1、腫瘤個體化治療基因檢測教程教程目錄第一章 病理常規操作第二章 樣本前處理（申請單填寫、標本類型、標本評估及登記等）第三章 樣本預處理（DNA、RNA提取及質量評估）第四章 基因操作（測序、片段分析及Q-PCR）第五章 結果解讀及診斷報告出具第六章 資料匯總，資料庫建立第一章 病理常規操作1. 病理樣本的接收2. 組織固定3. 取材4. 包埋5. 組織石蠟切片6. HE染色2. 組織固定臨床醫師切取標本后，應盡快將標本置于盛有足夠量固定液的容器內，盡量避免可能出現固定不及時或不充分導致標本干涸或腐敗，無法進行切片制作。添加的量應610倍于標本體積.3. 取材及其后期處理病理科病理醫生取材核對標本

2、及其標志與申請單是否一致。按照病理取材規范選取病變及正常組織。對送檢標本進行大體描述。取材后的標本保存至少兩周。放入自動脫水機進行水洗脫水透明浸蠟前處理。4.包埋先將熔化的石蠟傾入模具，再用加熱的鑷子夾取已經浸蠟的組織塊，注意：特定的制定面或最下面向下埋入熔蠟。注意標本的編號和標本要對準，防止污染。為下一步切片準備，提供介質。5.切片刀片鋒利，組織塊預冷。切5-10um的連續組織切片，置于玻片上。撈片，烘干。第二章 標本前處理一、申請單填寫1、登記患者基本情況，包括姓名、性別、年齡、送檢單位、床位、門診號/住院號、送檢日期、取材部位、病理診斷、標本病理號等2、患者簽署知情同意書，留下聯系方式3

3、、患者病史及臨床情況送檢標本種類：外周全血；胸腹水；痰；尿新鮮(冰凍)標本；內鏡活檢標本；手術標本蠟塊或切片新鮮標本用10%中性福爾馬林固定或用RNAlater浸泡20分鐘以上（常溫可保存10天）外借病理蠟塊，常規病理大小即可常規石蠟切片（10張白片），5-10um，常溫送檢送檢標本要求：樣本評估血：保存溫度、時間，是否凝固胸腹水、尿及痰：涂片HE染色觀察結果是否有癌細胞蠟塊或白片：組織保存時間、福爾馬林固定時間、組織大小、有無癌細胞將申請單登記入冊登記基因檢測申請號、姓名、送檢單位、病理號、檢測項目腫瘤個體化治療基因檢測項目檢測項目涉及腫瘤預測內容樣本類型EGFR突變外顯子18, 19, 2

4、1, (CA)n非小細胞肺癌、食道癌、頭頸腫瘤等預測吉非替尼（易瑞沙）、厄羅替尼（特羅凱）石蠟白片或胸水300mL外顯子20(T790M)K-ras突變密碼子12,13,61腸癌、肺癌、胃癌、甲狀腺癌預測西妥昔單抗（愛比妥）、帕尼單抗（維克替比）療效，甲狀腺癌輔助診斷石蠟白片BRAF突變V600EC-kit突變外顯子9,11,17胃腸間質瘤、肉瘤預測伊馬替尼（格列衛）療效石蠟白片PDGF突變外顯子14、18腫瘤個體化治療基因檢測項目檢測項目涉及腫瘤預測內容樣本類型JAK-2 突變外顯子 12，14真性紅細胞增多癥，原發性骨髓纖維化、原發性血小板增多癥輔助臨床診斷2mL抗凝血或骨髓活檢預測化療和

5、干擾素療效ABL突變酪氨酸激酶區點突變髓細胞白血病預測伊馬替尼（格列衛）療效2mL抗凝血或骨髓活檢Her-2/CEP17FISH乳腺癌、胃癌乳頭狀癌診斷石蠟白片預測曲妥珠單抗（赫賽汀）療效VEGF/-actinVEGFR/-actinmRNA表達量腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、腎癌預測貝伐單抗（阿瓦斯丁）療效石蠟白片+2mL抗凝血腫瘤個體化治療基因檢測項目檢測項目涉及腫瘤預測內容樣本類型TOP-A/CEP17FISH/mRNA表達量乳腺癌預測蒽環類藥物療效石蠟白片+2mL抗凝血預測蒽環類藥物毒性UGT1A1啟動子區多態性腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌預測伊立替康毒性HE染色結果血液DNA提取250l抗凝

6、血加入250l Buffer BL和25l OB酶，70孵育15分鐘。加入260l無水乙醇震蕩混合約20秒。取上清轉入收集柱中，12000rpm離心2分鐘。將收集柱置一新收集管上，加入500l HB solution，12000rpm離心2分鐘。加入700l wash Buffer，12000rpm離心2分鐘。空甩離心，12000rpm2分鐘。將收集柱置一新1.5ml離心管上，加入50l 70預熱的洗脫液，靜置5分鐘，12000rpm離心4分鐘洗脫，即為DNA模板。瓊脂糖電泳檢測提取DNA質量（或用分光光度計定量并記錄）。Omega Blood DNA kit protocol石蠟DNA提取在

7、消化充分的組織中加入220l BUffer BL，震蕩混合，于70孵育。加入220l無水乙醇震蕩混合約20秒。取上清轉入收集柱中，12000rpm離心2分鐘。將收集柱置一新收集管上，加入500l HB solution，12000rpm離心2分鐘。加入700l wash Buffer，12000rpm離心2分鐘。空甩離心，12000rpm2分鐘。將收集柱置一新1.5ml離心管上，加入50l70預熱的洗脫液，靜置5分鐘，12000rpm離心4分鐘洗脫，即為DNA模板。瓊脂糖電泳檢測提取DNA質量（或用分光光度計定量并記錄）。Omega Tissuse DNA kit protocol電泳圖1.石

