1、第七章化學物質與酶相互作用第1頁自然界中發覺酶已達3000各種，而且這個數目伴隨基因工程和蛋白質工程方面研究發展而大大增加。酶能夠直接作為藥品用于醫藥工業，如溶菌酶可治療各類炎癥，如咽喉炎、口腔潰瘍、慢性鼻炎、帶狀疤疹及各種刀傷引發發炎等，天冬酞胺酶治療癌癥，治療血栓尿激酶等。酶也廣泛應用于食品工業、化學工業、醫藥工業、環境保護工業等，在臨床檢驗、生物分析等領域也廣泛使用。第2頁另外，每種酶都有一定抑制劑，這類抑制劑能夠參加生物代謝過程化學調控，所以有些酶抑制劑可能屬于毒物，而有些抑制劑能夠作為藥品使用。酶抑制劑作為新藥尋找與開發，在近一、二十年來分子生物學發展基礎上得以實用化。化學物質（無機

2、物質、有機物質和高分子物質）與酶相互作用包含化學物質對酶激活作用、抑制作用、改性作用和酶對化學物質催化作用等。第3頁第一節 化學物質對酶抑制作用凡能降低酶促反應速度作用，稱為酶抑制作用。能使酶活性受抑制物質，稱為酶抑制劑。近年來對酶抑制作用研究進展快速。因為經過酶抑制作用研究，不但對了解酶專性，酶活性部位物理和化學結構，酶動力學性質以及酶作用機制等；而且對了解藥品和毒物作用于機體方式及機理等也有主要意義；對代謝路徑中酶調整也能提供信息。抑制劑之所以能抑制酶促反應，主要是因為它們能使酶必需基因或活性部位性質和結構發生改變，從而造成酶活性降低或喪失。按抑制劑作用方式不一樣，酶抑制作用可分為可逆和不

3、可逆兩種類型。 第4頁一、可逆抑制作用按可逆抑制劑對酶底結合影響不一樣，可分為許多類型，它們反應歷程可用一通式表示： 第5頁速度方程通式依據此反應歷程,依據快速平衡學說或恒態學說推導，得到其總速度方程通式以下在不一樣抑制作用中，僅在于Ki和Ki兩個數值不一樣，普通可分為4種類型：即競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合性抑制。 將該方程作雙倒數處理，可得第6頁1，競爭性抑制作用競爭性抑制作用中I只與自由酶結合，因而阻止S與酶結合。而S又不能與EI結合，I也不能與ES結合，所以EIS不存在；EI亦不能分解成產物。 第7頁個競爭性抑制劑只增加酶底結合表現Km(Kmapp)，即I濃度增加，Km

4、app就增加；而Vmax則保持不變。在競爭性抑制劑存在下, 要到達最大反應速度Vmax，必須加入更高底物濃度。如S100Km時，Vmaxi可達Vmax。競爭性抑制劑對酶促反應抑制程度，決定于I，S，Km和Ki大小。I一定，增加S, 降低抑制程度；S一定，增加I，增加抑制程度，Ki值較低時，任何給定I和S，抑制程度都較大；Km值越低，在一定S、I下，抑制程度越小。 第8頁競爭性抑制作用雙倒數圖 第9頁競爭性抑制作用Ki求解 從雙倒數圖計算出表觀米氏常數Kmapp，然后代入Kmapp=Km(1+I/Ki)可計算出Ki。從雙倒數圖求得各I濃度下Kmapp值對對應I再作圖，從再制圖縱截距可直接測得Km

5、，從其橫截距可直接測得Ki。從不一樣固定I下所作一簇直線斜率1/S對對應I再制圖，其縱截距為Km/Vmax, 斜率為Km/VmaxKi，橫截距即為-Ki。 第10頁Dixon作圖法求Ki 第11頁競爭性抑制劑IC50值 取決于試驗所用酶和底物濃度，當酶濃度固定時，IC50值與Ki、Km和底物濃度S呈以下關系：依據該方程式，當底物濃度大于Km值時，IC50值高于Ki值，尤其當底物濃度較高時，Ki值偏低愈加顯著。 第12頁第13頁競爭性抑制劑結構特征 底物類似物因為人們對一個酶所催化底物性質了解比較多，所以，經常利用酶底物類似物作為競爭性抑制劑研究一些三維結構不清楚酶活性中心結構。另外，也能夠依據

6、底物結構特點設計一些臨床上使用藥品。 第14頁比如， -葡糖苷酶抑制劑如阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖（voglibose）和米格列醇（Miglitol）第15頁黃嘌呤氧化酶催化次黃嘌呤氧化成黃嘌呤，進而被氧化成尿酸，黃嘌呤氧化酶抑制劑-別嘌呤醇治療痛風病就是經過抑制黃嘌呤氧化酶，降低尿酸生物合成。 第16頁過渡態類似物酶催化化學反應效率高原因在于酶能與高能態過渡態相結合，從而大大降低了化學反應活化能。假如對催化某一特定生物化學反應酶三維結構尚不清楚，能夠依據其生化反應過程，設計合成含有特定結構、疏水性匹配、電子和空間原因與過渡態類似穩定化合物，作為該酶特異抑制劑，這無疑為藥品合理分

7、子設計提供了另一強有力伎倆。 第17頁比如，乙酰膽堿酯酶(AChE)羥基與酯酶酯解部位形成共價鍵，其四價氮上強正電荷與酯酶陰離子部位呈靜電聯接。酶乙酰化很快造成酯鍵斷裂和膽堿消除，乙酰化酶隨即與水反應而使酶再生并放出乙酸。氨基甲酸酯殺蟲劑是乙酰膽堿酯酶水解過渡態穩定類似物，能與乙酰膽堿酯酶結合部位緊密結合而抑制乙酰膽堿酯酶。 第18頁又如苯甲酰丙氨醛是胰凝乳蛋白酶過渡態抑制劑，其結構類似底物苯甲酰苯丙氨酰化合物與酶形成共價中間物中底物酰基部分，比底物中肽鍵羰基更易受到酶活性中心羥基親核進攻，但不能形成酰化酶共價中間物。 第19頁其它化合物 有些化合物平面結構與底物并不相同，但立體構象十分相近，

