體外侵襲性以及對血管調(diào)治因子的表達(dá)調(diào)治作為重要切入點(diǎn)舉行了研究。本實行接納臺盼蘭拒染、tt測定對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的體外生長環(huán)境舉行了闡發(fā)。臺盼蘭拒染、tt測定均可反響細(xì)胞的增殖環(huán)境，但作用的機(jī)制與側(cè)重點(diǎn)差異。臺盼蘭是一種有機(jī)染料，當(dāng)細(xì)胞損傷或殞命時，可透過細(xì)胞膜與崩潰的dna結(jié)合，使其著色，而活細(xì)胞制止其進(jìn)入，借此可區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。本實行用該要領(lǐng)測定細(xì)胞的總數(shù)與存活率。tt是一種淡黃色的化合物，它到場活細(xì)胞線粒體的能量代謝。在活細(xì)胞線粒體內(nèi)

5、的琥珀酸脫氫酶可將tt復(fù)原成難溶性的紫蘭色結(jié)晶物frazan并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此成效。在必然的細(xì)胞范疇內(nèi)，tt結(jié)晶物形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。ds能溶解細(xì)胞中藍(lán)紫色的結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490n波優(yōu)點(diǎn)測定其光汲取值，可以間接反響活細(xì)胞數(shù)目。我們以為，臺盼蘭拒染實行操縱簡樸，便利快捷，但效果受報酬因素影響較多。tt法較客不雅正確，是一種較好的斷定細(xì)胞增殖的指標(biāo)，而byden小室體外侵襲實行，那么為檢測大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染np73基因后的侵襲力改變提供了直接證據(jù)。本實行將3種實行要領(lǐng)的效果相結(jié)合闡發(fā)更具正確性和說服力。進(jìn)一步流式細(xì)胞闡發(fā)提示np73基因轉(zhuǎn)染lv后細(xì)胞凋亡比例顯著淘汰。這一效果提示np73基因過表達(dá)可以促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的惡性增殖，其大概的機(jī)制是np73的過表達(dá)通過影響p73的反式激活而導(dǎo)致其啟動子活性的削弱,按捺p73誘導(dǎo)的凋亡2。綜上所述，np73以高表達(dá)的方法到場大腸癌的產(chǎn)生生長，按捺大腸癌細(xì)胞凋亡，上調(diào)血管天生因子vegf的表達(dá)，促進(jìn)了大腸癌血管增生，加強(qiáng)了大腸癌細(xì)胞的侵襲性。鑒于np73基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞的這些影響,我們以為，對np73舉行檢測，有利于從基因程度相識大腸癌的產(chǎn)生氣