1、dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第1頁二、方法與過程 1.制雞血細胞液（活雞鮮血經分離或沉淀取得）0.1g/mL檸檬酸鈉100mL活雞鮮血180mL500mL燒杯中，玻棒攪拌，離心、分離或靜置沉淀。2.提取DNA。取血細胞5-10mL20mL蒸餾水，用玻棒沿一個方向快速攪拌。紗布過濾：濾液中含DNA和其它核物質，如蛋白質。原理：血細胞細胞膜、核膜吸水脹破，玻璃棒快速攪拌，機械加速血細胞破裂。.提取血細胞核物質：.溶解核內DNA： 濾液2mol/LNaCl溶液40mL，玻棒沿一個方向輕緩攪拌。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第2

2、頁.析出含DNA粘稠物：.濾取含DNA粘稠物：. DNA粘稠物再溶解： 在上述溶液中緩緩加入蒸餾水，并沿一個方向輕輕攪拌，出現絲狀物；當絲狀物不在增加時，停頓加水（此時NaCl溶液濃度相當于0.14mol/L）。 用多層紗布過濾，含DNA粘稠物留在紗布上。 20mL2mol/LNaCl溶液步驟含DNA粘稠物在20mL燒杯中輕緩攪拌3min，使盡可能多DNA溶解在NaCl溶液。.過濾含有DNANaCl溶液： 用放有兩層紗布漏斗過濾步驟所得溶液，濾液中含有DNA。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第3頁.提取含有雜質較少DNA： 步驟所得濾液體積分數為95%冷卻酒精50mL，用玻棒沿一個

3、方向輕緩攪拌，溶液中（析出）出現乳白色絲狀物，用玻棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸收上面水分。3.DNA判定： 加入二苯胺試劑4mL，用玻棒攪拌使DNA溶解，沸水浴5min，觀察溶液是否出現淺藍色。1.共有“三次過濾，兩次析出，七次攪拌”2.加入“兩次蒸餾水，三次NaCl溶液，一次酒精”三、試驗小結dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第4頁四、試驗原理拓展介紹。1.DNA釋放。 DNA主要在雞血細胞細胞核內，正常情況下不會釋放出來，蒸餾水對于雞血細胞是一個低滲液，水分能夠大量進入血細胞，使之脹破，同時加上玻璃棒快速攪拌機械作用，加速血細胞細胞膜和核膜破裂。但釋放出來大量DNA與RNA、蛋白質

4、結合在一起，即釋放不是純凈DNA，常稱為DNA核蛋白。2.DNA與蛋白質分離。 在高濃度（2mol/L）氯化鈉溶液中，核蛋白易溶解，析出DNA并溶解在高濃度氯化鈉溶液中3.DNA析出與獲取。 因為DNA在低濃度（ 0.14mol/L ）氯化鈉溶液中溶解度小，而蛋白質在其中溶解度大。所以在向含DNA高濃度氯化鈉溶液中加入大量蒸餾水稀釋氯化鈉溶液，從而使DNA溶解度下降，蛋白質溶解度增高。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第5頁4.DNA再溶解。用高濃度（2mol/L）氯化鈉溶液再溶解DNA粘稠物。5.DNA沉淀和濃縮。 對于除去了蛋白質DNA氯化鈉溶液，必須再深入沉淀和濃縮，常見酒精沉

5、淀法。即往含有NaDNA溶液，加入體積分數為95%冷卻酒精，混勻后能夠使DNA沉淀、濃縮，形成含雜質較少DNA絲狀物，懸浮于溶液中。若絲狀物較少，可將混合液再放入冰箱中冷卻幾分鐘即可。濃縮后DNA絲狀物能夠用玻棒（玻棒有吸附DNA作用）緩緩旋轉方法卷起。6.DNA判定。100DNA二苯胺 藍色物判定時藍色深淺與溶液中DNA含量多少相關。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第6頁方法步驟 加入物質 目標 1.制備雞血細胞液 檸檬酸鈉溶液 2.提取雞血細胞細胞核物質 20 m1蒸餾水 3.溶解細胞核內DNA 2 m1LNaCI溶液40mL 4.析出含DNA黏稠物 蒸餾水 5.濾取含DNA黏

