1、鈣依賴性磷脂結合蛋白Annexin 的研究進展【關鍵詞】Annexin,；鈣離子；磷脂類；癌【摘要】Annexin是Annexins超家族中A亞家族的重要成員，具有鈣離子介導的磷脂結合特性.主要表達在人體內皮細胞、單核/巨噬細胞、骨髓細胞和某些腫瘤細胞中.本文著重就Annexin的基因構造、蛋白構造、生物學功能及其與疾病的關系進展闡述.【關鍵詞】Annexin；鈣離子；磷脂類；癌0引言Annexin，又名P36,ANX2,LIP2,LP2,AL1H,LP2D,ANX2L4,PAPIV.其基因位于15q21q22，r為36103，在人體內皮細胞、單核巨噬細胞、骨髓細胞和某些腫瘤細胞中表達豐富.A

2、nnexin最早是在勞氏肉瘤病毒/雞胚成纖維細胞中作為酪氨酸蛋白激酶的作用底物而被發現的1.后來研究說明，Annexin具有a2+依賴性結合磷脂、細胞骨架蛋白的重要特性，從而將其歸入Annexins蛋白超家族的亞家族中，命名為AnnexinA22.盡管已發現Annexins家族成員多在細胞生長和信號轉導的調節方面發揮作用，但Annexin的詳細生物學功能還不清楚.實驗說明，Annexin與人類許多疾病的發生開展相關，尤其在腫瘤、心血管疾病中的作用機制成為當前的研究熱點3.本文重點綜述Annexin的生物學功能及其與人類疾病的關系.1Annexin的基因和蛋白構造人Annexin的構造基因位于1

3、5q21q22，含1.4kb編碼基因，并有三個假基因分別位于4號、9號、10號染色體上.人Annexin構造基因含13個外顯子和12個內含子.現已發現幾種不同的轉錄變異體4.Annexin由339個氨基酸殘基組成，是Annexins家族A亞家族成員.與該家族其他成員一樣，它在構造上具有一個保守的羧基末端和一個可變的氨基末端.保守的羧基末端一般具有四個Annexin重復子，每一重復子由大約七十個高度保守氨基酸殘基構成.每一重復子有五個螺旋構造，它們堆疊成致密的圓盤狀.該構造域具有結合鈣離子的才能，從而調節Annexin分子與磷脂分子的結合，故被稱為所有Annexins家族成員的核心區域5.這種構

4、造不同于鈣調蛋白，肌鈣蛋白等的EF臂型鈣離子結合位點，而有自己特殊的模序構造6，即鈣離子結合蛋白后，再與帶負電荷的磷脂分子極性頭部結合.Annexin氨基端的前十四個氨基酸殘基形成兩性螺旋構造提供了S100A10p11的結合位點，從而形成A2S100A10復合物的構造根底，除形成復合物，氨基端局部還有其他功能，如結合內體，與組織纖溶酶原激活物反響，作為磷酸激酶的作用底物等.1996年，Burger等人通過X射線衍射實驗，觀察到了截去N端三十個氨基酸殘基的Annexin晶體構造，其表現為曲面構造，凹面有肽鏈的氨基端及羧基端，凸面含有鈣離子磷脂結合位點.AnjaRsengarth等為進一步從構造上

5、說明Annexin與其主要結合物S100A10的結合機制再次通過X射線衍射觀察到了全長Annexin的晶體構造，如圖1所示.Annexin主要有單體、二聚體、四聚體三種存在形式.二聚體是Annexin與三磷酸甘油酸激酶的結合物，四聚體那么由兩個Annexin亞基和S100A10(p11)二聚體結合而成.圖1Annexin的絲帶模型.左圖和右圖分別顯示全長構造和氮端局部刪除構造.重復子及鈣離子結合位點已標注略2Annexin的生物學功能21Annexin與膜的交融細胞膜交融是真核細胞中的一種重要生物現象.膜交融是物質運輸的根底，如分泌蛋白從內質網運輸到高爾基復合體，以衣被小泡形式，通過膜交融方式