8、也能夠成為競爭性抑制劑。非甾體抗炎藥是一類含有不一樣結構類型化合物，因為選擇性地抑制環氧合酶活性，用作抗炎止痛藥。環氧合酶抑制劑消炎痛和底物花生四烯酸三維結構，整個分子立體構象中，羧基和雙鍵配置有某種相同性，因而競爭性地與環氧合酶結合。第20頁塞來克西(Celebrex)作為環氧合酶（COX2，炎癥細胞產生酶）特異性抑制劑，難以進入開口較小COX1活性中心通道，故而不能對其產生抑制作用，但仍能進入口徑稍大，后段略有柔性COX2通道，而能對COX2產生抑制作用。第21頁一些競爭性抑制劑化學結構與底物結構沒有任何關系，其抑制作用原理是抑制劑與一些酶活性中心金屬離子絡合，妨礙了底物進入，從而起到抑制

9、酶活性目標。比如5-脂氧合酶(LOX)活性中心含有一個非血紅素鐵原子，經過Fe2+與Fe3+循環實現其催化功效。該酶一些抑制劑（CGS-23885,A-76745）就是經過鐵螯合而與底物競爭性地與酶活性中心結合。 第22頁2，非競爭性抑制作用 經典非競爭性抑制劑不影響酶-底物結合；底物也不影響酶-I結合；S和I都可可逆獨立地結合于酶不一樣部位上；而且ESI為端點復合物。 第23頁非競爭性抑制作用雙倒數方程第24頁非競爭性抑制作用Ki 求解 從I0和I為某一固定濃度所作1/對1/S雙倒數圖縱截距可直接測得1/Vmax和(1/Vmax)(1+I/Ki)，從而計算出Ki。從不一樣固定I所作雙倒數圖斜

10、率1/S對I再制圖可求得Ki。從不一樣固定I所作雙曲數圖縱截距對I再制圖，從其橫截距可直接到得Ki。 第25頁Dixon作圖法求Ki 第26頁非競爭性抑制劑IC50值 非競爭性抑制劑IC50值與底物濃度關系以下：依據該式，當底物濃度較高時，IC50值靠近于Ki值；當底物濃度較低時，IC50值顯著低于Ki值。 第27頁非競爭性抑制劑結構特征 因為非競爭性抑制劑并非結合于酶活性中心底物結合位點，而是活性中心附近一些區域或基團，不影響酶與底物親和力。而非競爭性抑制劑作用部位不是十分清楚，所以，不能依據酶底物及酶活性中心結構設計非競爭性抑制劑。當前所發覺一些酶非競爭性抑制劑大多數都是隨機篩選得到化合物

11、。 第28頁比如，染料木素（genistein）對于-葡萄糖苷酶抑制作用就是非競爭性抑制作用。他克林(tacrine)是治療老年癡呆癥乙酰膽堿酯酶非競爭性抑制劑。 第29頁 3，反競爭性抑制作用反競爭性抑制劑I不能與自由酶結合，而只能與ES可逆結合生成不能分解成產物EIS。這一點與競爭性抑制相反，Ki值為，EIS只能解離成ES + I，而不能解離成EI + S。 第30頁反競爭性抑制程度取決于I、S、Ki和Km等。它抑制程度隨底物濃度增加而增加。反競爭性抑制劑使酶Km值降低，即KmappKm。從這點看，反競爭性抑制劑不是一個抑制劑，而像是一個激活劑。它之所以造成對酶促反應抑制作用，完全是因為它

12、使Vmax降低而引發。所以假如S很小，反應主要為一級反應，則抑制劑對Vmax影響幾乎完全被對Km相反影響所抵消。這時幾乎看不到抑制作用。 第31頁反競爭性抑制作用雙倒數方程 第32頁反競爭性抑制劑結構特征 反競爭性抑制在單底物酶催化反應中比較少見胎盤堿性磷酸酯酶以葡萄糖-6-磷酸或-萘酚磷酸酯為底物時，L-苯丙氨酸為反競爭性抑制劑；順鉑對乙酰膽堿酯酶抑制作用也是屬于反競爭類型。 第33頁在雙底物反應中，反競爭性抑制比較多見，如乒乓機制酶促反應時，因為I能夠與EB復合物結合，對一個底物（A）表現競爭性抑制化合物（I）對另一個底物（B）展現反競爭性抑制。如抗壞血酸對兔肌乳酸脫氫酶抑制作用，抗壞血酸

13、相對于NADH表現為乳酸脫氫酶反競爭抑制，相對于丙酮酸為乳酸脫氫酶競爭性抑制劑。 第34頁 4，混合性抑制作用混合性抑制作用中S和E或EI都能夠結合，I也可和E或ES結合，但親和力都不相等，表明S和I對酶結合互有影響， Ki和Ki二者既不等于無窮大，又互不相等，Ksi和Ks也不相等。相關可逆抑制作用通式就是混合性抑制作用公式。 第35頁當用雙倒數方程作圖時，有抑制劑和無抑制劑直線既不平行，又不相交于縱軸或橫軸，而是相交于橫軸負側上方（第二象限）或下方（第三象限） 第36頁二、不可逆抑制作用這類抑制作用抑制劑與酶分子上某基團以牢靠共價健結合使酶失活。不能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復活

14、。不可逆抑制作用特點是隨時間延長會逐步地增加抑制，最終到達完全抑制。 第37頁 1，非專一性不可逆抑制作用(1)酰化劑 可用通式表示為RCOX。比如，醋酸酐、三氟乙酸硫醇酯、乙酰咪唑等。它們對酶酰化反應以下式： 第38頁磷酰化劑亦屬這類，如二異丙氟磷酸酯(DFP)以及1605、1059等有機磷酸農藥以及神經毒劑。DFP能使乙酰膽堿酯酶分子中一個絲氨酸側鏈(Ser-CH2OH)磷酸化而使酶失活。 第39頁(2)烴基化劑可用通式R-X表示。如鹵烴衍生物，因為鹵原子強電負性，使烴基帶部分正電荷，有利于酶上一些親核基團攻擊，反應以下式： 第40頁(3)含活潑雙鍵試劑含活潑雙鍵試劑，如N-乙基順丁烯二酰

