1、石河子大學分子生物學實驗結課論文綠色熒光蛋白（GFP）原核表達分析 TOC o 1-5 h z 學生姓名學號專業年級、班級指導教師所在學院中國新疆石河子2016年1月綠色熒光蛋白（GFP）原核表達分析摘要：本實驗主要探討目的蛋白（ GFP在大腸桿菌中的表達的情況以及鑒定目的蛋白形成的是包涵體還是可溶性蛋白。本實驗先對菌液進行培養、活化、然后采用IPTG分別對其不同時間點的誘導，用 SDS-PAGM確定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握 GFP誘導不 同時間的表達情況的檢測方法。關鍵詞：綠色熒光蛋白；SDS原核表達1前言實驗目的掌握聚合酶鏈式反應（PCR）的原理和操作方法；了解重組載體的構建方法；

2、 鍛煉學生查閱文獻資料、設計與優化實驗的能力；加強學生對化學生物學中常用 研究方法的認知。實驗背景綠色熒光蛋白（green fluorescent protein GFP）是源于多管水母屬等海洋無脊 椎動物的發光蛋白，具在藍光或紫外光下可發出明亮的綠色熒光，可以作為報告基因檢測蛋白的特異性表達或進行細胞定位研究。與以往lacZ、CAT等報告基因相比，有很多無可比擬的優越性：GFP不具有種屬依賴性，在多種原核和真核 生物細胞中都表達；熒光強度高，穩定性高；不需要反應底物與其他輔助因子，受藍光激發產生綠色熒光，尤其適用于體內的即時檢測；另外 GFP分子量小，易于融合，適用于多種轉化方式，對受體無毒

3、害 ，安全可靠；并且通過替換一些特 殊氨基酸，可以使之產生不同顏色的光，從而適應不同的研究需要。正是由于 GFP檢測具有高靈敏度，操作簡單，無需使用同位素等優點，近年來廣泛用于 基因的表達與調控、蛋白質的定位、轉移以及相互作用、信號傳遞、轉染與轉化， 以及細胞的分離與純化等研究領域。 綠色熒光蛋白還在監測目的基因表達、 研究 細胞內物質代謝及追蹤細胞系的分化等方面有著廣泛應用。采用GFP作為標記基因，可直接收集轉化細胞供實驗，縮短了篩選時間、減少對細胞活性的影響并 可作為活體標記，為研究發育的基因調控和分子機制提供了一種簡潔有效的手 段。同時也正因為其熒光反應不是酶反應， 所以當細胞本身還存在

4、一些可以受藍 光激發和產生綠色熒光的物質，或者 GFP表達頻率不高的情況下，GFP的檢測 可能會產生一些假相，不易對熒光進行定量的測定。我們利用基因工程手段在大 腸桿菌中高效的表達了 GFP,制備出GFP抗體，利用抗原與抗體之間的特異性， 在體外對GFP進行檢測，可在一定程度上彌補上述 GFP檢測中可能出現的問題， 可以作為一種重要的輔助手段用以提高 GFP檢測的靈敏度和準確度。原核表達是將克隆基因插入合適載體后導入大腸桿菌，用于表達大量蛋白質的方法。選用原核表達系統的原因是易于生長和控制、用于細菌培養的材料不及 哺乳動物細胞培養的材料昂貴、有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種 特性的質

5、粒可供選擇。但是在大腸桿菌中表達的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達蛋白的生物學活性及構象。包涵體是在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內，形成被膜包裹的結構，具有水不溶性的特點。本實驗主要是通過 SDS來檢測綠色熒光的原核表達情況。流程圖：2材料與方法材料質粒DNA;PCR產物、酶切質粒、DNA Marker;外源DNA片段：PCR擴增 回收目的片段 A和PGM-Tvector（Amp ,lac那限制性內切酶末端的 DNA溶液 （目的片段A和載體片段pBL） ;E.coli DH-5 a受體菌（R-M-）,自提的質粒或重

