1、電 化 學 分 析 法 在 藥 物 分 析 中 的 應 用 電化學分析法electrochemical analysis 是基于溶液電化學性質的化學分析方法，是 由德國電化學分析法化學家C.溫克勒爾在19世紀首先引入分析領域的，儀器分析法始于1922 年捷克化學家 J.海洛夫斯基建立極譜法 。 電化學分析法的基礎是在電化學池中所發生的電化學反應。電化學池由電解質溶液和浸入其中的兩個電極組成， 兩電極用外電路接通。 在兩個電極上發生氧化還原反應，電子通過連接兩電極的外電路從一個電極流到另一個電極。根據溶液的電化學性質（如電極電位、電流、 電導、電量等）與被測物質的化學或物理性質（如電解質溶液的化

2、學組成、濃度、氧化態與還原態的比率等）之間的關系，將被測定物質的濃度轉化為一種電學參量加以測量。 根據國際純粹化學與應用化學聯合會倡議，電化學分析法分為三大類： 既不涉及雙電層，也不涉及電極反應，包括電導分析法、高頻滴定法等涉及雙電層，但不涉及電極反應，例如通過測量表面張力或非法拉第阻抗而測定濃度的分析 方法。涉及電極反應，又分為兩類：一類是電解電流為0,如電位滴定；另一類是電解電流不等于0,包括計時電位法、計時電流法、陽極溶出法、交流極譜法、單掃描極譜法、方波極譜法、 示波極譜法、庫侖分析法等。毛細管電泳在藥物分析中的應用前言毛細管電泳（CE）的歷史可以歸溯到 1967年Hejerten發表

3、的博士論文，現在人們普 遍將CE定義為在內徑100以內的毛細管中進行的電泳分析，它的出發點應歸功于1979年Mikkers等人在內徑0.2 mm的聚四氟乙烯管中進行的研究。1981年Jorgenson和Lukacs發表的研究論文對 CE的發展作出了決定性的貢獻，他們用內徑75的毛細管對熒光標識氨基酸化合物進行 CE測定，獲得理論塔板數高達40萬的高分離性能，并且深入地闡明了CE的一些基本性能和分離的理論依據。1984年Terabe 1等人提出了膠束動電毛細管色譜法（MEKC）,使許多電中性化合物的分離成為可能，大大拓寬了CE的應用范圍。到80年代后期，CE的研究成為分析化學領域的熱門課題，至今

4、已有各種英文專著10多部，這里列舉3部與藥物分析有密切關系的專著24,從80年代末開始每年都有多次國際性CE學術會議，表1列出比較有代表性的國際性HPCE會議召開地點和專輯情況，可以看出到目前為止 CE研究的中心仍然還在美國。通過 STN（the Scientific & Technical Information Network）對美國化學文摘的4索結果表明，90年代以來，CE的論文數幾乎成直線上升，應用范圍迅速擴大，大有取代目前廣泛應用的高效液相色譜（HPLC ）之勢。鑒于文章篇幅的限制，并考慮到藥物分析涉及的范圍廣、品種多的特點，本文從應用出發，著重敘述一些普通 低分子有機合成藥的CE分

5、析情況。有關更為詳細的綜述可以參考最近的報道5和JChromatogr A 的特集2。CE與藥物分析藥物分析大致可分為二大部分：一是原藥的定量，原藥中不純物的測定、藥劑的分析以及對它們的穩定性的評價等以藥品質量管理為目的的測試方法。這些方法要求有良好的選擇性，適當的分析靈敏度和可靠的準確度等。二是對進入人體內的藥物或代謝物的吸收、 分布、代謝、排泄等體內動態的研究，即臨床藥物分析。這兩大部分的測定一般需要分離與檢測相結合。目前HPLC法仍然是藥物分離測定的主要手段之一，從總體來說CE還處于發展階段，研究的對象往往與HPLC有許多重復之處，也可以理解成是一種新舊分析方法的半取代過程。CE的高分離

6、性能、超微量進樣和幾乎沒有廢液的特點，吸引了大量的分析化 學者從事這一領域的研究，使其在藥物分析中的應用得到迅速發展，并將持續較長時間。采用CE作為藥物分離的手段，首先需要判斷分析對象的存在狀態，以離子形態存 在的樣品，一般選擇 CZE分離模式，而非離子狀態的樣品則選擇MEKC分離模式。這兩種分離模式都難以達到滿意的結果時，就有必要考慮在泳動電解液中加入一些能與樣品產生相 互作用的添加劑，如環糊精 （CD）或有機溶劑。在泳動電解液中添加適當的修飾劑使分離效 果得到改善也是CE分析的主要特征之一。CE的高分離性能和超微量進樣成為藥物分離分析的一大優勢，但也有檢測靈敏度 不足和再現性差等問題。常用