15、亞胺、丙烯氰等，它們可與酶分子上-SH、-NH2等基團起加成反應，以下式： 第41頁(4)親電試劑常見有四硝基甲烷，它可使酶分子上酪氨酸側鏈硝基化。產物含有特殊光譜性質，易于被檢測。反應以下式： 第42頁2，指向活性部位抑制劑 指向活性部位抑制劑作用特征是, 抑制劑分子中含有化學活潑功效基，它與酶活性部位處基團或原子發生共價結合，使酶失活。這類抑制劑通常是在物物分子所特有識別基團上連接或修飾有反應活性化學基團或原子，當抑制劑與酶形成初始可逆性復合物后，該反應活性功效基與酶活性中心發生化學反應，形成共價鍵，以致改變了酶氨基酸殘基排布(構象)而失活 第43頁引入化學活性基團有鹵代酰基，鹵代酮、偶氮

16、嶺甲基酮、環氧基、亞磺酰氟、不飽和鍵、二硫鍵、光敏基團等。這類抑制劑與酶反應速率應比類似非酶性反應快，比如，含有很好離去基團有機磷化合物對絲氨酸蛋白酶不可逆抑制作用是因為在活性部位絲氨酸處發生磷酰化，生成磷酰化酶。這些抑制劑并非單純活潑磷酰化試劑，因為它們對于親核試劑反應活性并不高。比如，對絲氨酸蛋白酶和乙酰膽堿酯酶磷酰化速率比與水反應速率快108-1012倍。 第44頁3，酶自殺性底物抑制作用 這類抑制劑展現其活性是在酶催化過程實現。這類抑制劑結構與底物有很大相同性，與酶分子有較高親和力，它本身無化學活性或者沒 有化學活性基團， 但在酶催化作用 下，產生了化學活 性親電性基團， 從而與酶活性

17、部位 處親核性基團發生 不可逆結合反應， 使酶失活。 第45頁自殺性底物含有以下結構特征和性能(1)同正常底物化學結構含有相同性；(2)能夠同酶結合成復合物，有較大親和力；(3)在通常狀態下，有低反應性能或化學惰性基團或結構片斷；(4)在酶催化階段，可將惰性基團轉化為反應性能強中間體；(5)與酶活性部位發生化學反應，尤其是共價鍵合，使酶不可逆失活。 第46頁酶自殺性底物功效基團類型 第47頁酶自殺性底物特異性是基于它與正常底物結構相同性、這是酶與該抑制劑結合成復合物并經催化反應暴露出活性基團前提。所暴露出反應活性基團大多是親電基團。比如,不飽和羰基(醛、酮、亞胺或酯等)，與酶分子親核基團發生邁

18、克爾加成反應 第48頁,不飽和羰基產生是酶催化反邁克爾加成，生成負碳型中間體被負電性羰基共振穩定化，使鄰位碳發生消去反應或去質子化，生成鄰位不飽和鍵。 第49頁四種類型可逆抑制比較 不一樣類型可逆抑制作用能夠利用雙倒數作圖法來區分，依據圖中有沒有抑制劑時直線是否相交于1/S軸，還是1/V軸就能夠區分。第50頁 表7-1 四類可逆抑制劑動力學比較抑制類型速率方程表觀Km表觀 Vmax無抑制KmVmax競爭性增大不變非競爭性不變減小反競爭性減小減小混合性減小或增大減小第51頁第二節 化學物質對酶激活作用 有些化學物質作用與抑制劑作用相反，對酶起著激活作用，加強酶作用效果。在一些情況下，只有在激活劑

19、存在下，酶催化反應才能進行，或者說只有在激活劑存在下催化反應速度才能測得出來。凡是能提升酶活性物質，都稱為激活劑，激活劑普通是無機離子活簡單有機化合物，而高分子物質較少。第52頁激活劑激活機制激活劑之所以能夠提升酶催化活性，其主要原因有兩種：一是激活劑與酶分子結合，改變了酶活性中心及其附近構象，從而增強了酶與底物親合能力，或者是增加了產物離去速度，進而提升酶催化活力；二是激活劑與底物分子結合再與酶分子結合，使底物分子電子密度或分子張力發生改變，有利于產物形成，從而提升酶催化活力。第53頁一、激活劑類型 激活劑類型除了在生物體內起激活作用蛋白質分子（如酶原激活）以外，按照分子大小能夠分為三種類型

20、。即：無機離子、有機分子和高分子物質。第54頁1，含有巰基還原劑 半胱氨酸、2-巰基乙醇和還原型谷胱甘肽等都含有巰基，能夠使酶分子中被氧化-SH基還原，從而提升酶催化活力。如半胱氨酸、2-巰基乙醇和還原型谷胱甘肽等對腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、木瓜蛋白酶、蠟樣芽胞桿菌蛋白酶、D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶等均含有激活作用。半胱氨酸 (20mM)、2-巰基乙醇(10mM)和谷胱甘肽 (10mM)分別使未活化腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性提升1.3、3.5和2.8倍。 第55頁巰基配位作用這些含有巰基化合物還能夠作為金屬酶活性中心軸向配體從而激活酶催化作用，如巰基苯甲酸、巰基乙酸、半胱氨酸對細胞色素

