1、實驗二十一 銀染核仁形成區的光鏡和電鏡標本制備及觀察【實驗目的】 通過銀染核仁形成區標本制備和觀察，了解細胞在不同時相中銀染核仁形成區的顯微和亞顯微的形態特征?！緦嶒炗闷贰?一、材料和標本 人外周血淋巴細胞核型標本、HL一60細胞、HeLa細胞。 二、器材和儀器 顯微鏡、電子顯微鏡、超薄切片機、水浴箱、離心機、天平、染色缸、平皿、乳頭吸管、離心管、擦鏡紙。 三、試劑 Carnoy固定液(用時現配)、5N HCl、0.1甲酸、l甲酸、50AgNO3(用時現配)、2蛋白膠、5硫代硫酸鈉、2.5戊二醛、30100梯度乙醇和丙酮、Epon一812包埋劑、醋酸鈾和檸檬酸鉛染液、蒸餾水。【實驗內容】 一、

2、原理和意義 在細胞分裂中期核型中，人的端著絲粒染色體短臂區和在間期細胞核的核仁中有與銀離子特異親合物質，通過銀染可以顯示它們的致量，因此一直被人們所關注。近年來發現，雖然人的端著絲粒染色體短臂是28S、18S、和5.8S rRNA基因存在部位，稱核仁形成區(Nucleolar organizer region，NOR)，但銀染的物質不是rDNA和rRNA，而是與活性的rDNA轉錄有關的一類酸性蛋白質，容易將Ag還原為Ag的顆粒，從而在核仁形成區鍍上銀、呈棕黑色，稱為銀染核仁形成區(SilverStaining nucleolar organizer region，AgNOR)。生化和免疫化學研

3、究證明銀染蛋白是RNA聚合酶I，其功能是催化rDNA轉錄rRNA形成核仁，因此通過這種反應能夠特異顯示rRNA轉錄的活性。 由于銀染核仁形成區方法簡便、特異性強，目前在遺傳、腫瘤、藥物毒理及預防醫學等細胞生物學研究中，均有廣泛應用。特別是電鏡銀染活性核仁形成區技術，可以在同一個細胞中顯示銀染蛋白、活性rDNA和rRNA三者間關系，并在亞細胞水平進行分析。 二、方法 (一)中期染色體核仁形成區的銀染和觀察 1取制備好的正?；蚰[瘤細胞染色體標本，直接放入裝有5N HCl溶液中，常溫處理5分鐘。 2用自來水反復沖洗幾次，甩干，標本面朝上平放在平皿中。 3將0.1甲酸臨用前配制的50AgNO，溶液約0

4、.5ml,用吸管滴在標本上，再蓋上二片擦鏡紙。 4放置平皿于56水浴中處理35分鐘，待擦鏡紙呈棕色后，取出標本用水沖洗、氣干。 5鏡檢 鏡下所見標本背景淺黃色，核型深染，端著絲粒染色體的銀染蛋白存在的部位呈棕黑色顆粒，選擇染色體分散良好，銀染顆粒清楚的分裂相，進行計數單側或雙側有銀染顆粒的染色體數。 人體細胞銀染顆粒有遺傳穩定性，一般正常值為48個核型。 計算方法 NOR 均值=N個核型中含NOR染色體數的和/N個核型 (二)間期細胞核活性核仁形成區的銀染與觀察 1收集培養的HL60細胞和用PHA轉化的人正常外周血淋巴細胞分別于離心管中，用1000rpm離心5分鐘后棄上清。 2用吸管吸打或用指

5、彈法使細胞懸浮，然后用Carnoy固定液固定30分鐘。 3以1000rpm離心5分鐘，棄上清剩約0.50.1ml液體，使細胞懸浮后滴片。 437干燥24小時 5銀染(程序同前) 6鏡檢 鏡下所見，細胞核著色而細胞質不著色，核中活性核仁形成區銀染顆粒呈棕黑色，成簇聚集，清晰可分。腫瘤細胞中與正常細胞中的銀染顆粒數量、可見有明顯差異。 (三)間期細胞核銀染活性核仁形成區電鏡標本制備與觀察 1收集培養的HL-60細胞或HeLa細胞于離心管中，隨后加入2.5戊二醛1ml預固定10分鐘。 2以1000rpm離心10分鐘，棄上清后加入Carnoy固定液固定5分鐘。 3接著以2500rpm離心lO分鐘，棄凈

6、上清并用吸水紙吸干殘余液體，用耳勺取出細胞團塊放于小平皿中。 4100乙醇雙蒸水梯度復水，每步5分鐘。 5然后將細胞團切成約1mm3大小的塊。 6將50AgN03(用蒸餾水配制)2蛋白膠(用1甲酸配制)2:1混合液23ml，加入有細胞團塊的小平皿中。 7移置平皿于56水浴中處理20分鐘。 8徹底水洗3次，每次23分鐘。 9水洗后5硫代硫酸鈉室溫處理lO分鐘。 10再水洗3次，轉入乙醇一丙酮梯度脫水，每步5分鐘。 11Epon812包埋。12超簿切片直接地或再經醋酸鈾和檸檬酸鉛復染后，在電鏡下觀察。（11、12步驟具體操作見實驗七有關部分）鏡下所見，經鈾、鉛復染的標本，細胞核中電子密度大的是核仁纖維中心(Fibrillar Centre,FC)和致密纖維成分(Dense fibrillar component，DFC)它們是銀染蛋白和正在轉錄的rRNA基因存在的部位；周圍電子密度均勻，著色淺的為rRNA前體和核糖體大、小亞單位存在的顆粒成分(Granular component，GC)。超薄切片不經鈾、鉛復染，直接在透射電鏡下觀察，顯示銀染蛋白顆粒只存在于FC和DFC中，在周圍GC中很少存在?！咀?業】 1計數30個核型，求出該種