6、將內容物釋放到高爾基復合體內，又如運輸小泡與質膜交融實現了物質的內吞和外吐.Annexin在膜交融過程中起到了介導生物膜聚集的作用.AnnexinA2S100A10四聚體在a2+濃度很低的情況下就可以聚集膜構造并使之交融.Annexin單體以羧基端核心區域結合膜構造，同時氨基末端又有S100A10結合位點，二聚化的S100A10起到橋梁作用，把已結合磷脂膜的Annexin拉攏到一起，實現聚集交融膜構造的功能.在含有轉鐵受體的內體循環中，Annexin以四聚體形式介導了質膜循環8.另有研究顯示，在Annexin的膜交融功能還可通過兩個分子的同聚化形成的.二聚化的分子呈反向平行構造，從而拉攏質膜，

7、如圖2，3所示，可能有三種途徑：Annexin通過鈣離子二聚化再分別與膜結合；Annexin先在鈣離子介導下與膜結合，再二聚化，最后結合另一局部膜使膜聚集；Annexin先在鈣離子介導下與膜結合，再募集另一個已與膜結合的單體分子從而實現膜聚集7.圖2Annexin與S100A10形成四聚體介導生物膜聚集的過程5略圖3Annexin同源二聚化介導生物膜聚集的三種可能的途徑8略22Annexin與RNA的特異性結合人們早已發現Annexin在病毒轉化的細胞系和人某些腫瘤組織中表達上調.最近對七種Annexin蛋白測試證明僅Annexin具有特異性結合RNA的特性.Annexin無論是以單體還是以四

8、聚體形式，都可在鈣離子介導下特異與RNA中的plyG結合.兩者結合的部位可能是位于Annexin羧基末端一些特殊模序構造，如RNP模序，富含精氨酸的模序，雙鏈RNA模序、KH模序、RGG盒、鋅指構造.Annexin與HeLa,LNaP腫瘤細胞中的y癌基因的RNA結合可延長其半衰期，從而使y蛋白表達上調9.23Annexin參與DNA生物合成Annexin可與三磷酸苷油酸酯激酶形成二聚體復合物.這一復合物是DNA合成過程中的引物識別復合物PrierRegnitinPrtEins,PRP.DNA復制過程中，雙鏈DNA解螺旋，領頭鏈和隨從鏈分別由不同的DNA聚合酶催化得以復制.其中隨從鏈合成有賴于D

9、NApl.少量Annexin有結合DNA尤其是ZDNA的才能，同時它可作為PRP中的組分激活DNApl的活性.實驗觀察顯示，PRP使引物與模版以較低比例完成DNA復制，進步了復制的效率.更進一步研究說明PRP與復制因子復合物構造類似，它們都既能使復制叉中領頭鏈和隨從鏈的復制互相協調進展，又能促進模板引物互相識別10.24Annexin與纖溶系統Annexin介導的纖溶酶原激活機制，可能有賴于其羧基末端的賴氨酸殘基(Lys307).Annexin構造上的顯著特點使其可作為纖溶酶原plasingenPLG和組織纖溶酶原激活物tissueplasintPA的共同受體.根據三維圖像研究分析，annex

10、in蛋白外表呈環形盤狀構造，3個a2+依賴的磷脂結合位點位于annexin外表凸區.它含有3個根本的二肽序列，LysLys(79，80)，LysArg(203204)和LysArg(307308)，這3個肽段水解后均可產生羧基末端賴氨酸殘基，是潛在的纖溶酶裂解位點.其中，LysArg(307308)最接近羧基末端，是最可能的纖溶酶靶點.PLG在Annexin的激活，需借助受體羧基末端的裂解，進展受體修飾或受體“激活作用.ijungKn等人研究證明Annexin的異四聚體還具有復原血纖維蛋白溶酶的活性.它可通過破壞纖溶酶原中的二硫鍵使其釋放A61片段11.四聚體中的Annexin亞基的ys334