21、P450、過氧化氫酶激活作用。過氧化氫酶被巰基乙酸激活后，其km值減小、kcat/km增大，即巰基乙酸能夠提升過氧化氫酶對底物親和力及底物專一性。巰基乙酸一樣能夠引發過氧化氫酶可見光譜藍移及酶分子色氨酸殘基熒光強度減小，從而使過氧化氫酶活性中心鐵卟啉周圍環境發生改變，以到達提升酶活力之目標。第56頁2，多羥基化合物 多羥基化合物如甘油、乙二醇、糖類物質等不但能夠作為酶穩定劑使用，而且它們對許多酶含有激活作用。比如，在 Mg2+ 或 Mn2+ 存在情況下，蔗糖對天冬氨酸酶含有較強激活作用，天冬氨酸酶催化活力同不加蔗糖時相比可提升5.18倍，一樣當甘油加入含酶體系，酶活力有一定程度提升。這種激活作

22、用可能與甘油和蔗糖羥基相關，且這種激活作用必須與Mg2+或 Mn2+離子結合起來才能發揮作用。 第57頁另外，對腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶起激活作用物質除了半胱氨酸、2-巰基乙醇和還原型谷胱甘肽等以外，3-磷酸甘油是其最有效激活劑。用0.1mol/L 3-磷酸甘油作為激活劑可使腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶Vmax提升近4倍。3-磷酸甘油對腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶激活取決于3-磷酸甘油與腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶巰基結合和環境值。氧化或除去巰基，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性顯著下降；在只有3-磷酸甘油作為腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶激活因子情況下,對3-磷酸甘油有很大影響，在pH值為7.5、8.

23、0、8.5和9.0時, 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性分別提升了3.1、2.9、4.8和9.5倍。第58頁乙二醇在0.33mol/L濃度范圍內對-葡萄糖醛酸苷酶含有激活作用，其最適濃度為1.5mol/L。其激活機理可能是因為乙二醇與底物水解產物-葡萄糖醛酸形成苷式結合，降低了產物抑制效應，從而提升了酶促反應，使酶活性升高。 第59頁3，變性劑 一些變性劑如脲、鹽酸胍等能夠完全破壞酶蛋白空間構象，使酶失去活性。不過當變性劑濃度較低時，酶蛋白僅僅發生了部分變性。因為酶活性中心附近多肽鏈柔性，部分變性使活性中心空間構象發生改變，有利于底物結合以及產物離去，從而使酶催化活性提升。第60頁比如，在5C、

24、20C、30C，雞肝二氫葉酸還原酶伴隨鹽酸胍濃度增加而增高，線經歷一個激活過程后，再開始失活。2mol/L脲可使二氫葉酸還原酶活力提升3.6倍，而且酶活力能夠穩定12小時。4mol/L脲可使二氫葉酸還原酶催化活力提升大約5倍，但激活后酶很快失去活力。 曲線1和2是在脲加入后馬上檢測，曲線3和4是在脲加入12小時后檢測 第61頁一樣不一樣濃度脲和鹽酸胍也能夠激活腺苷酸激酶，當脲濃度低于1.8mol/L時，腺苷酸激酶二級和三級結構沒有尤其顯著改變，不過酶催化活力卻顯著提升，在脲濃度到達1mol/L時，提升了1.6 倍。而伴隨脲濃度增加，酶催化活力沒有繼續提升，反而開始下降。 -278nm處光吸收改

25、變；-222nm處CD光譜改變；-酶相對活性-ANS熒光標識相對強度；- ANS熒光標識慢相速度常數相對值 第62頁不一樣濃度下ANS與腺苷酸結合慢相速率常數 第63頁4，有機溶劑和表面活性劑 在一些情況下，低濃度有機溶劑和表面活性劑能夠有利于底物溶解，同時也能夠使酶分子部分變性，從而提升酶分子催化活性。如在5%-10%乙醇-磷酸鹽緩沖溶液中，酪氨酸酶和漆酶催化活力能夠提升30-50%。 第64頁而甲醇、乙醇、丙醇和丁醇對青霉素V酰化酶誘導激活過程中，醇分子是以有機分子形式起作用。其激活機制如圖所表示。 第65頁第66頁表面活性劑如Tween 80處理Bacillus megaterium酯酶

26、，可使酶催化對硝基苯酚己酯Km值降低，而Kcat/Km值提升14倍。非離子表面活性劑濃度在0.1%0.8%時，吐溫80、聚乙二醇等作為纖維素酶激活劑，可使纖維素酶活力提升20%-50%。而陰離子表面活性劑濃度在0.1%0.8%時，如十二烷基磺酸鈉也可作為纖維素酶激活劑。第67頁5，小分子有機化合物 在有機胺類化合物（二乙胺、二異丙胺、三乙胺、吡啶等）存在下，磷酸三酯酶催化活性伴隨有機胺濃度改變而改變；當有機胺濃度較低時，磷酸三酯酶催化活性顯著提升，顯示出有機胺化合物對磷酸三酯酶激活作用，但當有機胺濃度增大時（0.1mol/L），則表現出較強抑制作用。 第68頁 6，高分子化合物 高分子化合物如

27、聚乙烯亞胺、聚精氨酸、聚賴氨酸等聚電解質，在低濃度溶液中能夠與酶蛋白分子表面相反電荷相互作用，多點靜電引力結合可能使酶活性中心附近空間構象發生改變，從而提升酶催化活力。如聚乙烯亞胺，聚丁基亞胺分別使乳酸脫氫酶活力提升3.0和 5.0倍。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對煙草硝酸還原酶也含有較強激活作用。 第69頁二、激活作用動力學 一些激活劑激活作用主要是因為激活劑與游離酶相結合形成活性酶復合物，激活劑與底物相結合形成復合活性底物；或者和E、ES都能結合形成三元復合物等各種情況。因激活作用和抑制作用類同，在此僅就二種類型激活作用簡述以下。 第70頁1，激活劑A與酶形成EA活性復合物 激活動力學模型與抑

28、制動力學模型采取一致符號，可表示以下: 第71頁以穩態法處理可得到以下反應速度方程式: 第72頁顯而易見，這類型激活劑只影響反應Km值，并不影響Vmax。若和抑制劑類型相類比，應屬于競爭性活化。其倒數方程可表示以下： 第73頁A加大，斜率降低，反應速度增大，A降低，斜率增大，反應速度降低；A0, 0。另外，當S= (在A存在前提下)時, Vmax。若固定S，以1/1/A作圖可求出KA：第74頁對S1和S2不一樣底物濃度下所得到1/1/A兩直線相交于一點：1/A=-1/KA。假如激活劑A與底物結合，其模型可表示以下： 第75頁第76頁2，激活劑與游離酶、酶-底物復合物結合 第77頁激活劑和酶結合