7、的紫外檢測器的檢測濃度一般要求樣品的進樣濃度在10-5mol.L-1以上，這對于純藥品的測定或實驗室進行的研究來說或許不成問題，但在實際應用 中，藥品中雜質的含量大都只在0.1%左右，濃度過低，難以達到被檢測的水平，需要對試樣進行前處理。在臨床分析時，紫外檢出器靈敏度不夠的現象也相當突出，所以超微量進樣的同時也要求高靈敏度的檢測方法。萃取、濃縮等常用的前處理方法仍然在CE分析中發揮重要的作用。Lloyk等2針對CE應用于人體液分析時樣品的前處理和進樣方法作了綜述。 另外，改善CE的檢測方法來提高分析靈敏度也是一項受人關注的研究，如擴大毛細管檢測部位的體積或延長毛細管的吸收光路可以使檢測靈敏度提

8、12個數量級6。而根據等速電泳法原理進行的在柱濃縮方法使分析的靈敏度提高上百甚至數萬倍7。熒光、化學發光、電化學和 質譜等高靈敏度檢測方法在 CE中的應用也有力地推動了 CE在藥物分析領域 的滲透。最近我們開發的固液化學發光體系8使CE的在柱檢測靈敏度提高到 10-8 mol.L-1 ,并成功地應用于分離和檢出 ABEI標識的氨基酸。CE在藥物分析中的實際應用藥品質量控制維生素維生素是人體機能不可缺乏的一類化合物，它所包含的種類相當多，一般分為水溶性維生素和脂溶性維生素。水溶性維生素大多是以離子形態存在于溶液中，可以采用CZE法進行分離分析，如果遇到混合樣品中含有電中性的維生素試樣時，則必需選

9、用 MEKC分離方法，如煙酸以及它的代謝物具有較強的親水性，盡管這一類化合物中有個別 代謝物在水溶液中以中性分子存在，但它們在水中良好的溶解度可以應用MEKC達到分離的目的9。有關脂溶性維生素的分離分析報道還相當少，這一部分的藥物具有較強的疏 水作用，在表面活性劑形成的膠束中可溶程度相當高，造成用 MEKC分離的困難。這種情 況下，添加CD能較好地分離維生素 A和B 10。這是因為CD分子內部的空洞結構屬疏 水性而外部的羥基屬親水性，電中性的CD分子不溶于膠束而隨電滲流一起移動，在這過程中，疏水性的藥物既溶于膠束又可被CD所包接，在這兩種不同相中的分配之差使分離得以實現。同樣添加有機溶劑或用非

10、水MEKC也可達到既能溶解脂溶性維生素又可提高分離度的目的。氨基酸 氨基酸、小肽類化合物的分離是 CE研究領域里一個活躍的分支，近幾年來，我們研究室一直致力于氨基酸混合物以及分子異構體的分離，采用了幾種不同的分離模式，如CGE 11 , MEKC 12和CEC 13等，成功地分離了一系列氨基酸混合物， 特別是采用了金屬絡合物的配位基交換原理，在表面活性劑的存在下，簡單地分離了如圖1所示的12種既具有手性異構又含有位置異構的氨基酸，解決了這一分支中的一個難題。從 近年的報道中可以發現，由于組成肽化合物的氨基酸的數目不同，肽分子的分子量以及它們在不同的pH條件下的全電荷量的差異，可以很方便地通過調

11、節泳動液的酸度來進行分離的最優化，所以CZE法非常適用于肽類化合物白分離。周國華等14用pH 4.0的磷酸鹽緩沖液，對重組人紅細胞生成素進行CZE分析，他們認為所建立的方法可有效地分離唾液酸化程度不同的糖基化形式，還可反映重組人紅細胞生成素的體內生物活性。同樣利用CZE法成功地分離分析抗腫瘤肽類藥物醋酸百消靈15,比較了緩沖溶液 pH 212之間的分離情況，發現在pH3.5時能獲得滿意的分析結果。但是，也有一些特殊情況，如構成肽分 子的氨基酸數目相同，只是肽鏈中所含的中性氨基酸所處的位置不同，這種情況下，電泳移動度相當，難以采用 CZE法，有必要考慮 MEKC法。如一種名為抹地靈(motili

12、ne)的消化道 激素，它是由22種氨基酸組成，只是在第13位上的亮氨酸與蛋氨酸不同，在 MEKC電泳中添加有機溶劑作為修飾劑，利用樣品的疏水性的差別，得到良好的分離16。解熱鎮痛藥、抗組胺藥、消炎藥和止咳藥這些藥物常用于治療感冒頭痛。這些化合物大部分在溶液中是電中性或不溶于水，比較適合采用 MEKC法，早在90年代初寺部等17對12種感冒藥成分的分離進行了研究，發現5種不同的直鏈烷基陰離子表面活性劑的極性功能團對分離的選擇性有很大的影響。市售的解熱鎮痛藥片中的無水咖啡因、撲熱息痛等用MEKC進行分離與定量，回收率接近100%,相對標準偏差低于 2% 18。有關這一方面的應用報道，近幾年來逐漸增

