1、摘要本的主要內容是基于新型納米材料石墨烯為基礎，并借助石墨烯的單分子及單層特點作為 DNA 生物傳感器的載體及保護劑，并借助 DNA 分子雜交技術、DNA 循環(huán)相結合，研制出高靈敏度、高選擇性的新型生物傳感器，對特定生物分子如茶堿、TPP（硫胺素焦磷酸）進行選擇性地識別和測定，并且可以為許多疾病的臨床早期提供理論基礎，比如進行細胞凋亡酸化的檢測。第一章，主要列舉了石墨烯的發(fā)現與研究進展，方法及最前沿的應用。石墨烯的發(fā)現具有極其重要的意義，可能是改變世界的新材料。接下來簡要概述了 DNA 的組成與分類、核酸內切酶的簡介及作用并簡單介紹了聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，激光共聚焦顯微鏡與熒光化學分析等方法

2、。對 DNA 轉錄，及核酶（RNA）做了說明。第二章，以溶液的酸度的變化為動力，來實現對 DNA 探針在雙螺旋與三螺旋狀態(tài)之間的變化的驅動。當反應體系溶液酸度為堿性時，DNA 納米探針表現為雙螺旋狀態(tài)，-綠、熒光淬滅劑分別位于長鏈 DNA 的兩端，兩者互不靠近可以檢測到熒光。當反應體系溶液為酸性時，DNA 納米探針轉變?yōu)槿菪隣顟B(tài)，羅丹明-綠和淬滅劑相互靠近，熒光被猝滅，檢測到的熒光信號變低。熒光被猝滅后，繼續(xù)向溶液中加入堿性緩沖液（NaOH），改變溶液酸度后分子探針重新變?yōu)殡p螺旋狀態(tài)，可以重新檢測到高強度的熒光信號。通過不斷加入堿、酸來調節(jié)溶液酸度可以不斷的循環(huán)驅動 DNA 探針的運動。構建

3、將探針。變化轉變機械動力的 DNA第三章，以之前構建的 DNA 納米分子探針為基礎，其中長鏈 DNA 只有一端接有-綠，另一端沒有接熒光淬滅劑。石墨烯作為傳感器載體，可以使探針通過細胞膜進入細胞而不被破壞。石墨烯是目前已知最薄最堅硬的材料，其單層的石墨分子結構可以吸附單鏈 DNA 分子并可以吸收熒光基團到其空隙中以淬滅熒光。通過藥物硫酸長春新堿誘導細胞程序性引起細胞內環(huán)境溶液的酸化，借助觀察細胞形態(tài)變化及進入細胞細胞內探針熒光強度的變I化來定性地檢測細胞的凋亡。第四章，以重組質粒為模版，NTP 為原料利用 DNA 轉錄技術設計產生大量核酶（RNA），并設計利用 DNA 剪切酶實現循環(huán)放大的原理

4、，實現檢測茶堿和 TPP等小分子活性物質的技術。核酶在茶堿存在的條件下會自斷裂脫落一小段 RNA片段，可以與石墨烯競爭雜交已吸附的帶熒光的單鏈 DNA，從而實現觀測熒光的變化。TPP 檢測原理與茶堿類似，在沒有 TPP 存在條件下，特定核酶（RNA）序列會自斷裂一段 RN段，可以定性的檢測 TPP 和茶堿的存在。第五章，本的主要內容是基于新型納米材料石墨烯為基礎，并借助石墨烯的單分子及單層特點作為 DNA 生物傳感器的載體及保護劑，并借助 DNA 分子雜交技術、DNA 循環(huán)相結合，研制出高靈敏度、高選擇性的新型生物傳感器。：石墨烯；細胞凋亡；轉錄；核酶；熒光；生物傳感器IITHE BIOSEN

5、SOR BASED ON GRAENE AS ACARRIER FOR DETECTION OF APOPTOSIS ANDSMALL MOLECULESAbstractThe main content of this pr is based on a new nanometer material graene,With the help of single molecules and graene monolayer characteristics as carrierand protective agent DNA biosensor, and using DNA hybridizatio

6、n, DNA replicationcycle combination, we developed a new type of biosensor with high sensitivity, highselectivity, for specific biological moleculessuch as theoylline, thiaminepyroosate selective recognition and measurement, and can be for many diseasesand provide a theoretical basis for clinical ear

7、ly diagnosis, detection of apoptosisacidification.1. Thechapter, mainlyroduthe development and research of graenediscovery, synthesis method and application of cutting-edge. The discovery ofgraene has the extremely vital significance, may be a new material to change theworld. Then the pr provides a

8、brief overview of theroduction and the role of thecomition and the classification, DNA endonuclease and a briefroduction of thepolyacrylamide gel electrooreticysis, confocal microscopy and fluorescencechemicalysis method. To explaine transcription of DNA, and ribozyme (RNA) .2. The second chapter, w

9、ith changes in the solution ofas the driving force,through the acidity changes to drive change betn the double helix and three helicalse molecular machines. When thevalue of solution reaction system is basic,DNA nano machine performance for the double helix s e, Rhodamine Green, BHQ located at both

10、ends of long chain DNA, the two do not close can be detected by fluorescence. When close to the reaction system for the transformation of acidic solution of DNA nano machines for the three spiral Rhodamine Green and BHQ, thefluorescence is quenched, signal low. Continue adding alkali, acid can be co