29、不影響底物與酶結合，一樣底物結合也不影響激活劑與酶結合。激活劑作用只對酶活性有影響，也就是說，末結合激活劑ES復合物是無活性，只有ESA三元復合物才有活性。以快速平衡法得到以下方程：第78頁顯然此種類型激活劑只影響Vmax而不影響及Km，屬于非競爭性活化作用。其倒數方程以下： 第79頁直線斜率為（1+KA/A）Ks/Vmax，縱軸截距為（1+KA/A）/Vmax。橫軸截距為- 1/Ks(1/=0, 1/S= -1/Ks)。若已知激活劑A濃度和Vmax就能夠計算出KA。以Dixon作圖法也能夠得到KA。當S為常數時，1/1/A作圖是直線，而且S1和S2不一樣底物濃度下所得到1/1/A兩直線相交于

30、一點：1/A=-1/KA。 第80頁第81頁第82頁第83頁第四節，酶對化學物質催化作用酶作為一個高效生物催化劑，它含有比化學催化劑更優越性能。利用生物催化劑實現有機化合物生物合成和生物轉化是一門以有機合成化學為主，與生物學親密聯絡交叉學科，它也是當今有機合成化學研究熱點和主要發展方向。酶不但能夠催化天然有機物質生物轉化，也能在生物體外催化天然或人工合成有機化合物各種轉化反應，而且顯示出優良化學選擇性、區域選擇性和立體選擇性。所以，酶催化反應提供了許多常規化學方法不能或不易合成化合物合成方法，能合成和制備包含光學純醫藥、農藥及中間體在內復雜功效化合物，是一個有利于環境保護綠色化學過程。 第84

31、頁一、酶制劑類型 即使自然界中發覺酶已達3000各種，但因為酶生產成本等方面限制，工業上有價值酶只有不到100種，能大規模生產和應用只有十各種，如淀粉酶，蛋白酶、葡萄糖異構酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、脂酶等。在酶催化化學反應中，因為反應類型，反應條件，反應體系以及完成底物轉化規模等原因，需要考慮所使用酶制劑類型。為了提升酶制劑穩定性和催化效率，能夠對酶制劑本身進行修飾和改性，所以，在酶催化化學反應中，除了使用溶液狀態酶制劑以外，還可采取以下酶制劑類型。 第85頁酶制劑起源第86頁1，完整細胞 一些含有較高酶活力細胞（如微生物、植物細胞、動物細胞）組織、細胞器等，不經過分離直接用于催化反應，或用物

32、理或化學方法使其與適當載體相結合，作為固定化催化劑利用。固定化細胞可省掉提取工藝，使酶損失到達最低程度。有時能夠利用細胞復合酶系統催化幾個相關反應。固定化細胞方法主要有兩種類型：即包埋法和共價交聯法。 第87頁2，固定化酶 酶固定化是經過物理或化學方法，將酶束縛在某種載體上，使酶只能在一定空間內進行催化活動，底物經過擴散作用與酶接觸并發生反應。在反應結束后，產物擴散到反應介質中與酶分離。而酶則能夠重復進行催化作用。這種酶在反應體系中以固相形式存在，所以稱為固定化酶或固相酶。固定化酶不但保持了酶原有性質，而且賦予了酶新特征。比如固定化酶含有一定機械強度，能夠攪拌或裝柱，易于回收和重復使用，產物輕

33、易分離，輕易實現生產過程連續化。另外，酶固定化后，能夠提升對溫度及酸堿穩定性。 第88頁3，修飾酶 化學修飾目標是將酶分子表面親水基團改變為疏水基團，使得酶能夠在有機介質中有效分散，溶解在有機溶劑中，從而提升酶催化效率。經典例子是用單甲氧基聚乙二醇共價修飾脂肪酶、過氧化物酶等自由氨基，修飾酶能均勻溶于苯、氯仿等有機溶劑中，同時表現出較高酶催化活性和穩定性。 第89頁采取聚乙二醇共價修飾Candida rugosa脂肪酶，在異辛烷中催化酯合成反應，酶催化活力比未修飾酶提升數十倍；另外聚丙烯醇修飾、聚丙烯酸甲酯修飾、脂肪酸修飾酶在有機溶劑中也表現出很好催化活性。酶分子表面以及活性中心基團也能夠與表

34、面活性劑或脂肪酸相互作用，形成復合物。用非離子表面活性劑處理各種蛋白酶形成復合物在無水有機溶劑中催化二肽合成，酶催化活力可提升26倍。而采取硬脂酸處理脂肪酶和蛋白酶（對酶進行非共價修飾），修飾酶在有機溶劑中酯交換活力提升了15倍，產物光學收率到達100%ee。 第90頁二、酶催化反應介質 水是酶促反應最慣用反應介質。在水溶液中采取游離酶催化化學反應不存在底物及產物擴散問題。因為底物、產物和酶都處于溶解狀態，底物輕易進入酶活性中心，產物也輕易進入緩沖體系中。不過，對于大多數有機化合物來說，水并不是一個適宜溶劑，因為許多有機化合物在水介質中難溶或不溶。而且，因為水存在，往往有利于如水解、消旋化、聚

35、合和分解等副反應發生。 1，水介質第91頁2，與水互溶有機溶劑水單相體系 有機溶劑與水形成均勻單相溶液體系。酶、底物和產物都能溶解在這種體系中。這類溶劑主要包含二甲基甲酰胺, 四氫呋喃, 二氧六環, 丙酮，乙醇和甲醇等。該體系主要用于脂溶性底物轉化反應。因為底物在水溶液中溶解度比較低, 因而反應速度很低。在一些情況下，經過使用與水互溶溶劑能夠提升酯酶和蛋白酶催化反應速度和選擇性。但這種極性有機溶劑經常造成酶變性，催化活力降低。 第92頁3，非極性有機溶劑水兩相體系 由含有溶解酶水相和一個非極性有機溶劑(高脂溶性)相所組成兩相體系。這類有機溶劑主要是碳氫化合物、酯、含氯碳氫化物等。這種體系對于從