6、稠物 6.將DNA黏稠物再溶解 2 molLNaCl溶液20 mL 7.過濾含DNANaCl溶液 8.提取含有雜質較少DNA 冷卻95酒精50 mL A:(1)向試管中加入0.015 molLNaCl溶液5mL (2)加入DNA (3)4 mL二苯胺試劑 9.DNA判定 B:(1)向試管中加入0.015molL NaCl溶液5mL (2)4 mL二苯胺試劑 dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第7頁加入檸檬酸鈉溶液目標是預防血凝固加速血細胞破裂 溶解DNA 使2mol/LNaCl溶液稀釋至0.14mol/L使得DNA最大程度地釋出 使含DNA黏稠物被留在紗布上使含DNA黏稠物盡可能多溶

7、解于溶液中除去含DNA濾液中雜質提取DNA A出現藍色 B無改變dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第8頁2.試驗中NaCl物質量濃度為2 molL和0.14 molL對DNA有何影響?1.在DNA粗提取試驗過程中，兩次向燒杯中加入蒸餾水作用是( )。A.稀釋血液、沖洗樣品B.使血細胞破裂、降低NaCl濃度使DNA析出C.使血細胞破裂、增大DNA溶解量 D.使血細胞破裂、提取含雜質較少DNA答：B答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第9頁3.DNA遇二苯胺(沸水浴)會染成( ) A.磚紅色 B.橘黃色 C.紫色 D.藍色4.提取雞血中DN

8、A時，為何要除去血液中上清液?答：DNA提取，關鍵是對雜質去除，因為上清液是血液中血漿個別，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白質)。答：Ddna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第10頁(一) PCR原理體內DNA復制:模板DNA原料: dNTP酶: 解旋酶、DNA pol. 起始引物、合成方向合成環境dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第11頁解鏈模板變性引物-起始引物-模板復性子鏈延伸子鏈延伸(一) PCR原理dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第12頁結果分析與評價此為紫外光吸收檢測結果檢驗法，實踐中極少用；普遍采取瓊脂糖凝膠電泳法檢驗PCR結果dna的粗提取與鑒

9、定pcr蛋白質的提取與分離第13頁Fig. 7.23DenatureAnneal PCR PrimersExtend PCR Primersw/TaqRepeatdna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第14頁多聚酶鏈式反應（PCR） 擴增DNA片段 dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第15頁一、試驗目標 了解PCR基礎原理，學習PCR基礎操作技術。 dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第16頁二、試驗原理 多聚酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction， 簡稱PCR）是體外酶促合成特異DNA片段一個方法。經典PCR由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三步反

10、應組成一個循環周期，經過屢次循環反應，使目標DNA得以快速擴增。其原理以下：將待擴增DNA置于高溫下使之解鏈，人工合成兩個寡核苷酸引物在低溫下分別與目標片段兩側兩條鏈互補結合；DNA聚合酶在72將單核苷酸從引物3端開始摻入，沿模板53端方向延伸，合成DNA新互補鏈。重復進行這種變性、退火和延伸反應循環，可使兩引物限定范圍內DNA序列以指數形式擴增。循環次數主要取決于模板濃度，從理論上講一個模板DNA分子經20次循環擴增后可達106。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第17頁PCR基礎原理 變性、復性、半保留復制一生二，二生四，四生萬物 PCR三步曲變性 9097退火 4565延伸 7

11、2左右PCR過程dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第18頁(二) PCR反應過程變性-復性-延伸多重循環(n)模板以2En擴增短片段以指數式擴增長片段以線性式擴增最終主產物片段長度在P1-P2之間dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第19頁PCR技術廣泛應用于分子生物學等各個領域。它既可用于基因分離、克隆和核苷酸序列分析，又可用于突變體和重組體構建、基因表示調控和研究、基因多態性分析、遺傳病和傳染病診療、腫瘤機制探索及醫學判定等多方面，也被廣泛利用于刑偵物證判定、親子判定及古分子系統學研究等其它領域。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第20頁高中生物技術實踐課件血紅