11、ntinuouslycycle.To construct a DNA sensor withchanges aser.III3. The third chapter, A duplex-triplex switchable DNA nanomachine was fabricatedand has been appd for the demonstration ofracellular acidification and apoptosisof Ramos cells, with graene oxide (GO) not only as transporter but also asfluo

12、rescence quencher. The machine constructed with triplex forming oligonucleotide(TFO) exhibited duplex-triplex transition at differentconditions. By virtue of theremarkable difference in affinity of GO with single-stranded DNA (ssDNA) andtriplex DNA and the super fluorescence quenching efficiency of

13、GO, the nanomachinefunctions as a Moreover, takingduplex-triplex/GOsensor based on fluorescence resonance energy transfer (FRET).advantage of the excellent transportroperty of GO,thecell andnanomachine was used to sensechanges inside Ramosduring apoptosis. Fluorescence images showed different result

14、s betn livingapoptotic cells, illustrating the potential of DNA scaffolds responsive to more complex triggers in living systems.4. The forth chapter, A structure-switching-based approach for the design offluorescent biosensors from known RNA aptazymes were demonstrated for thedetection of theoylline

15、 and TPP. Taking advantages of the ability of graene oxide(GO) to protect ssDNA from nuclease cleavage and the cyclicby deoxyribonuclease I (DNase I), the assay was highly sensitivelificaiton inducedlified.heabsence or presence of, the-dependenmmerhead aptazyme cleaves off.The released SD sequence w

16、asroducedo the detection system, in which a FAMlabeled probe ssDNA was noncovalently assembled on GO, and the fluorescence of thedye was compley quenched.he presence of the released sequence, the bindingbetn the dye-labeled DNA and the SD sequence alter the conformation ofdye-labeled DNA, and distur

17、b theeraction betn the dye-labeled DNA and GO,liberating dye-labeled DNA from GO. The fluorescentensity was increased,whereupon the DNase I can cleave the free DNAhe DNA/RNA complex, therebyliberating the fluoroore and ultimay releasing the SD RNA sequence. Thereleased SD RNA sequence then binds ano

18、ther DNA probe, and the cycle starts anew,which leads to significantlification of the fluorescent signal. The approach opensup a wide range ofentities.sibilities for sensing of other small molecules in biological5. The fifth chapter, The main content of this thesis is based on the new nanomaterial g

19、raene as a foundation, and in accordance with the characteristics of singlemolecule and single layer of graene as a carrier of the DNA biosensor andIVprotective agent, and with the help of a DNA molecule hybridization technique,combining the circular DNA replication, developedselectivity new biosens

20、orsthe high sensitivity, highKeywords:graene ;apoptosis ;transcription ;ribozyme ;fluorescence;sensor ;V目錄第一章 綜述1石墨烯簡介1石墨烯的研究進展21.1.21.1.31.1.41.1.54石墨烯的石墨烯的前沿應用4石墨烯的利用價值7石墨烯作為載體的理論依據10DNA 簡介12DNA 的組成12DNA 的結構12DNA 分子機器簡介13DNA 分子機器分類13DNA 分子機器原理141.4 核酸內切酶151.4.11.4.21.4.3內切酶簡介15內切酶的作用15內切酶的應用161.5

21、DNA 傳感器主要表征技術161.5.11.5.21.5.3熒光檢測16聚丙烯酰胺電泳17激光共聚焦顯微鏡171.5.3.11.5.3.21.5.3.3共聚焦顯微鏡簡介18共聚焦顯微鏡原理18共聚焦顯微鏡主要用途181.6 核酶19核酶簡介19核酶的應用及前景19變化驅動的傳感器的研究21第二章 基于2.1 摘要21實驗部分21儀器與試劑21實驗方法222.2.2.1 DNA 分子機器的222.2.2.2 分子機器的熒光檢測2222.2.3 分子機器的電泳檢測222.3 結果與23實驗原理23反應時間對分子機器生成的影響232.3.3 分子機器在不同中的熒光強度變化242.3.4 分子機器的可

22、逆性驗證252.4 小結26第三章 基于變化驅動的傳感器檢測細胞凋亡273.1 摘要273.2 實驗部分273.2.13.2.23.2.3材料與試劑27實驗儀器28實驗方法283.2.3.1DNA傳感器的283.2.3.23.2.3.33.2.3.43.2.3.5石墨烯的29分子機器的熒光檢測29Ramos 細胞的培養(yǎng)及處理29硫酸長春新堿誘導細胞凋亡303.2.3.6細胞凋亡后對 DNA-GO 的檢測303.3 結果與303.3.1 DNA-GO 的設計及工作原理303.3.23.3.33.3.43.3.53.3.63.3.73.3.83.3.9石墨烯的表征分析32不同下 DNA 雜交體的變

23、化趨勢33DNA-GO 復合物在不同酸度下的變化34石墨烯的最佳加入量35細胞內石墨烯用量驗證35驗證 DNA-GO 對細胞形態(tài)的影響36DNA-GO 在細胞凋亡過的變化37DNA-GO 在 Hela 細胞凋亡過的變化403.3.10 激光共聚焦顯微鏡的 Z 軸掃描413.4 小結42檢測小分子活性物質43第四章 基于核酶4.1 摘要434.2 實驗部分444.2.14.2.24.2.34.2.4材料和試劑44實驗儀器45Tris 緩沖液配置45石墨烯的454.2.5 DNA-GO 復合物的454.2.6 RNA 轉錄過程454.2.74.2.84.2.9石墨烯與 DNA-GO 混合46設計加