36、有機相中有效地分離酶是非常有利。酶處于水溶液包圍環境中，不與有機溶劑直接接觸。大部分底物溶解在有機相中。在水相中，底物或產物有限濃度能夠防止對酶產生抑制作用。產物從酶分子表面脫落進入溶液中有利于反應向生成產物方向進行。 第93頁4，非極性有機溶劑酶懸浮體系 用非極性有機溶劑取代全部大量水，使固體酶懸浮在有機相中。即使從表面上看酶是干，但依然含有必需結合水以保持酶催化活性(含水量普通小于2%)。懸浮體系中，酶狀態能夠是結晶態、凍干狀態、沉淀狀態，或者吸附在固體載體表面上。酶在有機介質中良好分散狀態是提升酶促反應速度關鍵。 第94頁5，反向膠束體系 反向膠束是表面活性劑分子在非極性溶劑中自發形成熱

37、力學穩定、光學透明球形聚集體。從結構上看，反向膠束有一個由表面活性劑分子烴鏈組成外殼，疏水尾指向有機溶劑，極性頭指向聚集體內部形成空腔,酶溶液被包在之中。因為反向膠束體系能夠很好地模擬酶天然環境，因而在反向膠束體系中，大多數酶能夠保持催化活性，甚至表現出超活性。比如酪氨酸酶、酸性磷酸酶、辣根過氧化物酶在反向膠束中催化速度分別提升50、100、200倍。 第95頁6，超臨界流體 超臨界流體除含有傳統有機溶劑全部優點外，還含有液體高密度性、氣體高擴散系數、低粘度和低表面張力，使底物向酶傳質速度加緊，從而使反應速度提升。超臨界流體作為酶反應介質，對酶促反應起著主要作用, 它能夠改變酶底物專一性，位置

38、（或區域）選擇性和對映體選擇性，并能增強酶穩定性。慣用超臨界流體有CO2，SO2，CH2H4，C2H6，C3H8，C4H10等。其中以CO2最為常見，主要是因為它臨界條件溫和，利于酶保持生物活性。而且CO2價格廉價，無毒無污染，符合當今綠色化學發展方向。 第96頁7，無溶劑體系無溶劑有機合成體系有以下幾個形式：（1）反應物均為液體；（2）一個反應物為固態，一個為液體；（3）兩種反應物均為固體；（4）一個反應物為氣體，另一個為固體。無溶劑有機合成反應含有污染少、成本低、反應過程和處理過程簡單、產率高等特點當前酶催化無溶劑有機合成反應中，使用酶主要有脂肪酶、蛋白水解酶和糖苷酶。 無溶劑酶催化反應主

39、要包含以下幾個反應體系：無溶劑體系（液態），固態-對-固態反應體系（包含低共熔混合物反應體系、超飽和底物反應體系）以及干介質反應體系。 第97頁（1）液態無溶劑體系 酶催化底物為脂肪酸或脂肪酸酯（包含甘油酯）與脂肪醇（包含甘油），這些底物大多數在反應溫度下展現液體狀態，或者含有較低熔點，在稍稍高溫度下（50-70C）也呈液體狀態。這種反應體系，除了加入保持酶催化活性所必須微量水之外，不再加入任何溶劑。采取這種反應體系，能夠有效地合成在醫藥、食品、化裝品中使用油脂、單甘油酯和各種脂肪酸酯等。 第98頁（2）“固-對-固”反應體系在高底物濃度酶催化反應中，反應體系普通僅加10-30%水或有機溶劑，

40、主要是固體反應物。即起始反應混合物主要由懸浮在少許溶劑中固體反應物或高度飽和液體相組成（水或有機溶劑），而最終反應混合物主要由固體產物組成，這種反應體系被稱為“固體-對-固體”反應。這種酶催化反應主要用于酰胺、糖苷、糖酯合成。 第99頁多肽合成L-苯丙氨酸乙酯（油狀物）和L-亮氨酰胺（固體）混合物做底物，使用固定化枯草桿菌蛋白酶和糜蛋白酶作催化劑進行肽合成。試驗表明在這種無溶劑體系中，這兩種酶很輕易催化反應進行，其中用枯草桿菌蛋白酶催化時可得到83%產率（0.8g/每克固體反應混合物）。 第100頁低共熔混合物介質 Kim J.等報道了用糜蛋白酶催化N-芐氧酰基-L-天冬氨酸-乙酯與D-丙氨酸

41、在9%DMSO，18%MEA和12%水組成共熔反應體系中合成一個甜味二肽衍生物，37C反應6小時，反應收率到達70%以上。 第101頁固體對固體反應體系反應體系普通僅加10-30%水或有機溶劑，主要是固體反應物。即起始反應混合物主要由懸浮在少許溶劑中固體反應物或高度飽和液體相組成（水或有機溶劑），而最終反應混合物主要由固體產物組成，這種反應體系被稱為“固體-對-固體”反應體系。 這種固體反應物體系主要特點是反應熱力學表現出類似“開關”行為，得到產率或者非常低，或者極其高 第102頁第103頁過飽和反應體系在一些超飽和反應體系中，水加入量高達40%以上。比如Isono,Y等在研究甜味二肽酶促合成

42、中直接使用高濃度底物溶液（3.77mol/L）進行反應反應轉化率也可到達90%以上。Youshiko等用青霉素酰化酶催化6-氨基青霉烷酸（6-APA）與D-苯甘氨酸及D-苯甘氨酸甲酯酯化和酯交換反應，使用過飽和底物水溶液，得到95-99.9%氨卞青霉素產物。 第104頁糖酯合成在脂肪酶催化脂肪酸糖酯合成中，Yan Y等在Candida Antarctica B脂肪酶催化硬脂酸葡萄糖酯合成中，使用2-丁酮作為輔助劑，經過抽真空除去反應中產生水，58小時反應得到93%產率。一樣利用2-丁酮或丙酮作為輔助劑催化葡萄糖與各種脂肪酸（辛酸、棕櫚酸和硬脂酸）酯化或與各種脂肪酸甲酯酯交換反應，轉化率到達90

