1、 1蛋白質含量測定 引言：蛋白質的定量分析是生物化學和其他生命學科最常涉及的分析內容，是臨床上診斷疾病及檢查康復情況的重要指標，也是許多生物制品，藥物、食品質量檢測的重要指標。在生化實驗中，對樣品中的蛋白質進行準確可靠的定量分析，則是經常進行的一項非常重要的工作。2 目前測定蛋白質含量的方法有很多種，下面列出根據蛋白質不同性質建立的一些蛋白質測定方法：物理性質：紫外分光光度法。化學性質：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法等。染色性質：考馬斯亮藍染色法、銀染法。其他性質：免疫比濁法。3蛋白質的定量測定雙縮脲法實驗目的要求 1、學習分光光度法原理，了解分光光度計的結構。 2、掌握雙縮脲法測定蛋白質

2、含量的原理及方法。 3、了解標準曲線的制作方法及其在物質定量測定中的應用。4分光光度法原理 分光光度法，常被用來測定溶液中存在的光吸收物質的濃度，其基本原理是根據Lambert和Beer定律。 5 Lambert定律 一束平行單色光垂直照射于一均勻物質（溶液）時，由于溶液吸收一部分光能，使光的強度減弱，若溶液的濃度不變，則溶液的厚度愈大，光線強度的減弱也愈顯著。 設：入射光強度為I0 L表示溶液的厚度（即光程） 出射光（透過光）強度為I根據輻射能理論推導， I0與I之間關系為 lg（ I0 /I） = K1L （1） K1是常數，受光線波長、溶液性質、溶液濃度的影響。6 Beer定律 當一束單

3、色光通過一溶液時，光能被溶液介質吸收一部分，若溶液的厚度不變，則溶液濃度C愈大，光吸收愈大，透射光線強度的減弱也愈顯著，光強度減弱的量與溶液濃度增加量成正比 lg（ I0 /I） = K2C （2） K2為吸收系數，是常數，溶液對光吸收的大小與溶液濃度C成正比。 7 Lambert-Beer定律（又稱吸收定律） 上二式合并（即（l）與（2）合并） lg（ I0 /I） = CL 令A= lg（ I0 /I） ， T= I / I0 ；則 A=CL， A=-lgT 。 T為透光率，A為吸光度（光密度、消光度）。 其中為常數，又稱消光系數（extinction coefficient），表示物質對

4、光線吸收的能力，其值因物質種類和光線波長而異。對于相同物質和相同波長的單色光則消光系數不變。8分光光度計的結構 光源：鎢燈和氫燈（或氘燈） 單色器 ：分解為單一波長光的裝置 狹縫：調節入射單色光的強度，形成平行光 線 吸收池：又稱比色杯、比色皿、比色池，裝待測溶液用 檢測系統：感受光能，轉化為電能，輸出A值、T值。9本室幾類分光光度計22PC型可見光分光光度計 UNICO2000型 10S54型紫外分光光度計 UV8500型紫外分光光度計 11比色杯（比色皿）玻璃比色杯 石英比色杯 熒光比色杯12比色杯使用注意事項 1 、拿取比色皿時，只能用手指接觸兩側的毛玻璃，避免接觸光學面。2 、不得將光

5、學面與硬物或臟物接觸。盛裝溶液時，高度為比色皿的2/3處即可，光學面如有殘液可先用濾紙輕輕吸附，然后再用檫鏡紙擦拭。3、 比色皿在使用后，應立即用水沖洗干凈。必要時可用1：1的鹽酸浸泡，然后用水沖洗干凈。4、 不能將比色皿放在火焰或電爐上進行加熱或干燥箱內烘烤；5、 在測量時如對比色皿有懷疑，可自行檢測。 13微量移液器吸嘴裝在吸液桿上，應套牢避免間隙。依據所需容量旋轉手輪，使數輪顯示所需值。輕輕地將推動按鈕下壓，使推動按鈕推移至第一停點位置。手持取液器垂直浸入溶液中，吸嘴浸入深度為2-4mm，停留2-3秒后緩慢放松按鈕，即回到原來位置，溶液吸入后稍停即可將吸嘴移出液面。將取液器吸嘴置于排液容

6、器內。使吸嘴尖緊貼容器內壁，按壓推動按鈕至第二停點位置，使溶液排盡，松開按鈕。移液完畢，按壓卸嘴按鈕，將吸嘴脫卸。14【實驗原理】具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反應，因此蛋白質在堿性溶液中，也能與Cu2+形成紫紅色絡合物，顏色深淺與蛋白質濃度成正比，故可以用來測定蛋白質的濃度。 15紫紅色銅雙縮脲復合物分子結構為： 16 但必須注意，此反應并非蛋白質所特有，凡分子內有兩個或兩個以上的肽鍵的化合物以及分子內有H2NOC-NH -CONH2等結構化合物，雙縮脲反應也呈陽性。 17【實驗材料】 1試劑 （1）雙縮脲試劑：取1.50g硫酸銅（CuSO45H2O）和6.0g酒石酸鉀鈉（NaKC

7、4H4O64H2O），用500mL水溶解，在攪拌下加入300mL 10氫氧化鈉溶液，1.0g KI；用水稀釋到1000mL，貯存于塑料瓶中（或內壁涂以石蠟的瓶中），避光保存。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色或暗紅色沉淀出現，則需重新配制。 182標準和待測蛋白質溶液：（1） 標準蛋白溶液 ：10mg/ml牛血清白蛋白溶液或相同濃度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制）。作為標準用的蛋白質要預先用微量凱氏定氮法測定蛋白質含量，根據其純度稱量，配制成標準溶液。19（2）待測蛋白質溶液 ：測定血清等樣品時需做適當稀釋，使其濃度在標準曲線測試范圍內。3器材 試管、試管架、刻度吸管、微量

8、移液器、旋渦混合器、22PC型、UNICO2000型可見分光光度計、S54型、UV-8500型紫外分光光度計。20【實驗方法】1制作標準曲線 取6支干燥潔凈試管編號，按下表加入下列試劑：加入物（ml） 012345標準蛋白液/ml 00.20.40.60.81.0蛋白濃度/(mg/ml) 02.04.06.08.010.0蒸餾水/ml 1.00.80.60.40.20.0雙縮脲試劑/ml 4.04.04.04.04.04.0充分混勻后，室溫下（2025）放置30min A540 21采用標準曲線法，即A540(540nm吸光度值)為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標，繪制標準曲線。2樣品測定 取2支試管，加入待測樣品液各1ml，加入雙縮脲試劑4ml，室溫下（2025）放置30min，用分光光度計測定吸光度。3.結果由測得的吸光度在標準曲線上查得樣品濃度。以mg/ml計。22【注意事項】1本實驗方法測定范圍110mg/ml