24、入 DNA 剪切酶的放大過程46熒光檢測47變性凝膠電泳檢測47硫胺素焦磷酸（TPP）體系474.3 結果與48實驗原理48石墨烯加入量的選擇484.3.34.3.44.3.54.3.64.3.74.3.84.3.9聚合酶和 NTP 加入量選擇50DEPC 水加入量選擇50DNA 剪切酶加入量的選擇51茶堿加入量的選擇52茶堿體系條件優(yōu)化后的結果52TPP 加入量的選擇53TPP 體系條件優(yōu)化后的結果54核酶與 DNA-GO 復合物反應時間與溫度的選擇55RNA 適體酶的專一性55反應結果的電泳圖564.4 小結58參考文獻59第五章結論66致謝67攻讀學期間的學術目錄68獨創(chuàng)性69關于使用的

25、說明69第一章 綜述石墨烯（Graene）是一種由碳原子的單層片狀結構的新材料。是一種由碳原子以 sp&sp2 雜化軌道組成六角型呈蜂巢晶格的平面薄膜，只有一個碳原子厚度的二維材料。石墨烯不僅是已知材料中最薄的一種，還非常牢固堅硬；作為單質，它在室溫下傳遞電子的速度比已知導體都快。圖 1-1 石墨烯單層結構Fig.1-1 Single layer structure of Graene脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）作為一類重要的遺傳物質，多數生物是以 DNA 做為遺傳信息載體，DNA 的研究是生命科學領域極為重要的研究內容。生物傳感器，是利用生物物質（如蛋白

26、質、酶、DNA、抗原、抗體、生物膜、細胞、微生物等）作為識別元件，將生化反應變成可定量的信號，能夠進行生命物質及化學物質檢測的裝置。其中 DNA 傳感器是以檢測 DNA 為目的的生物傳感器，在、環(huán)境監(jiān)測等方面 DNA 生物傳感器具有巨大的應用潛力，已成為生物傳感器領域中的前沿課題。因為生物傳感器具有分析速度快、選擇性好、靈敏度高、成本特點，特別是它具有集成化、微型化與高度自動化等特點，使其在近幾十年獲得了迅猛發(fā)展。1.1 石墨烯簡介二維材料石墨烯作為一種新型的材料，是由英國曼徹斯特大學的2004 年使用膠帶剝離高定向石墨的方法獲得的1。石墨烯碳原子緊密堆積形成單層二維蜂窩狀晶格，具有超次元蜂窩

27、晶格結構，大的比表面積，以及優(yōu)良的電學、力學、光學和熱學性能2,3。科學家石墨烯在電子、信息、能源、材料和生物1等領域具有重要的應用前景。目前，在國內外石墨烯的主要方法有機械分割方法，外延晶體生長法、化學氣相沉積法、氧化石墨的熱膨脹和還原方法，4。還有其他方法也在發(fā)展中，如氣相沉積、等離子體技術、靜電高溫高壓還原氧化石墨石墨烯的方法成本低、規(guī)模大、目前是最經濟的方法。在可以以天然石墨為原材料、制造的低成本和高性能的石墨烯氧化物材料作為淬火劑。1.1.1 石墨烯的研究進展石墨烯是 2004 年才剛剛被發(fā)現的碳晶體中的新成員，集多種優(yōu)異特性于一身，其電子遷移率高于硅材料兩個級數5，完全有望替代半導

28、體工業(yè)中的硅材料。然而，石墨烯作為零帶隙半導體，能否有效調控其電學性質決定著這種新材料在微電子等行業(yè)的應用前途。目前，國家納米科學中心的研究正在對其物理性質進行研究6，并有意將相關的納米器件應用于傳感領域，實現無標記高靈敏度的生物分子檢測，其研究工作己被 Nature Publishing Group(NPG)Asia Materials7作為特色研究進行。摻雜是被認為是一種有效的控制石墨烯電氣性能段，石墨烯具有二維蜂窩狀的完整結構，其摻雜帶來很大的。為了解決這個問題，研究在國家納米科學中心利用離子注入技術使石墨烯碳原子通過高能離子轟擊產生空位缺陷。然后，在氮氣保護中高溫退火，從氨氣分解產生的

29、氮原子來填補空位缺陷的碳原子，實現石墨烯摻雜氮原子。有氮原子摻雜的石墨烯場效應器件具有 n 型電導性能，除了通過調整離子注入劑量、退火溫度和其他條件，實現精確控制原子摻雜8 - 10，對于石墨烯的理論研究和實際應用具有十分重要的意義。合肥物質科學研究方面11。研究對石墨烯的研究主要體現在基于石墨烯的新拓撲結構在國家自然科學基金和國家科學研究計劃(973 項目)帶的結構特征及特性進行了深入的研究12,13。資助下，對基于石墨烯的研究結果顯示，石墨烯納米帶可以形成穩(wěn)定的結構，帶的結構會隨著石墨烯納米帶的長寬比變化而變化。在一定的長寬比以上，石墨烯莫比帶上會有一個平面三角形形成，最大的應變出現在三角