43、%以上。第105頁（3）干介質體系在干反應技術中反應物沉積在無機氧化物上，如氧化鋁、硅膠、高嶺土、硅藻土等均可用來作為反應物載體，然后經過加熱方法使反應進行。Novozyme Sp 435是由Novo(Denmark)企業將Candida antarctica脂肪酶固定化在聚丙烯酸樹脂上商品，能夠耐受80-100C高溫。而固定化在由硅膠制成Hyflo Supercell (HSC) 上Pseudomonas 脂肪酶也能夠耐受較高溫度。第106頁 將生物催化劑應用于有機合成是當前最吸引人研究領域。有機化合物生物合成和生物轉化是一門以有機合成化學為主，與生物學親密聯絡交叉學科，它也是當今有機合成化

44、學研究熱點和主要發展方向。 酶不但在生物體內能夠催化天然有機物質生物轉化，也能在生物體外促進天然或人工合成有機化合物各種轉化反應，而且顯示出優良化學選擇性、區域選擇性和立體選擇性。第107頁三、酶催化有機化學反應酶對所催化底物分子表現出不一樣選擇性。對于大多數酶來說，選擇性是相正確。這類酶一個主要特征是能夠催化一些非天然底物，表現出廣泛底物適應性。這是酶能夠應用于有機反應研究和有機合成基礎。生物催化劑用于手性合成、對映體拆分中，不但能夠催化各種化學反應，還能夠合成結構復雜、含有生物活性大分子和高分子化合物。同時，能夠避開化學法進行手性合成與拆分時所需手性試劑，以及產生無效對映體和環境保護問題。

45、為此，用生物催化方法進行化學合成又稱為“綠色合成”。 第108頁酶催化產物光學純度用對映體過量值(ee)表示，或用對映體比率E值表示。 式中ees表示底物對映體過量，eep表示產物對映體過量，其值通常在反應開始階段(轉化率20%)時測定。E值越大，表示酶選擇性越好；E值為1，表明酶對底物無選擇性。或 第109頁酶催化反應類型酯酶、脂肪酶酯水解和合成酰胺酶（蛋白酶、酰化酶）酰胺水解和合成脫氫酶醛酮氧化還原氧化酶（單加氧酶,雙加氧酶）氧化反應過氧化物酶氧化、過氧化和鹵代反應激酶磷酸化反應（需ATP）醛縮酶、轉酮糖酶縮醛反應（C-C鍵反應）糖苷酶、糖基轉移酶糖苷鍵水解和形成磷酸化酶磷酸酯形成轉磺酸基

46、酶硫酸酯形成轉氨酶氨基酸合成異構酶、裂解酶、水合酶異構化、加成、消除和取代反應其它水解酶（環氧化物酶等）水解反應第110頁1，水解反應 水解酶催化各類反應普通不需要特殊輔助因子，經過水解酶催化酯、環氧化物、酰胺等水解反應，能夠得到各種光學活性醇、酸、酯或胺。 第111頁（1）環氧化物水解 環氧化物水解酶能催化環氧化物進行不對稱水解，比如手性吡啶型環氧乙烷是制備一些手性藥品關鍵中間體，黑曲霉(Aspergillus niger) 環氧化物水解酶催化吡啶型環氧乙烷水解反應可得到手性環氧化物，對映體過量98%。 第112頁（2）腈類化合物水解 腈類化合物經酶法水解轉化成對應羧酸及其衍生物，是一個非常

47、有用合成方法，催化腈水解酶系有兩種類型：一個是腈水解酶，它催化腈直接水解，一步生成羧酸及NH3；另一個是腈水合酶，它催化腈水解生成酰胺，酰胺在酰胺酶作用下，深入轉化成羧酸及NH3，反應過程需兩步完成。 第113頁含有腈水合酶或腈水解酶酶活性微生物酶能夠催化轉化腈，用于生產專用或日用化學品、農用化學品及藥品中間體。腈水合酶能將腈催化轉化成對應酰胺類化合物，如用丙烯腈生產丙烯酰胺，用3-氰基吡啶生產煙酰胺。而腈水解酶能催化腈轉化成對應羧酸和氨，如用3-氰基苯甲酸甲酯合成3-羧基苯甲酸甲。第114頁（3）酰胺水解 酰胺類化合物酶催化水解反應廣泛應用與氨基酸拆分和青霉素、頭孢霉素母核生產中，所使用酶主

48、要是酰化酶類。而一些蛋白酶、脂肪酶及酰胺酶也能夠催化酰胺類化合物水解。 第115頁青霉素是人們經常使用一個抗生素。不過，多年使用使得不少病原菌對青霉素產生了抗藥性。利用青霉素酰化酶，將青霉素母核（6-氨基青霉烷酸，6-APA）和側鏈水解，然后，利用化學合成方法，使青霉素母核與其它側鏈連接起來，從而研制出氨芐青霉素等新型青霉素。 第116頁頭孢菌素類抗生素是一類抗菌譜廣、抗菌活性強、療效高、毒性低抗生素。7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)是醫藥工業生產半合成頭孢菌素主要中間體，國內外在工業上多采取化學法由頭孢菌素C脫去其側鏈來生產7-ACA。 第117頁利用氨基酰化酶高效專一性水解乙酰-L-氨基酸，