12、蛋白提取和分離dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第21頁 本課題學習目標 體驗從復雜體系中提取生物大分子基礎過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子基礎原理。1、主要概念：凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們在血紅蛋白提取中分別起到什么作用。2.主要原理：凝膠色譜法分離蛋白質原理 電泳法分離樣品原理 緩沖溶液組成和作用機理3、課題重點：凝膠色譜法原理和方法 4、課題難點：樣品預處理 色譜柱填料處理和色譜柱裝填。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第22頁 年4月14日宣告人類基因組序列圖完成，這標志著進入了后基因組和蛋白質組時代人類基因組：指DNA分子所攜帶全部遺傳信息

13、 蛋白質組：生物個體表示蛋白質分子總和。主要是對蛋白質功效研究dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第23頁血液血漿水 分固體物質：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細 胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90）兩個肽鏈兩個一肽鏈四個亞鐵紅素基團2.提問：血液有哪些成份？ 1.提問：用雞紅細胞提取DNA，用人紅細胞提取血紅蛋白原因是什么？ 雞紅細胞含有細胞核，含有DNA，便于進行DNA提??；人紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第24頁血紅蛋白兩個肽鏈兩個一肽鏈四個亞鐵紅素基團每個肽鏈圍繞一個亞鐵血紅素基團，

14、此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白特點：dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第25頁1.分離生物大分子基礎思緒： 選取一定物理或化學方法分離含有不一樣物理或化學性質生物大分子。2.蛋白質分離和提取原理： 依據蛋白質各種特征差異，如分子形狀和大小、所帶電荷性質和多少、溶解度、吸附性質和對其它分子親和力等等，能夠用來分離不一樣種類蛋白質。 一、血紅蛋白提取和分離3.高溫滅菌和酒精滅菌結果： 使微生物蛋白質發生變性、蛋白質空間結構被破壞。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第26頁（一） 凝膠色譜法（分配色譜法）2.凝膠： 大多數凝膠是由多糖

15、類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）組成多孔小球體，內部有許多貫通通道。 依據被分離物質蛋白質相對分子質量大 小，利用含有網狀結構凝膠分子篩作用，來進行分離。1.概念：3.凝膠色譜法原理分子篩效應： 當相對分子量不一樣蛋白質經過凝膠時，相對分子量較小蛋白質輕易進入凝膠內部通道，旅程較長，移動速度較慢;而相對分子量較大蛋白質無法進入凝膠內部通道，只能在凝膠外部移動，旅程較短，移動速度較快。相對分子質量不一樣蛋白質分子所以得以分離。依據特征是：蛋白質分子量大小。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第27頁4.凝膠色譜法分離蛋白質原理和詳細過程dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第28頁 （

16、二）緩沖溶液 1.概念: 在一定范圍內，凡是能夠抵制外加少許強酸或強堿影響使原來溶液PH值基礎保持不變混合溶液。 能夠抵制外界酸和堿對溶液PH值影響，維持PH基礎不變。2.作用:3.緩沖溶液配制: 通常由12 種緩沖劑溶解于水中配制而成。調整緩沖劑使用百分比就能夠制得在不一樣PH范圍內使用緩沖液。 4.提問：在本課題中使用緩沖液是:_ ,其目標是: 利用緩沖液模擬細胞內PH環境，確保 血紅蛋白正常結構和功效，便于觀察(紅色)和科 學研究(活性)磷酸緩沖液dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第29頁 緩沖溶液組成及分類弱酸及其對應鹽：弱堿及其對應鹽：多元弱酸酸式鹽及其對應次級鹽:H2CO

17、3NaHCO3 ；CH3COOHCH3COONaNH3H2ONH4CL ; NH4OHNH4CLNaHCO3Na2CO3 ；NaH2PO4Na2HPO4 緩沖溶液由足夠濃度共軛酸堿對組成。其中，能反抗外來強堿稱為共軛酸；能反抗外來強酸稱為共軛堿。這一共軛酸堿通常稱為緩沖對、緩沖劑或緩沖系。常見緩沖對主要有以下三種類型：dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第30頁 （三） 電泳：1.概念：帶電粒子在電場作用下發生遷移過程。2.原理： 許多主要生物大分子，如多肽、核酸等都含有可解離基團，在一定PH下，這些基團會帶上正電或負電。在電場作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反電極移動。電泳利