30、形的頂端。在特定長度的條件下，隨著寬度的增加，三角形區(qū)域會越來越擴展，所需的能量也越來越高。當長度與寬度的比例小于 3.46 之后，結構帶是一個2具有三個三角形疊加的結構。在具有鋸齒形邊緣的石墨烯納米帶中，邊緣的碳原子具有局域磁矩，局域磁矩在同一邊內和兩邊之間分別是鐵磁和反鐵磁耦合，因此整個石墨烯納米帶的總磁矩為零。電子結構分析發(fā)現這類帶具有非零的磁矩，這是由于在石墨烯結構中只有一個邊存在，并且邊內的鐵磁耦合強度遠大于兩邊之間的反鐵磁耦合強度所致。由于石墨烯 烯優(yōu)良的物理性質、特殊的拓撲結構以及鐵磁耦合的邊緣態(tài)，電子學、自旋電子學和光學等領域。帶具備石墨此有望應用圖 1-2 單個石墨烯分子圖F

31、ig.1-2 A single graene molecular gra國際機器公司（IBM）的科學家首次拍到單個分子的清晰14，同蘇時可看見把分子結構緊密連在一起的原子鍵。國際機器公司設在的研究用一種名為“非接觸式原子力顯微術”的技術探索一個分子的內部情況，把分子和原子的研究推向最小。這項研究可能對石墨烯設備的研究具有重要意義。石墨烯是人類已知最稠密的物質之一，而石墨烯設備可有助于徹底改變無線寬帶通信和電子顯示屏。原子力顯微術（AFM）的使用原理是讓一個分子扮演“留聲機”一樣的角色，在目標分子的表面上進行“刻畫”，獲得殼層的變化和律動。這根“唱針”是一個一氧化碳分子。顧名思義，它有一個碳和一

32、個氧原子。這種精密測量需要科學家穩(wěn)若盤石，杜絕任何來自或周邊環(huán)境的振動。即使室內溫度的輕微變化，也3會使分子擺動。為把破壞降低到最小程度，實驗區(qū)的溫度被降到零下 268 攝氏度。這些展示了分子的最小結構。較暗區(qū)域代表原子的密集部分，明亮區(qū)域代表最輕部分。拍攝分子結構很可能有助于揭示大量和促進這一技術領域的實際應用。現在，這些已展示出新的細節(jié)信息，例如分子中心附近的原子鍵要比分子邊緣的原子鍵短等。1.1.2 石墨烯的石墨烯的方法主要有機械法和化學法 2 種。機械法包括微機械分離法、取向附生法和加熱碳化硅法，化學法包括化學還原法與化學解理法等。微機械分離法是直接將石墨烯薄片從較大的晶體上剪裁下來，

33、可獲得高品質石墨烯，且成本低，但缺點是石墨烯薄片尺寸不易控制，無法可靠地制造出長度足供應用的石墨薄片樣本，不適合量產。取向附生法是利用生長基質原子結構“種”出石墨烯，石墨烯性能令人滿意，但往往厚度不均勻。加熱碳化硅法能可控地 出單層或多層石墨烯，是一種非常新穎、對實現石墨烯的實際應用非常重要的方法，但大面積具有單一厚度的石墨烯比較。化學還原法15能夠低成本，但很難沒有晶界的高品質石墨烯薄片。備石墨烯的方法，是一種重要的石化學解理法是利用氧化石墨通過熱還原方墨烯方法。化學氣相沉積法提供了一種可控石墨烯的有效方法，其最大優(yōu)點在于可出面積較大的石墨烯片，缺點是必須在高溫下完成，且在制作過，石墨烯膜有

34、可能形成缺陷。而經過改進的微波等離子體化學氣相沉積法，其處理溫度較低，只有大約400，但是仍然不適于量產。韓國、等大都在進行石墨烯方面的研究，如韓國科學家使用化學氣相沉積法，在尺寸、高質量石墨烯薄膜方面取得了突破，生產出高純度石墨烯薄膜，還把它們貼在透明可彎曲的聚合物上，制成了一個透明電極這算得上是化學氣相沉積造石墨烯迄今取得的最大成就之一16；員開發(fā)了制造石墨烯和碳納米管混合材料的新方加州大學洛杉磯分校研究人作出一種新型的石墨烯納米結構介孔石墨烯17，可以用于大規(guī)模生產以介孔石墨烯為基礎的半導體集成電路；研究在硅襯底上制作了石墨烯薄膜。目前，國外石墨烯的研究開始轉入如何降低成本并大規(guī)模階段。

35、1.1.3 石墨烯的前沿應用4研究小組第一次使用研究了 PEG蘇州熒光修飾的納米石墨烯皮膚腫瘤異種移植(NGS)在體內的作用18,19。通過熒光成像技術顯示出在在中 NGS 對腫瘤細胞有著高攝入率。 PEG 功能化的 NGS 表明咋生物溶劑具有高的溶解度和穩(wěn)定性，也被應用在體外載藥和成像。在這些基礎上，他們首先的 PEG 功能化的 NGS 在小鼠體內的熒光成像，同時在幾個不同的皮膚異種移植腫瘤模型中的腫瘤積累中觀察到驚人變化，如增強腫瘤細胞的通透性和效應（EPR）。與碳納米管相比，PEG 功能化的 NGS 顯示出了一些有趣的現象，包括目標識別，以及在網狀內皮組織的較低殘留。 NGS 在近紅腫瘤