11、殘基和S100A10中的ys61,ys82均有復原酶活性.25Annexin與骨組織Takahashi等12在研究中發現Annexin作為破骨細胞的表達產物通過自分泌或旁分泌作用于破骨細胞本身從而增強其形成才能并增強骨質的溶解.在缺乏1，25H2維生素D3的骨髓環境中Annexin增加了破骨細胞樣的多核細胞數量并促進了骨的溶解.新近研究說明13，Annexin在造骨細胞礦化過程中亦有一定作用.研究人員通過在造骨細胞中高表達Annexin，使堿性磷酸酶alkalinephsphataseALP)活性增強并伴有大量的造骨細胞礦化.Annexin和ALP的功能均與造骨細胞膜上的微小構造“脂筏(即富含

12、鞘糖脂和膽固醇的膜，能抵抗冷的TritnX100洗滌)親密相關.Annexin對ALP活性的促進有賴于膽固醇.26Annexin與物質運輸早期研究說明Annexin通過在胞內體及其他內涵體上形成網狀構造，調節轉運小泡的形成，參與胞吐過程，如嗜鉻顆粒發生胞吐時其中可檢測到Annexin.一些蛋白的分泌，例如要與脂筏構造結合的蔗糖酶以及麥芽糖酶在向上皮細胞游離面運輸時需要Annexin結合到運輸小泡的膜上才能完成.同時RNA干擾和抗體干擾的實驗證明，Annexin參與依賴胰島素的GLUT4的跨膜轉運14.Annexin與鈣離子通道形成相關.TPRV5和TPRV6是鈣離子通道的受體，A2S100A1

13、0可與它們形成復合物影響鈣離子內流.S100A10還可結合藍舌病毒的NS3蛋白15.通過這種結合，NS3蛋白可使聚集的病毒向胞外運輸或在膜上定位.S100A10與NS3的結合位點恰恰與Annexin的結合位點一樣，從而使A2S100A10形成受抑制，影響其生理功能.27Annexin的分泌功能Annexin雖然缺乏經典的信號肽序列，但卻能以某種不明機制轉位于細胞膜外表.例如ArunkuarB.Dera在加熱刺激細胞的實驗中，觀察到Annexin轉位于膜外表，并且這種轉位依賴p11和酪氨酸磷酸化.這說明除經典的內質網一高爾基復合體細胞膜蛋白分泌途徑以外還存在別的蛋白分泌途徑.前文提到Annexi

14、n在纖溶系統中的受體功能正是以Annexin分泌到胞外為根底的.有研究者通過用尼古丁刺激嗜鉻細胞，觀察到依賴外源性鈣的Annexin分泌，并構建了一種可能的模型來說明分泌機制.該模型顯示，Annexin介導嗜鉻顆粒聚集后，顆粒接觸面會出現空洞，甚至發生膜的破裂.Annexin被破裂的膜碎片包裹從而隨著胞吐作用出胞，該過程如圖4所示.圖4Faure等人提出膜結合外表多孔樣模型，試圖以此解釋無信號肽引導的Annexin分泌16略3Annexin與人類疾病的關系31心血管疾病前已述之，A2S100A10四聚體與纖溶系統有親密關系，故在一些心血管疾病中可觀察到Annexin的表達或功能異常.在急性早幼

15、粒細胞白血病APL中，Annexin異常高表達，促使纖溶酶過度產生引起異常纖溶亢進性出血17.在動脈粥樣硬化中，可能由于脂蛋白A的影響，Annexin的促纖溶作用減弱.脂蛋白A含纖溶酶樣載脂蛋白A，可結合低密度脂蛋白.脂蛋白A抑制PLG結合到Annexin分子上，降低纖溶酶產生，導致纖維蛋白溶解障礙，促使進展性動脈粥樣硬化發生.另外同型半胱氨酸的含量增多會引起血管栓塞形成，這主要是由于同型半胱氨酸會競爭性抑制tPA和Annexin的結合，從而減少纖溶酶產生，影響正常纖溶，使體內形成血栓.32癌癥越來越多的研究說明，Annexin與癌癥有著親密關系.腫瘤細胞中可觀察到Annexin表達增加從而激