6、 組子;重組質粒DNA的菌落、BL21;重組GFP質粒、標準蛋白。PCR儀、PCR管、移液槍、離心機、電泳儀、渦旋振蕩器、冰箱、透射儀、 紫外透射儀、刀片、臺式高速離心機、恒溫水浴鍋、微量移液槍、Eppendorf管、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、制冰機、振蕩培養箱、移液器、搖床、酒精燈、培養 皿、接種環、酒精棉球、滅菌槍頭、分光光度計。模板 DNA、dNTP、TaqDNA 聚合酶、引物、Buffer(內含 Mg2+)、ddH2。、pGM-T 載體、T4DNA連接酶、限制性內切酶、DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒，具 它生化試劑皆為國產分析純。實驗方法PCR擴增目的基因片段(1)依次混勻下列試劑，反

7、應體系如下:PCR反應體系各成分的量 TOC o 1-5 h z ddH2O9.5l上游引物1.0l下游引物1.0l模板 DNA1.0lTaqDNA 聚合酶12.5lTotal25 l混勻后瞬時離心將PCR管放入PCR儀中，設定PCR儀的循環參數。預變性94c 3 min,變 性94 C 30s,退火52c 30s,延伸72c 40s 30個循環。總延伸 72c 4 min；溫度時間 TOC o 1-5 h z 預變性94 C3min變性94 C30S退火52 C30S延伸72 C40S總延伸72 C240S(3)PCR擴增完畢后，取出PCR管放在冰盒上；(4)取5 l擴增后產物，進行瓊脂糖電

8、泳檢測。(1)加20ml 1河AE緩沖液于三角瓶中；(2)精確稱取0.2g瓊脂糖加到三角瓶中，于微波爐中加熱至完全熔化；(3)冷卻至60 c左右，力口 1仙的Goldview溶液，搖勻；(4)輕緩倒入封好兩端和加上梳子的電泳膠板中，靜置冷卻30分鐘以上；(5)輕輕拔除梳子，將膠放入電泳槽中，加入電泳緩沖液(TAE),使電泳 緩沖液剛好沒過凝膠約1mm；(6)取5小質粒DNA及2仙加樣緩沖液混勻上樣；110v約電泳0.51小時；(8)紫外透射儀觀察結果。2.2.3 DNA的回收和純化回收PCR產物(采用天根時代DNA回收試劑盒)(1)用干凈的刀片將需要的 DNA條帶從凝膠上切下來，分別放入 1.

9、5ml 離心管中；(2)以0.1g凝膠對應300仙的體積加入PN;(3) 50 c水浴放置10min,期間不斷溫和上下翻動離心管至膠完全溶解；(4)將上述的得到的溶液加入到一個吸附柱中，吸附柱再放入收集管，12000rpm離心60s,棄掉廢液；(5)加入700仙漂洗液PW, 12000rpm離心30s,棄掉廢液；(6)加入500仙漂洗液PW, 12000rpm離心30s,棄掉廢液；(7)將離心吸附柱放回收集管，12000rpm離心2min；(8)取出吸附柱，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間位置加入適 當的洗脫緩沖液EB 30口洗脫緩沖液先在65 c水浴預熱，冷卻至室溫，12000rpm

10、離心1min,然后將離心的溶液重新加回離心吸附柱中，12000rpm離心1min；(9)電泳檢測回收產物，余置于-20C下保存。透射儀觀察結果，并拍照。把PCR擴增的目的基因片段產物與pGM-T載體連接，反應體系如下：體系成分3.5。1.02.2.5大腸桿菌感受貓癖而制備大腸桿菌感受態細泣4除冰用CaCl2法(1)將實驗室保飾H1E.C0畋DH-5 a菌株甘油管40無菌去離子水1:100稀釋后，平板劃線法接種處GMT量的LB固體培養基上？537C培養過夜，見有菌落長出，用接種環從平心巡坪單菌落，接種到20ml無抗生素的新鮮LB液Total10.0體培養基中，37C、200rpm重蕩培養過夜，活