36、細胞的有效外光區(qū)的有著較高的光吸收，可以用作體內光熱治療，靜脈注射 NGS 和利用部分低強度的近紅外激光照射腫瘤，可以觀察到非常有效的腫瘤抑制。此外，在毒性研究中，在小鼠進行 PEG 功能化的 NGS 注射后，組織學，血液化學和血液中的分析結果表明，有沒有明顯的副作用。雖然這種新型碳納米材料在體內的表現還需要的認知和慢性毒性研究，但使用的碳納米材料的有效使用靜脈治療在體內作用的熱療法，石墨烯在用。治療等領域提供了更大的潛在的生物醫(yī)學應2008 年 DaiHongjie 研究小組20首次利用 PEG(聚乙二醇)修飾的氧化石墨烯做為低溶解度含芳香結構的抗癌藥物的載體。他們首先將石墨烯氧化獲得了尺寸

37、小于 50 nm 的納米氧化石墨烯(nanoscale gra eneoxide,NGO),再將具有生物相容的 PEG 接到 NGO 上。新型材料石墨烯在生理條件下，包括在在中具有優(yōu)良的生物相容性和穩(wěn)定性。抗癌藥物 SN38(喜樹堿衍生物) 通過-堆垛等物理作用吸附于 PEG 化的NGO 表面，形成石墨烯-藥物復合物。石墨烯只有單原子層的厚度，它的兩個基面都可以作為吸附藥物的載體，所以具有其他納米材料無可比擬的載藥率。研究發(fā)現，NGO-SN38 有優(yōu)良的水溶性，作為藥物載體可以增強難溶性藥物的溶解，且復合物中 SN38 仍保持高度活性。體外實驗發(fā)現 NGO-SN38 可以有效地結腸腫瘤細胞 H

38、CT-116，效果是 CPT-11(依立替康，FDA)的 1000 倍。更重要的是，NGO-PEG 作為抗癌藥物載體沒有明顯的細胞毒性，具有優(yōu)良的生物相容性。5圖 1-3 SN38-PEG-GO 復合物Fig.1-3 SN38-PEG-GO comiteDai21的課題組研究了抗癌藥物阿霉素(DOX) 可以經 PEG 修飾的 NGO 進行靶向輸運。他們將聚乙二醇與 B 細胞單克隆抗體(D20,Rituxan)進行交聯,使NGO-DOX 對腫瘤細胞 Raji B-細胞淋巴瘤(CD20)具有特定的靶向性。實驗表明DOX 與 NGO-PEG-D20 復合物對淋巴瘤細胞具有特異性的性能，可以使大量細胞

39、失活，且高濃度的 DOX (10 molL-1) 比低濃度的 DOX (2 molL-1)具有明顯增強的細胞毒性。22。大學陳永勝研究組試驗了 DOX 在 NGO 上高效負載及可控性的他們研究發(fā)現，NGO 有著極高比表面積，對藥物的負載率可以達到 238%，超過普通載藥材料幾倍以上。NGO 在不同酸度條件下藥物動力學表現不同，為石墨烯作為可控載體提供了重要依據。蘇州納米技術與納米仿生的研究小組研究了氧化石墨烯的生物毒性、可控聯合載藥和靶向輸運等 23。納米級氧化石墨烯可被細胞吸收并且沒有明顯的細胞毒性，對具有芳香結構的小分子藥物具有的吸附作用，阿霉素在石墨烯單層上的載藥率高達 400%，遠高于

40、普通載體，非常適合作為靶向藥物運輸的載體。首先利用化學備納米級別氧化石墨烯，然后化學偶聯生物分子葉酸，可以實現抗癌藥物阿霉素和喜樹堿的可控聯合載藥和生物靶向輸運，而且進6行體外試驗時，發(fā)現聯合載體比單一載體具有更高的腫瘤抑制作用。課題組研究了 NGO 序貫運送 siRNA 和 DOX 24的以以上研究為基礎，能力。首先在 NGO 上修飾上陽離子聚合物，使其可以吸附 siRNA。然后通過靜電作用及-相互作用分別將接有靶向抗腫瘤蛋白Bcl-2 的 siRNA 和 DOX 裝載到 NGO 上。研究發(fā)現, 聚乙烯亞胺修飾的 NGO 運載 siRNA 進入細胞后可以顯著地抑制 Bcl-2 蛋白的表達,序

41、貫運送 siRNA 和阿霉素明顯的協同抗腫瘤效果。圖 1-4 PEI 修飾的氧化石墨烯用于序貫遞送 siRNA 和抗癌藥物阿霉素示意圖Fig.1-4 PEI modified graene oxide is usedhe sequential delivery of siRNA andancer drug doxorubicin基于石墨烯作為藥物載體，由于其的載藥量、靶向輸送性和藥物的可控能力,有望在臨實現實際應用。1.1.4 石墨烯的利用價值（1） “太空電梯”纜線25：石墨烯不僅可以用來開發(fā)和生產薄超輕型飛機材料、像紙一樣薄超級強硬的背心,甚至科學家夢寐以求的 23000 英里的太空電梯都