18、用了待分離樣品中各種分子帶電性質差異以及分子本身大小，形狀不一樣，使帶電分子產生不一樣遷移速度，從而實現樣品中各種分子分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第31頁 在電場作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反電極移動瓊脂糖凝膠電泳示意圖dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第32頁 聚丙稀酰胺凝膠電泳 1、在測定蛋白質分子量時常見十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳。聚丙稀酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發劑和催化劑作用下聚合交聯成含有三維網狀結構凝膠。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與

19、分離第33頁 蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中遷移率取決于它所帶凈電荷多少以及分子大小等原因。 （SDS作用）為了消除凈電荷對遷移率影響，能夠在凝膠中加入SDS。2.原理： 聚丙稀酰胺凝膠電泳 SDS能使蛋白質發生完全變性。由幾條肽鏈組成蛋白質復合體在SDS作用下會解聚成單條肽鏈，所以測定結果只是單條肽鏈分子量。SDS能與各種蛋白質形成蛋白質SDS復合物，SDS所帶負電荷量大大超出了蛋白質分子原有電荷量。因而掩蓋了不一樣種蛋白質間電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子大小。3. SDS作用機理:dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第34頁用SDS測定蛋白質分子量方法 使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

20、測定蛋白質分子量時，可選取一組已知分子量標準蛋白同時進行電泳，依據已知分子量標準蛋白電泳區帶位置，用電泳遷移率和分子量對數作標準曲線，能夠測定未知蛋白質分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量標準蛋白試劑出售。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第35頁 二、試驗操作樣品處理粗分離純化純度判定1.樣品處理：（一）蛋白質提取和分離步驟（二）操作過程 本課題可選取豬、牛、羊或其它脊椎 動物血液來分離血紅蛋白。(1)紅細胞洗滌:洗滌目標: 去除雜蛋白，以利于后續血紅蛋白分離純化，洗滌次數不可過少。洗滌操作： 1、采集血樣。2、低速短時間離心（速度越高和時間越長，會使白細胞和淋巴細胞等一

21、同沉淀，達不到分離效果）3、吸收血漿：上層透明黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積質量分數為0.9氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時間）6、重復4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌潔凈。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第36頁(2)血紅蛋白釋放： 加蒸餾水到原血液體積，再加40體積甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液： 過程：將攪拌好混合液轉移到離心管內，以r/min速度離心10 min。試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（白色薄層固體）；第3層（

22、中下層）：血紅蛋白水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質沉淀層（暗紅色）。分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層紅色透明液體。 二、試驗操作dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第37頁甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第38頁(4)透析： 過程：取1ml血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml物質量濃度為20mmol/l磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。透析目標：除去樣品中分子量較小雜質。 二、試驗操作dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取

23、與分離第39頁2.凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱制作： 取長40厘米，內徑1.6厘米玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管一端。注意事項：底塞中插入玻璃管上部不得超出橡皮塞凹穴底面，不然難以鋪實尼龍網，還會造成液體殘留，蛋白質分離不徹底。頂塞制作：打孔安裝玻璃管。組裝：將上述三者按對應位置組裝成一個整體。安裝其它從屬結構。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第40頁 （2）凝膠色譜柱裝填 凝膠選擇：A、材料：交聯葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠交聯程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠得水值，即每

24、克凝膠膨脹時吸水7.5克。 凝膠前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。 凝膠色譜柱裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性裝填入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡可能緊密，以降低凝膠顆粒之間空隙。 2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質洗脫次序，降低分離效果。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第41頁 洗滌平衡：裝填完成后，馬上用緩沖液洗脫瓶，在50cm高操作壓下，用300ml20mmol/l磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時