11、化 E.coli DH 5覬菌株；(2)按照1%接種量，從上述培養液中吸取菌液 2ml,轉瓶接入200ml新鮮 的無抗生素的LB液體培養基中，37C ,200rpm震蕩培養至OD600值為0.5左右；(3)在已滅菌的10ml離心管中吸取上述培養液10ml,冰水浴10min后，4C、 6000rpm離心2min,收集菌體，棄上清；(4)加2ml冰冷預熱的0.1mol/LCacl2溶液，重懸菌體，冰浴10min, 4C、 6000rpm離心2min,收集菌體，棄上清；(5)將每一份沉淀輕緩地懸于 0.41ml含有20%甘油的0.1mol/L Cacl2的 溶液中，輕輕重懸菌體沉淀，冰上放置10分鐘

12、；(6)分裝100pL管(冰浴分裝)，置于-70C冰箱中保存。(1)轉化用固體LB培養基平板制備：向含100pg/m氮葦青霉素(AMP)的固體LB培養基平板上加50mg/ml的 IPTG16卜和20mg/ml的X-gal 40卜L用滅菌彎頭玻璃棒涂布均勻，37c避光倒 置3h,讓溶解X-gal的二甲基甲酰胺盡量揮發干凈。加入 ITPG和X-gal的轉化 用平板應避光保存，以防試劑見光分解。(2)連接產物轉化E.coli DH-5 a感受態細胞：取5以連接產物加到100仙l E.coli DH-5 a感受態細胞中。輕彈混勻，水浴 20min。取出離心管，42 C水浴中熱激90后，立即置冰浴中冷卻

13、5min。向離心管中加入800 l L 37：預熱的無抗生素的LB液體培養基。取出離心管，12000rpm離心2min,棄上清8001,用剩余的約100口上 濤將沉淀菌體吸打混勻后，在LB平板上涂布ITPG和X-gal。將平板倒置在37C 恒溫箱中培養14h18h,直至長出菌落，觀察結果。2.2.7重組質粒的菌落鑒定本次實驗所用的pGM-T vector含Ampr、lacZ基因，所以有重組質粒的菌 落為白色，沒有重組質粒的菌落為藍色。具體操作如下：挑取菌落：使用無菌槍頭隨即挑取5個白色菌落，放入含氨葦青霉素的LB液體培養基的1.5ml EP管，振蕩培養4h以上，吸取0.5ul菌液作為PCR反

14、應模板，其余繼續培養。PCR反應體系與反應程序均與目的基因擴增條件一致。擴增產物取5ul用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。將鑒定為陽性重組子的質粒EP管挑取出來，按照實驗室提取質粒的試劑盒 說明書操作。提取后，取5ul用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。用限制性內切核酸酶BamH I和Sal I對PCR陽性菌落提取的質粒做雙酶切 鑒定。酶切反應體系如下表。體系成分體積質粒5.0ul去離子水11ul10 汨uffer T3.0ulBamH I ( 120U/ul)0.5ulSal (100U/ul)0.5ul總體積20ul37 c酶切過夜，70 c滅活酶活性。1%瓊脂糖凝膠進行檢測。(1)將上步經酶切鑒定得到的G

15、FP目的片段與表達質粒連接，并轉化至大 腸桿菌BL21菌株。轉化菌涂布于含有卡那霉素的 LB瓊脂平板上，37c過夜培 養；(2)觀察菌落生長情況，進行菌落 PCR鑒定；(3)將鑒定為陽性的菌落接種于20ml含50mg/L卡那霉素的LB培養基中, 37 c搖菌培養過夜。(4)按1:100稀釋過夜菌，接種于100ml含有卡那霉素的LB培養基中， 37 c搖菌繼續培養至A600約為0.4-0.8。(5)取部分液體作為未誘導的對照組，余下的加入 IPTG誘導劑至終濃度 為1mmol/L,于37c誘導表達。每隔1h分別取菌體1ml,離心12000g, 30s得 到沉淀，觀察蛋白表達情況。(1)取未誘導、