42、有可能成為現實。碳復合材料在航空航天、汽車等領域、建設等領域有廣泛的用途。（2）代替硅生產電子產品：硅帶領進入數字時代,但研究仍渴望找到7一些新的材料,讓集成電路更小、更快、更便宜。在相當數量的替代材料中,石墨烯表現的最顯著。石墨烯的優(yōu)點有很多,比如強度,透光性光(很薄)和超導電性,它是用于創(chuàng)建一個可彎曲顯示設備和高速電子元件的理想材料。石墨烯現在出現在新型的晶體管、內存和其他組件的原型樣品中。國際商業(yè)機器公司(IBM)已經研制出到運行最快的石墨烯晶體管,IBM 在2010 年12 月發(fā)布了其與麻省理工學院(MIT)聯合研究成果，碳化硅基板上形成的柵極長度 240nm 的石墨烯場效應晶體管的

43、(場效應晶體管),并驗證其截止頻率為 230 兆赫。IBM 計劃將其應用于高頻 RF 元件開發(fā)。Rice 大學研究正在著手研究一類單元密度至少為閃存兩倍的石墨烯片狀器。石墨烯是由沒有卷成納米管的純炭原子薄膜，Rice 大學研究是首次將石墨烯用于架構更簡單的雙端器件。研究發(fā)現，石墨烯是目前已知的材料中導電性能最出色的 26。這種特性適合用于高頻電路。高頻電路現代電子工業(yè)的發(fā)展，電子設備如，由于工程師們正在設法將的信息添加在信號中，因此信號被期望使用更高的頻率，然而的工作頻率越高，熱量產熱量也越高，因此高頻的便受到很大的限制。但是出現了石墨烯這種新材料，高頻的發(fā)展前景似乎變得無限廣闊。石墨烯在微電

44、子領域也具有巨大的應用潛力。研究品，并期望生產超級計算機。已經將石墨烯看作是硅的替代（3）光子傳感器：作為光學傳感器，石墨烯還可以被用來檢測光纖中所攜帶的大量信息。目前光子傳感器基本是硅材料。IBM 的一個研究小組去年 10 月首次了他們所研制的石墨烯光電探測器，順理成章接下來會期望基于石墨烯的能電池和液晶顯示屏27。大合法國 CNR 的研究已經制造出超快鎖模(Mocked)石墨烯激光器28-29。這項研究成果不僅令人意外，而且展示了石墨烯在光電器件上的巨大潛力。（4）納電子器件：極具的室溫彈道場效應管；THz頻率的操作響應；探索單電子器件在同一片石墨烯上集成整個電路。2009 年 BASF

45、與克材料公司30決定對石墨烯復合材料的開發(fā)進行合作研究。BASF 和克公司開發(fā)了高傳導石墨烯用于導電涂層31。兩個的聯合研究將為石墨烯在電子工業(yè)應用的商業(yè)化鋪平道路。它是一種性能優(yōu)異的半導體材料，是將來應用米電子器件最具希望的材料。據物理學家組織網 2010 年 6 月 10 日，科研利用石墨烯制造納米電路領域取得突破性進展32。設計出了簡便、8快速的納米電線制造方法，能夠調諧石墨烯的電學特征，使氧化石墨烯從絕緣物質變成導電物質。曼徹斯特大學的研究用石墨烯制成了分子級電子電路33。石墨烯可以被刻成擁有單個晶體管的電子電路，其尺寸不比分子大多少，晶體管尺寸越小，其功能越強。研究還表示，從氧化石墨

46、烯到石墨烯的簡單轉換是制造導電性納米線的重要途徑，其不僅可應用于軟性電子學領域，還有望用于生產與生物兼容的石墨烯電線，可被用于測量單個生物細胞的電子信號。（5）優(yōu)良的能電池34：因為石墨烯是透明的，用它制造的電板比其他材料具有更優(yōu)良的透光性。透明的石墨烯薄膜可制成優(yōu)良的能電池。格大學開發(fā)出一種制造透明石墨烯薄膜的技術，這是一種幾厘米寬、l5nm 厚的薄膜。石墨烯薄膜是一種平坦的單原子碳薄，可用于取代透明導電的 ITO 電極用于有機能電池。這些薄膜還用于取代顯示屏中的硅薄膜晶體管。石墨烯運送電子的速度比硅快幾十倍，因而用石墨烯制成的晶體管工作得更快、更省電。美國南加州大學的研究開發(fā)了一種柔性碳原

47、子薄膜透明材料，并用它制作出有機電池。（6）其它：理工學院的研究者最近的三項新研究成果表明石墨烯應該用于制造風力渦輪機和飛機機翼的增強復合材料35。石墨烯可用作吸附劑、催化劑載體、熱傳輸，可制成具有精細結構的電子元件，應用于電池電容器，即使在生物技術方面也到應用。2010 年，萊斯大學利用該石墨烯量子點，制作單分子傳感器。萊斯大學將石墨烯薄片與單層氦鍵合，形成石墨烷。氦使導電的石墨烯變換成為絕緣的石墨烷36。研究移除石墨烯薄片兩面的氦原子島，就形成了被石墨烷絕緣體包圍的、微小的導電的石墨烯阱。該導電的石墨烯阱就可作為量子阱。量子點的半導體特性要優(yōu)于體硅材料器件。這一技術可用來制作化學傳感器、能