25、。注意：1、液面不要低于凝膠表面，不然可能有氣泡混入，影響液體在柱內流動與最終生物大分子物質分離效果。2、不能發生洗脫液流干，露出凝膠顆粒現象。 （2）凝膠色譜柱裝填50cm高dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第42頁（3）樣品加入與洗脫 調整緩沖液面：打開下端出口，使柱內緩沖液遲緩下降到與凝膠面平齊，關閉出口。 滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁圍繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。 樣品滲透凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲透凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。 洗脫：小心加入pH=7.0 20mmol/l磷酸緩沖液到適當高度

26、，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。 搜集：待紅色蛋白質靠近色譜柱底端時，用試管搜集流出液，每5ml搜集一試管，連續搜集。（在分離過程中，假如紅色區帶均勻一致移動，說明色譜柱制作成功） 注意：正確加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁圍繞移動。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第43頁（3）樣品加入與洗脫注意：正確加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁圍繞移動。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第44頁思索下面問題：讓血紅蛋白處于穩定pH范圍內，維持結構和功效。 1、在血紅蛋白整個過程中不停用磷酸緩沖液

27、處理目標是什么？ 2、與其它真核細胞相比，紅細胞有什么特點？這一特點對你進行蛋白質得分離有什么意義？ 血紅蛋白是有色蛋白，所以在凝膠色譜分離時能夠經過觀察顏色來判斷什么時候應該搜集洗脫液。這使血紅蛋白分離過程非常直觀，大大簡化了試驗操作。 3、你能描述血紅蛋白分離完整過程嗎？ 血紅蛋白提取和分離程序可分為四大步，包含：樣品處理、粗分離、純化和純度判定。首先經過洗滌紅細胞、血紅蛋白釋放、離心等操作搜集到血紅蛋白溶液，即:樣品處理；再經過透析去除分子量較小雜質，即樣品粗分離；然后經過凝膠色譜法將相對分子質量較大雜質蛋白除去，即:樣品純化；最終經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度判定。dna的粗提取與鑒定p

28、cr蛋白質的提取與分離第45頁（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳2.試劑配制：判定血紅蛋白純度。1.目標： 丙烯酰胺和N, N-甲叉雙丙烯酰胺: 用去離子水配制29%（29 g/100 mL，下同）丙烯酰胺和1%N, N-甲叉雙丙烯酰胺貯存液。十二烷基硫酸鈉（SDS）: 用去離子水配成10%貯存液，于室溫保留。用于制備分離膠和濃縮膠Tris緩沖液。TEMED ：作用經過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺聚合。用去離子水配制10% 過硫酸銨：作用是提供驅動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需自由基。此溶液須配制新鮮液。Tris甘氨酸電泳緩沖液：25 mmol/L Tris，250 mmol/

29、L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%SDS。樣品處理液： 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巰基蘇糖醇)或用5%巰基乙醇，2%SDS，0.1%溴酚藍，10%甘油。染色液： 0.1%考馬斯亮藍R250，40%甲醇，10%冰醋酸。脫色液：10%甲醇和10%冰醋酸。dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第46頁 1、因為制備凝膠丙烯酰胺和雙丙烯酰胺含有很強神經毒性，而且輕易被皮膚吸收，所以操作必須在通風櫥內或通風處進行。 2、TEMED和過硫酸胺對黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大破壞作用，吞服可致命。 3、在進行電泳操作時一定按照試驗要求

30、和步驟完成。操作時要戴好一次性手套。注意事項：（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳dna的粗提取與鑒定pcr蛋白質的提取與分離第47頁 SDS-聚丙烯酰胺分離膠制備：用去離子水4.6 mL，30%丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8Tris緩沖液2.5 mL，10%SDS 0.1 mL，10%過硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均勻，快速灌注在兩玻璃板間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間(梳子齒長再加0.5 cm)，再在膠液面上小心注入一層水（約高23 mm），以阻止氧氣進入凝膠溶液。分離膠聚合完全后（約30 min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。配制SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液用去離子水2.7 mL，30%丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8Tris緩沖液0.5 mL，10%SDS0.041 mL，10%過硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均勻，直接灌注在聚合分離膠上