16、誘導不同時間的培養物 500ul于微量離心管中，室溫高速 離心1min。沉淀懸浮于100ul 1 SDS凝膠加樣緩沖液中，100c加熱3min,室溫 高速離心1min后，冰上放置。(2)安裝電泳裝置，配制12%分離膠倒入凝膠槽，加蒸儲水密封。待凝固 后再倒入5%濃縮膠，插上梳子。待凝固后，拔出梳子，放入電泳槽中，上樣， 電泳。(3)電泳結束后，將凝膠浸泡在染色液中，室溫在搖床上緩慢染色4h0(4)脫染：將染液回收，凝膠先用蒸儲水漂洗一次后侵入脫染液中脫染， 更換幾次脫色液，直至出現清晰的電泳帶。(5)脫色后，將凝膠保存在水中或是含 20%甘油的水中；(6)觀察實驗結果。3結果與分析PCR擴增目

17、的基因片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測M為Marker , 1-4為PCRT增產物，產物長度約為 750 bp ,由于實驗疏忽不嚴謹，條 帶不明顯且不明確。DNA回收電泳檢測由于操作不當，DNAt段分解了，沒有回收到電泳條帶。連接產物轉化后的藍白斑篩選將目的基因片段與pMD18-T載體連接，并轉化大腸桿菌 E.coli DH&菌株 感受態，37 C,培養16h以后得到藍白斑的菌落，白色菌落即有可能為含重組子 的菌落(如下圖)。箭頭所指處為藍色菌落外源基因誘導表達用IPTG誘導表達后呈現綠色，說明含外源基因 GFP的質粒在大腸桿菌體內 成功表達。綠色熒光的亮度增加說明隨著誘導時間的增加，GFP因表達量增

18、加， 而沒有經IPTG誘導的菌體則不發出綠色熒光(如下圖)。GFP原核不同條件的誘導表達和檢測將誘導表達的蛋白處理后進行SDS-PAGI&測，確定其分子量大小。可以看到, 誘導時間不同蛋白表達量不同，條帶顏色不一樣。由于實驗疏忽，電泳條帶不明 顯到時實驗失敗。電泳帶淡有三種可能原因：(1)電泳時，點樣后等待時間過長，導致點樣液擴散。(2)目的質粒濃度低。(3)機器曝光時間不對。在實驗過程中，等待點樣時間較長，原因1有可能。在電泳帶底部見模糊陰 影，可能有雜DNA虧染。我們并非在無菌的條件下做實驗，電泳口也可能有雜質， PCR寸也可能載體自連產生假陽性，這些情況都可能造成目的質粒濃度低。其他 組

19、的電泳結果也不是很亮，所以還可以調整曝光時間試試。4心得體會本實驗涉及知識面廣，需要綜合利用分子生物學、化學生物學、基因工程和 微生物學中的基礎理論知識和技術，有利于學生對幾個學科間知識的融會貫通。 實驗中涉及步驟較多，需要12周時間才能完成，因此較適合作為高年級學生 的綜合實驗。本實驗對實驗者的實驗技能要求較高，實驗過程中應用到一系列基 本操作方法，需使用多種實驗儀器，可以綜合鍛煉學生的實驗技能。在實驗教學 過程中，教師要注意加強引導，實施開放式教學，給學生創建一個獨立工作的環 境。同時學生也可通過查閱文獻，對給定的實驗步驟進行優化，有利于開闊學生 的視野，培養學生解決問題、分析問題的能力。

20、綠色熒光蛋白是現代化學生物學 中常用的一種分子成像標記物，被廣泛應用于科學研究中。由于綠色熒光蛋白在 紫外光激發下可以發出明亮的、肉眼可見的綠色熒光，有利于激發學生的實驗熱 情，提高學生學習化學生物學的興趣。由于本實驗使用可進行親和純化的表達載 體，因此也可以進行后續的蛋白質純化及蛋白質電泳實驗。參考文獻1薛啟漢.綠色熒光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物學研究中的應用J.江蘇農業學報，1999, 01:54-60.2唐孝青，李斌，伍小兵，張亮 .綠色熒光蛋白及其應用的研究進展J.陜西農業科學，2007, 01:123-124+145.Kain SR , Adams M , Kondepudi A , et a.l Green fluore