48、電池、醫(yī)療成像裝置或是納米級電路等。此外，由于石墨烯具有原子尺度的厚度及優(yōu)異的電學性質和極其微弱的自旋一軌道耦合、超精細相互作用的缺失以及對外場敏感等特性，石墨烯還有望在場發(fā)射材等37第一次料、量子計算機以及超靈敏傳感器等領域得到廣泛的應用。Schedin利用石墨烯制成了可以用來探測單個氣體分子的精密化學傳感器，極大的降低了微量氣體檢測的檢測限。石墨烯在過去的幾年內已充分展現出在理論研究和實際應用方面的巨大潛力，迅速成為相關學科領域最為活躍的研究前沿。91.1.5 石墨烯可作為傳感器載體的理論依據圖 1-5 石墨烯吸附DNA 示意圖Fig.1-5 GraeneDNA adsorption on

49、 Graene2011 年，Marissa Wu38-43等人首先發(fā)現了可以利用石墨烯的單層結構來吸附單鏈 DNA 并淬滅接在 DNA 末端的熒光基團（如圖 1-5）。并發(fā)現可有多種方法使 DNA 單鏈脫離石墨烯表面，與 DNA 單鏈完全互補的單鏈 DNA 與之雜交可以使其脫離；對于尺寸小的石墨烯薄片可以使用相同的 DNA 單鏈替換；通過高溫加熱也可以使 DNA 單鏈脫離。圖 1-5 DNA 鏈在石墨烯上的吸附效果圖Fig.1-5 DNA onto GOX10圖 1-6 DNA 從石墨烯脫離Fig.1-6 DNA break away from GOX2010 年課題組同樣進行了利用石墨烯的特

50、殊結構來進行對 DNA 傳感器的快速高效的熒光檢測44-47，如圖 1-6, 在沒有目標物的情況下接有熒光素的 DNA 單鏈會被石墨烯單層結構吸附，如果反應體系中加入了目標物，則 DNA 鏈會優(yōu)先進行雜交反應而不被石墨烯吸附。并模擬了接有熒光基團的 DNA 鏈在石墨烯上的吸附效果圖，如圖 1-5 所示。實驗證明，石墨烯可以作為優(yōu)秀的熒光淬滅劑及 DNA 納米機器保護劑。圖 1-7 氧化鐵-GO-PEG 作為藥物載體進入細胞Fig.1-7 Iron oxide - GO - PEG as drug carrier to enter cells課題組48,49在 2011 年 ，蘇州蘇州納米技術與

51、納米仿生的進行了使用氧化鐵-GO-PEG 作為藥物載體進入腫瘤細胞的實驗（如圖 1-6）。證明了石墨烯的良好的生物相容性，可以作為載體進入細胞內而不破壞細胞結構。111.2 DNA 簡介1.2.1 DNA 的組成脫氧核糖核酸(DNA)，是的主要組成成分。DNA 分子的堿基排列順序代表著生物體的遺傳信息，DNA 決定了生物體的遺傳變異和生長發(fā)育方向。DNA也可以認為是生物遺傳信息的載體。核酸的組成成分是核苷酸。按照核糖的不同可將核酸分類為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA 是由腺嘌呤(A)，鳥嘌呤(G)，胞嘧啶(C) 和胸腺嘧啶(T)四種堿基組成；RNA 是由腺嘌呤(A)，鳥嘌呤

52、(G)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)四種堿基組成。1.2.2 DNA 的結構數量極為龐大的四種脫氧核糖核苷酸通過 3, 5-磷酸二酯鍵連接起來的直線形或環(huán)形多聚體單鏈組成了DNA 的一級結構。DNA 在堿基的組成上服從Chargaff規(guī)則50，即 A 與 T 的量相等，G 與 C 的量相等，并且嘌呤的總數等于嘧啶的總數。兩條單鏈之間通過相對應的堿基對之間的氫鍵作用聯接起來形成雙螺旋結構，就了 DNA 的二級結構（見圖 1-8）。DNA 雙螺旋結構具有極強的穩(wěn)定性，這要是芳香族堿基上的 種穩(wěn)定主要由三種力量實現，堿基堆積結合電子之間的相互作用引起 DNA 分子中的堿基層堆積，導致 DNA 分子形成

53、一個疏水的；互補堿基對之間的氫鍵是維持 DNA 穩(wěn)定的第二種主要作用力；第三種作用力是介質中的陽離子與磷酸殘基上的負電荷之間形成的離子鍵。DNA在二級結構的基礎上，又可通過卷曲或者形成三級結構。核酸的結構直接影和抗癌有關。因此核酸研究，特別是 DNA 的結構水平上了解某些疾病的發(fā)病機理，找出發(fā)病基響到其功能，并被認為與與功能的關系，將幫助人們從因，發(fā)現有效的治療藥物。于 1953 年提出了 DNA 的雙螺旋結構模型51，在分子水平上闡和明了 DNA 的半保留原則。從此有關 DNA 的研究成為了分子生物學和生物化學研究領域的重要課題，DNA 靶向分子與 DNA 之間相互作用曾得到廣泛研究3-6。

54、12圖1-8 DNA分子雙螺旋結構模型Fig. 1-8 The structure of DNA double helix1.3DNA 分子機器簡介DNA 作為遺傳物質，其生化性質和生物學意義已熟知。DNA 首先是一種納米級的分子，一個獨立的智能化體系。在學科交融日益頻繁的當下，越來越多的科學家更加關注于 DNA 的非生物學性質。DNA 以其自身的可編程性、結構多樣性及變化可控性等諸多優(yōu)點活躍中。米科學、生物科學和材料科學等學科在DNA納米技術能化的DNA分子成為現在科學研究的主要目標之一。在生物體系中，DNA分子的自組裝性是形成各種復雜生物結構的基礎，DNA通過自組裝形成了分子水平并具有特殊