16、活纖溶酶原，導致腫瘤細胞易出血和轉移才能增強從而出現癌變.在多種類型的腫瘤中都可觀察到Annexin的表達異常，如在胰腺癌、結腸癌、乳腺癌、胃癌、腦星型膠質細胞瘤、小細胞肺癌中表達上調，在食管癌、前列腺癌中表達下調等.各類癌癥中的表達異常各有不同的機制，有些作用機制還沒有比擬準確的解釋.比方食管鱗狀細胞癌可能是由于Annexin通過對胞內鈣離子的調控作用影響鈣離子控制的細胞生長、角化、分化.Annexin的RNA和蛋白均在食管鱗癌組織中低表達，在中分化和低分化腫瘤中，蛋白表達明顯低于高分化腫瘤.所以Annexin在食管鱗狀細胞癌中的表達可能與鱗狀細胞的分化程度有關18.而在前列腺癌中觀察到An

17、nexin下調那么是DNA甲基化引起的.大多數癌癥中可觀察到的Annexin上調.在胃癌細胞衍生出的細胞系中，觀察到Annexin的高表達與erbB2的高表達、分化、轉移以及預后不良相伴19.Annexin和它的結合蛋白S100A10都可直接與胚癌抗原黏附分子1EAA1反響，這種上皮細胞黏附分子會在結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌中下調.肺癌患者的呼吸道纖毛、胸膜間皮細胞以及I型、型肺泡上皮細胞上都有Annexin的高表達20.它在腫瘤細胞外表與組織蛋白酶原反響，促進細胞外蛋白溶解，易化腫瘤的浸潤轉移.在肺癌患者血清中檢測到了Annexin的自身抗體21，而以往的研究并未發現這種自身抗體在病理狀

18、況下有表達，這提示Annexin可能會與自身免疫疾病有關.在胰腺癌細胞中，Annexin的高表達局限在表達增殖細胞核抗原PNA的細胞內的，充分說明該蛋白與細胞增殖相關22.較早的研究中將肝細胞癌中Annexin含量與正常肝臟、胚胎肝組織以及損傷后再生修復的鼠細胞中的含量作了比照，結果發現癌細胞中Annexin含量非常豐富.33抗炎癥作用Annexin的抗炎癥作用主要表達在它對磷脂酶2PhsphlipaseA2,PLA2的抑制作用.在炎癥反響中，花生四烯酸(arahidniaid,AA)會在PLA2作用下釋放出來，后經環氧化酶途徑和脂質氧化酶途徑生成前列腺素和白三烯，以及通過其他途徑生成的脂毒素

19、等代謝產物，從而發揮炎癥介質作用.Annexin無論以單體還是以四聚體形式存在都可對PLA2活性產生抑制性作用，尤以四聚體抑制性作用更強.有研究說明四聚體形式中的p11亞基具有比Annexin單體更強的抑制作用，所以四聚體形式的Annexin更能發揮抗炎癥作用23.同家族的AnnexinI在抗炎癥方面亦有很大作用.34糖尿病研究糖尿病的實驗中，Annexin,Annexin以及大量細胞骨架重建蛋白可與質膜結合形成葡萄糖加合物，這種糖基化作用會改變內皮細胞膜的流動性24.另有研究說明在體外培養的大動脈內皮細胞外表，大量葡萄糖會誘導Hsp90與Annexin結合.Annexin在纖溶系統中生理功能

20、會因這種變化無法正常發揮，從而引起糖尿病的并發癥血栓形成，導致許多糖尿患者死亡25.另外依賴胰島素和肌動蛋白的轉糖體GLUT4在脂肪細胞中的轉運作用也需要Annexin輔助，假設Annexin表達失調，會間接促進糖尿病及其各種并發癥發生.4總結對Annexin的研究可追溯到20世紀80年代，二十年時間里，對該蛋白的認識不斷更新.對Annexins家族的病理研究進步顯著以致于有了annexinpathies的概念26，這充分顯示了該家族蛋白在機體中的重要地位.但是仍有很多問題有待解決，例如，Annexin分泌確實切機制，它在癌癥中終究扮演了什么樣的角色，是否可以提供新的藥物治療靶點等都還需要深化

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