1、貨號：MS1007規格：100管/96樣乙醇脫氫酶（ADH ）活性測定試劑盒說明書微量法注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。測定意義：ADH是生物體內短鏈醇代謝的關鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉換，在很多生理過程中起著 重要作用。哺乳動物ADH主要在肝臟生成，肝臟損傷導致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高 低反映了肝功能是否異常。測定原理：ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+，NADH在340nm處有吸收峰，而NAD+沒有；測定 340nm吸光度下降速率，來計算ADH活性。自備實驗用品及儀器：研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調

2、式移 液器和蒸餾水。試劑組成和配制：試劑一：液體X1瓶，室溫保存。試劑二：液體X1瓶，4C保存。臨用前把試劑三轉移到試劑二中，4C保存。試劑三：粉劑X1支，一20C保存。試劑四：液體X1支，4C保存。粗酶液提取：1、組織：按照組織質量（g）:試劑一體積（mL）為1： 510的比例（建議稱取約0.1g組織， 加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。16000g，4C離心 20min，取上清置冰上待測。2、細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：試劑一體積（mL）為5001000： 1的比例（建議500 萬細胞加入血1試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時 間3min）； 16

3、000g， 4C離心 20min，取上清液置冰上待測。3、血清等液體：直接測定。ADH測定操作：分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節波長到340 nm，蒸餾水調零。試劑二在25C水浴中保溫30 min。空白管：在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20UL蒸餾水、160UL試劑二和20uL試 劑四，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A1 和A2OAA空白管二A1-A2。測定管：在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20UL 上清液、160UL試劑二和20uL試 劑四，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A3

4、和A4OAA測定管二A3-A4。注意：空白管只需測定一次。計算公式：a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下（1）按照蛋白濃度計算活性單位定義：25C中每毫克蛋白每分鐘氧化1 umol NADH為1個酶活單位。ADH （umol/min/mg prot） =（AA 測定管-空白管）：e：dXV 反總 X10e -F（CprXV 樣）：T=1.61X（A測定管-AA空白管）：Cpr（2）按照樣本質量計算活性單位定義：25C中每克組織每分鐘氧化1 umol NADH為1個酶活單位。ADH （umol/min/g 鮮重）=（A 測定管-AA 空白管）：e：dX V 反總 XS ：（WX V 樣：V

5、樣總ET=1.61X（A測定管-AA空白管）-FW（3）按細胞數量計算活性單位定義：25C中每104個細胞每分鐘氧化1 umol NADH為1個酶活單位。ADH （umol/min/104cell） = （A 測定管-AA 空白管）：e：dXV 反總 X10&：（細胞數量XV樣：V樣總）：T=1.61X（A測定管-A空白管）：細胞數量（4）按液體體積計算活性單位定義：25C中每毫升血清每分鐘氧化1umol NADH為1個酶活單位。ADH （umol/min/mL） = （A 測定管-AA 空白管）：e：dXV 反總 X10& ：V 樣：T= 1.61X（A測定管-AA空白管）e： NADH摩爾

6、消光系數，6.22X 103L/mol/cm； d：比色皿光徑，1 cm； V反總：反應體系總體 積，200uL=2X10-4L； Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL； W :樣品質量；V樣：加入反應體系 中上清液體積，20uL=0. 02 mL； V樣總：提取液體積，1 mL； T：反應時間，1min。b.使用96孔板測定的計算公式如下（1）按照蛋白濃度計算活性單位定義：25C中每毫克蛋白每分鐘氧化1 umol NADH為1個酶活單位。ADH （umol/min/mg prot） =（A 測定管-空白管）：e：dXV 反總 X106 -F（CprXV 樣）：T=1.61X（A測定管-AA空

7、白管）：Cpr（2）按照樣本質量計算活性單位定義：25C中每克組織每分鐘氧化1 umol NADH為1個酶活單位。ADH （umol/min/g 鮮重）=（測定管-AA 空白管）：e：dX V 反總 XS ：（WX V 樣：V 樣總）：T=1.61X（A測定管-AA空白管）-FW（3）按細胞數量計算活性單位定義：25C中每104個細胞每分鐘氧化1 umol NADH為1個酶活單位。ADH （umol/min/104cell） = （A 測定管-AA 空白管）：e：dXV 反總 X10&：（細胞數量XV樣：V樣總）：T=1.61X（A測定管-A空白管）：細胞數量（4）按液體體積計算活性單位定義：25C中每毫升血清每分鐘氧化1umol NADH為1個酶活單位。ADH （umol/min/mL） = （A 測定管-AA 空白管）：e：dX V 反總 X10& ：V 樣：T=1.61X（AA測定管-AA空白管）e： NADH摩爾消光系數，6 . 22X 103L/mol/cm； d： 96孔板光徑，0.5 cm； V反總：反應體系總 體積，200uL=2X10-4L； Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL； W