55、功能的機器，即DNA分子機器。DNA分子機器具有諸多優(yōu)勢：高度的可設計性、易于組裝、和再加工等。目前，文獻了多種DNA分子機器已經被出來：可以切換結構狀態(tài)的分子機器、可以循環(huán)轉動的分子馬達、分子齒輪，以及可蛋白分子的分子籠，可以產生開合動作的分子鑷子等52,53，所有這些都是由DNA分子組成的，DNA分子機器。也將其通稱為1.3.1 DNA 分子機器分類DNA分子具有多種可以發(fā)生可控的相互轉化的二級結構，DNA的多級結13為構建DNA納米機器的基礎。人們利用這一特點在納米尺度上了多種DNA分子機器。從原理上看，DNA分子機器的驅動要有兩種：其一是以互補DNA單鏈作為，通過自組裝的鏈交換反應來實

56、現分子機器的運轉并實現能量轉換；另一種是以DNA與環(huán)境中的特定分子或離子反應產生的化學能或直接輸入的熱能、光能來驅器進行工作。利用上述兩種驅動原理，人們已經創(chuàng)造設計出多種多樣的DNA分子機器。從能量轉化的控制條件上看，基本可以將 DNA 分子機器分為兩大類：第一類是基于鏈交換驅動的反應裝置。利用 DNA 的自組裝性能出在納米尺度下能夠運動并實現能量轉換的分子機器；第二類是通過環(huán)境刺激響應的 DNA 分子機器，這類裝置的構象取決于溶液中的環(huán)境條件，如酸度值或某種離子的濃度等，因此可以通過加入酸、堿、鹽等辦法來改變溶液的環(huán)境條件即可驅器的運轉。基于鏈交換驅動的DNA分子機器。由于DNA單雙鏈結構間

57、存在明顯的結構差異：DNA單鏈度高、柔性強，易于改變；DNA雙鏈具有一定的剛性，將DNA單雙鏈有機的結合在一起就可以創(chuàng)造出集穩(wěn)定性和可變性于一體的分子機器。另一方面，在適宜的條件中，單鏈DNA會選擇環(huán)境中與其序列最為互補的其他單鏈分子組成雙鏈，因此通過控制雙鏈的形成或破壞就可以實現對分子機器的驅動。（ 、離子濃度等）改變驅動的DNA分子機器。DNA分基于溶液環(huán)境子的二級結構不僅存在著單雙鏈之間的相互轉變，而且可以與特異性的識別序列配對，還可以對不同的環(huán)境條件做出響應，基于這一點，人們成功的設計出了多種通過改變環(huán)境條件來控制驅動的DNA分子機器，如離子濃度變化值的增減、光度控制、溫度調控等等。其

58、中前兩者是利用DNA分子與溶液中離子或質子間的結合能來實現驅動，后兩種是利用外界供給能量來實現驅動。Seeman等設計并合成了第一種由DNA分子組裝的納米機器54，這種納米機器通過構型改變使某個部位發(fā)生旋轉， 了以三條DNA鏈為基礎的“納米”鑷子，利用DNA的堿基互補配對原則，可通過DNA單鏈的添加來控制該鑷子的開啟和閉合。1.3.2 DNA 分子機器原理DNA 有著精確配對、相互識別的特點，更具有雙鏈、三鏈、四鏈等多種二級結構，通過特定的序列設計和人為控制條件可以實現 DNA 的構象變化，從而達到在納米尺度上的可控運動。DNA 分子機器驅動的基礎是 DNA 不同結構之間的可控轉變。14DNA

59、 分子機器是依靠 DNA 自組裝特性人為的可被特定的能量形式驅動并做出某種機械運動的納米級別裝置。DNA 分子機器有許多潛在的應用，如信息處理、生物傳感器、化學反應調節(jié)和分子組裝等。1.4 核酸內切酶核酸內切酶（endonuclease）在核酸水解酶中，為可水解分子鏈磷酸二酯鍵生成寡核苷酸的酶，與核酸外切酶相對應。從對底物的特異性來看，可分為 DNase、DNase等僅分解 DNA 的酶；脾臟 RNase、RNaseT1 等僅分解 RNA的酶。一般來說，大都不具堿基特異性，但也有諸如脾臟 RNase、RNaseT1 等或限制性內切酶能夠識別并切斷特定的堿基或堿基序列的酶。1.4.1 限制性內切

60、酶簡介40 多年前，當人們在對噬菌體（細菌）的宿主特異性的限制-修飾現象進行研究時，首次發(fā)現了限制性內切酶。發(fā)現細菌可以抵御新的，而這種“限制”生存的辦法則歸功于細胞可摧毀外部的 DNA 的限制性內切酶。首批限制性內切酶被發(fā)現包括來源于大腸桿菌的 EcoR I 和 EcoR II，以及來源于 Heamo ilus influenzae 的 Hind II 和 Hind III。限制性內切酶可在特定位點切斷 DNA。在上世紀七十年代內切酶被應用開始，以 NEB 為代表的許多公司便開始尋找的限制性內切酶。限制性內切酶只在某些和原核生物中被發(fā)現。人們正在從成千上萬的細菌和古生菌中尋找新的限制性內切酶