8、蠟組織RNA的提取RNAlater樣本處理另注加入250lbufferPKD和10l的蛋白酶K,渦旋混勻后，55C孵育2-3h，80C15min。然后加入500l的bufferRBC，充分混勻。將溶液轉入gDNA Eliminator spin柱內，10000g離心30s，吸取收集管內液體至新的離心管，重復操作直至溶液都過濾收集柱。在溶液內加入1200l無水乙醇，混勻，將溶液轉入RNeasy MinElute spin柱內，10000g離心15s，棄收集管內液體。加入500l buffer RPE，10000g離心15min，棄收集管內液體。加入500l buffer RPE,10000g離心

9、2min。小心將柱取出，放入一新的收集管內，最大速度離心5min（將柱蓋打開）將柱放入1.5ml收集管內，加入40-60l無Rnase酶水，蓋上蓋子，室溫放置2min，最大速度離心1min洗脫RNA.Qiagen RNEASY FFPE RNA kit protocol2.血RNA的提取300l全血+1500l 1 buffer ERL （150l 10 ERL+1350l H2O）混勻。同時做3管。冰上孵育10min，至半透明。450g 4，10min，棄上清。600l 1 buffer ERL混勻，洗滌細胞。洗滌后合并3管液體。450g 4，10min，棄上清。600l TRK裂解液+12

10、l -巰基乙醇吹打混勻（可以暫時-70凍存）。加等體積70%乙醇，吹打混勻。將液體轉入HiBind RNA提取柱內（ 2.1: 核酸降解 1.6: 蛋白質污染第四章 基因操作DNA提取測序反應上機測序及結果分析PCR擴增電泳檢驗電泳檢驗，PCR產物純化測序產物純化PCR擴增（以K-ras為例）反應體系為：10buffer dNTP(2mM) Mg2+TaqGenome DNAPrimer-F（10M）Primer-R（10M）H2O 2l 2l0.75l0.25l1l0.4l0.4l13.2lTotal 20l PCR反應條件： 置PCR擴增儀中95預變性15min，用TouchdownPCR

11、，94變性50秒，63-58退火1分鐘，72延伸1分鐘，共循環10次，94變性50秒，57退火1分鐘，72延伸1分鐘，共循環30次，最后于72延伸10分鐘。電泳圖用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴增產物是否為單一目的條帶。PCR產物純化1.加100lPCR-A液，混勻，轉入純化柱內，室溫靜置10min，12000rpm離心2min。2.棄收集管內液體，加700lwashing buffer，12000rpm離心2min。3.棄收集管內液體，加400lwashing buffer，12000rpm離心2min。4.棄收集管內液體，12000rpm離心2min。5.柱內加30l70C預熱洗脫液，

12、12000rpm離心2min。測序反應（以K-ras為例）反應體系為：BigDye（2.5X） 0.8l BigDyeSeqBuffer （5X） 1.6 l Primer 0.3lPCR純化產物 1lddH2O 6.3lTotal 10l測序產物純化1.每管加1lEDTA（125mM）;1lNaAc（3M）到管里。2.每管加100l100%酒精，震蕩混勻，室溫靜置15min。3.10C;4000rpm離心30min，馬上倒置，1200rpm離心1min。4.每管加100l70%酒精，5C;4000rpm離心30min，馬上倒置，1200rpm離心1min。5.37C;30min揮發凈酒精，加

13、10l Hi-Di溶解DNA。6.95C；變性5min，4C；4min，加樣上機。片段分析操作PCR擴增加LIZ、HIDI混合變性上機測序及結果分析避光步驟1多重熒光PCR：15lPCRmix五種（胃腸）或七種（尿）引物0.8l（其中D17S283加1.2l）1lDNA.條件：95 C15min，94 C1min，56 C1min，72 C1min，30個cycle.lPCR產物0.4lLIZ size standard+8l HiDi,95 C 5min, 4C冰冷5min。上機，分析數據。Q-PCR操作RNA提取Q-PCR儀擴增結果分析RT分光光度計評估質量詳細步驟1.RT反應:gDNA1

14、l+RNA 6l；上機42C，2min；離心。RT Buffer 2l，RT酶0.5l，Primer 0.5l；上機A64程序。2.Q-PCR儀擴增 （反應體系）2SYBR 2.5l Primer 1(5uM) 0.5lPrimer 2(5uM) 0.5lRT產物 1 lNuclease-free water 1l Total 5l7900PCR儀反應程序95C 10min；95C 15s；60C 1min，40cycle。RQ Manager 1.2軟件分析實驗數據。第五章 結果解讀及診斷報告出具基因測序結果分析RNA表達量結果分析測序結果圖及分析ABI3100測序儀測序，SeqScape

15、v2.0分析結果為。以K-ras和EGFR為例K-RAS 基因測序突變類型K-ras :K2第12（GGT),13密碼子（GGC） K3第61（CAA）密碼子共9種突變類型：GGT-GAT G12DGGT-GTT G12VGGC-GAC G13DGGT-TGT G12CGGT-GCT G12AGGT-AGT G12SGGT-CGT G12RGGC-TGC G13CGGC-GCC G13AGGC-GTC G13V7種 98%3種 2%EGFR基因測序突變類型：EGFR 第18, 19 ,20, 21外顯子和第一內含子（CA）EGFR 19:容易發生缺失 EGFR 21:L858R EGFR(CA):(CA)n16，EGFR非突變NSCLC患者服用TKI類藥物具有短期療效 EGFR 20:T790M 突變會使患者對EGFR-TKI 類藥物產生耐藥EGFR18測序圖EGFR19測序圖EGF