49、將混旋乙酰-D/L-氨基酸選擇性水解得到L-氨基酸產品。未反應乙酰-D-氨基酸再經過消旋化處理可重復使用。如蛋氨酸、苯丙氨酸等拆分，能夠得到99%eeL-構型產物。 第118頁一些脂肪酶也能夠催化酰胺類化合物選擇性水解，得到光學活性產物，如A.melleus脂肪酶催化N-(2-氟丙酰)-苯丙氨酸水解，得到(S,R)構型產物。 第119頁（4）酯水解 除了酯酶(esterase)、脂肪酶(lipase)能夠催化酯水解以外，許多蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶, 枯草桿菌蛋白酶, 胰蛋白酶, 胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等）不但能選擇性地催化酰胺鍵水解，也能選擇性地水解氨基酸酯鍵。 第120頁應用酶法水解拆分酯手性

50、異構體，普通產物光學純度為50-90%之間。為了提升產物光學純度, 能夠采取酶修飾、底物修飾或選擇適當反應溶劑等方法改進酶催化反應選擇性。 -芳基或芳氧基羧酸酯用羧酸酯酶催化水解，可得到高光學純產物。如： 第121頁蛋白水解酶能選擇性水解由L-構型氨基酸形成酯，而對D-構型氨基酸所形成酯不起催化作用。利用這種性質，能夠將消旋化氨基酸酯進行酶法拆分。 第122頁2，酯合成反應 脂肪酶在水溶液中可催化油脂和其它酯類水解反應，而在有機介質中它催化水解反應逆反應酯合成反應及酯交換反應。 脂肪酶催化酯合成反應底物專一性取決于酶類型，不一樣微生物起源脂肪酶催化不一樣鏈長脂肪酸與不一樣鏈長脂肪醇酯化反應。比

51、如脂肪酶MSL 在幾乎無水庚烷中催化油酸與正丁醇酯化反應，產率可到達92。固定在硅膠上脂肪酶CCL催化合成正丁酸乙酯和正辛酸乙酯可到達100轉化率。 第123頁(1)位置選擇性酯化反應 除了簡單烷基二醇、氨基醇和甾族二醇外，脂肪酶也能催化碳水化合物位置選擇性酰化反應。如豬胰脂肪酶在吡啶中，采取高活性脂肪酸(C2C12) 三氯乙醇酯作為酰化劑催化葡萄糖等單糖伯酰化反應，得到高度專一性6-O-脂酰化葡萄糖。 第124頁手性1,3-丙二醇衍生物是許多生物活性物質合成原料。以2-取代-1,3-丙二醇和脂肪酸為原料，在有機溶劑介質中用脂肪酶(CCL)或豬肝酯酶（PLE）催化酯化反應，可得到較高光學純度R

52、-或S-酯。 第125頁（2）手性化合物酶法拆分 手性羥基酯即使可經過酶催化水解拆分得到，但副反應較多，產率較低。假如拆分在有機介質中用脂肪酶(PSL)催化酯化進行拆分，能夠防止副反應發生。這個方法已經成功地用于-羥基-,-不飽和酯拆分。 第126頁 (3) 內酯合成反應 在一定條件下，-羥基酸或它酯在酶催化下，發生分子內環化作用得到內酯化合物。內酯可繼續反應形成開鏈寡聚物。小于四元環或大于7元環內酯是不穩定, 所以主要形成線性聚合產物。五元環內酯最輕易形成。六元環內酯形成經常伴隨有部分直鏈寡聚物形成。 第127頁3，酰胺鍵形成反應 在有機介質中，許多酰胺水解酶類能夠催化酰胺鍵形成反應，如蛋白

53、酶類、脂肪酶類以及酰化酶類（青霉素酰化酶等）。 第128頁（1）酰胺合成反應 酯酶催化氨解反應能夠生成酰胺，這個反應含有良好立體選擇性，是合成手性酰胺一個有價值方法。比如枯草桿菌蛋白酶催化正丁酸三氟乙基酯-甲基芐胺氨解，形成手性酰胺化合物。 第129頁因為脂肪酶含有同蛋白水解酶相同催化機制，所以它也能夠催化胺類化合物酰化反應和酯胺解反應。 第130頁利用青霉素酰化酶催化青霉素水解反應逆反應，人們采取超飽和體系或加入產物復合試劑等方法，合成了氨芐青霉素等抗生素，產率達80%以上。 第131頁（2）肽合成 有機溶劑中酶催化多肽合成，主要是利用蛋白酶催化多肽水解逆反應,肽轉移反應或氨解（氨基酸酯氨解

54、）反應進行。 第132頁4，氧化還原反應 催化氧化還原反應酶類包含脫氫酶和氧化酶。這些酶能夠催化羰基還原、醇氧化、烯烴環氧化以及芳香烴羥化反應。 第133頁（1）脫氫酶類 如醇脫氫酶能夠催化羥基氧化和羰基還原可逆反應，利用脫氫酶來還原羰基能夠得到光學純度極高手性醇類化合物，反應需要輔酶NAD(P)H參加。然而，NAD(P)+和NAD(P)H價格通常比酶促反應所得產物要貴得多，所以，有必要對輔酶進行再生并循環使用。當前用于NAD(P)+和NAD(P)H再生發展得比較完善方法是酶法再生。 第134頁酶法再生通常由合成體系和再生體系兩部分組成，合成體系用來制備目標產物，再生體系則用于輔酶再生。再生中

55、用得最多酶是脫氫酶，其次有氧化酶、氫化酶等。在該方法中，應用甲酸/ 甲酸脫氫酶（FDH）再生體系技術經濟性最好。當前，甲酸/ FDH再生NADH已被用于工業生產L-叔亮氨酸、光學活性醇等合成。 第135頁在有機介質中，將輔酶與酶一起吸附在載體表面水穴中，載體上輔因子能自由地進入和退出酶活性部位而不會從載體上脫落到介質中，從而增加了輔因子穩定性，提升了它循環效率。當前有機介質中酶催化氧化還原反應已經成功地應用于光學活性醛、酮和醇制備。許多脫氫酶，如酵母脫氫酶YADH和馬肝醇脫氫酶HLADH等能將前手性酮還原為手性仲醇，它們催化酮還原反應立體選擇性遵照Prelog規則，如HLADH還原2-三環癸酮消旋體，產生手性醇。 第136頁酵母中含有