13、加，特別是添加有機溶劑、環糊精或混合表面活性 劑使MEKC法所能適用的樣品范圍得到擴大。降壓藥 以普奈洛爾為代表的降壓藥物，分子內含有苯乙醇胺骨架，大多數的化合物呈堿性(pH 10左右)，所以用陽離子表面活性劑的MEKC法分離這一類化合物相當適用19,20。如用MEKC法分離測定了尿樣中 10種伊阻滯劑的含量19以及血清樣品中9 種伊阻滯劑的濃度20,尿樣測定結果的相對標準偏差在7%以內，但對血清測定結果的相對標準偏差則偏高， 大部分在10%左右，最高達15.8%,這也表明對于成分越復雜的樣品， 測定結果的誤差可能性越大，在這一點上，CE與其它方法是相同的。Prunonosa等21在100 m

14、mol.L-1硼酸緩沖溶液中(pH 8.3)加入25 mmol.L-1 SDS和10%乙睛，使用內標法對血 液中口比咤類降壓藥環泰寧的濃度進行測定，結果與HPLC法相比較，MEKC分析所需時間短，試樣用量少。3.1.5抗生素、合成抗菌劑抗生素、合成抗菌劑大多以離子形態存在于溶液中，適用于CZE法。如用0.15 mol.L-1硼酸作為電泳液(pH 9.4)對硫酸慶大霉素進行分離與定量 22, 針劑中的3種有效成分的移動時間的相對標準偏差為5%,定量結果的相對標準偏差為2.1%3.6%,與微生物定量法的結果一致。另外，頭抱拉定(cephradine)以及所含的主要雜質頭抱氨茉(cephalexin

15、)的分析，采用 MEKC法可以得到良好的分離23,比較了 9批頭 抱拉定沖劑的 HPLC和MEKC分析結果，兩組的數據非常相近，測定結果的相對差值在-1.66%0.22%之間。Croubels等24比較了用 CZE, MEKC和HPLC分離四環素、二氧 四環素和二氯四環素的分離特性，在0.2 mol.L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH 2.2）中添加適當的表面活性劑Triton-100或Tween 20與Tween 80的混合物可使分離效果得到很大的提高，但在含有Triton-100和Briji-35的電泳液中添加 &CD時則分離未改善。而用 HPLC分離由于受到 酸度的影響，得不到滿意的分析結果。3

16、.1.6激素、管族類化合物管族類化合物或卵巢激素等，一般是脂溶性和電中性的，比較適合采用 MEKC法進行分離分析，但是由于這類化合物的親脂能力強，在水中不溶或 難溶，很容易溶解于具有直鏈烷基的表面活性基SDS形成的膠束中，這種情況也給分離帶來困難。筆者25利用非水溶劑的 MEKC法對3種番族化合物進行分離，發現以含有20mmol.L-1 NaH2PO4和180 mmol.L-1 SDS的甲酰胺有機溶劑為電泳液時，分離效果好，其 譜圖如圖2所示。除了用有機溶劑體系使試樣在膠束相和有機相中的分配更有利于分離的處 理方法以外，還可在電泳液中添加高濃度的尿素、環糊精等改善試樣分子在不同相中的分配比例，

17、在水相溶液中添加適當的有機溶劑是提高分離的有效手段。Vomastova等26用由0.81%己醇、6.61%丁醇、3.31% SDS和20 mmol.L-1磷酸鹽組成的微乳劑 （pH 10.0）作為CE 電泳液，分離分析了組織中11 3羥管脫氫酶，可測的濃度范圍為3X10-43X10-5 mol.L-1 ,檢出下限達1 pmol。3.2臨床應用CE在臨床應用方面的研究報道較少，主要原因是檢測問題，許多臨床樣品的濃度 都很低，并且成分復雜，所以對血液、尿、唾液等人體液中的相關藥物測定時，通常需要對 樣品進行萃取、濃縮等前處理。盡管如此，采用 MEKC作為分離手段時，也有可能直接對 血漿或尿樣中的某

18、些藥物進行分離分析。如尿樣中的阿替洛爾以及與其分子結構相類似的一類伊阻滯劑，用pH 9.0的硼酸鹽作電泳液時，能成功地分離和分析尿樣中阿替洛爾、阿米 洛利、氫氯曝嗪和茉氟曝嗪27,檢出的相關系數在線性范圍0.110 g.mL1內為0.9900.997,測定的下限為 0.10.6 pg.mL1。應用MEKC直接測定血漿、尿、唾液中黃喋吟時 在75 mmol.L-1 SDS （pH 9.0）溶液中得到良好的分離28,待測藥物的遷移時間約為712min, 15 min后才出現血漿蛋白質的吸收峰，這樣樣品中的蛋白質就不構成對分離的干擾。 血漿、尿液中的阿司匹林代謝物的測定也可以采用MEKC法29,樣品不需前處理，因為樣品中的蛋白質成分可以被表面活性劑膠束所包溶，在 MEKC過程中，待測物的泳動速 度快于蛋白質，可采用直接進樣方法，分析速度快，操作也相當方便。此外，還有許多有關 醫學上CE應用的報道，特別是針對血清、尿液和其他人體組織相關的樣品中的藥物或代謝物的測定可以參考最近發表的綜述文獻30。4結語CE由于它所能應用的藥物種類相當多，僅近5年發表的論文已近千篇，對它們進行全面的綜述評價是有相當難度的，筆者只能