1、細胞原生質體的制備一植物原生質體分離和活性鑒定一、實驗目的學習植物細胞原生質體分離純化的方法。了解原生質體活性鑒定的原理。了解植物原生質體分離、融合和培養的基本原理及其過程二、實驗原理去掉植物細胞壁的方法可以是機械的人工操作，也可以利用酶解法。較早利用機械法制備原生質體的酶解法分離原生質體是一個常用的技術，其原理是植物細胞壁主要由 纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶 和果膠酶能降解細胞壁成分，除去細胞壁，即可得到原生質體。由于 原生質體內部與外界環境之間僅隔一層薄薄的細胞膜，必須保持在 滲透壓平衡的溶液中才能保持其完整性。其次，還應當考慮取材、 酶的種類和純度、酶液 的

2、滲透壓、酶解時間及溫度等因素對分離原 生質體的影響。測定原生質體的活性有多種方法。熒光素雙醋酸酯(FDA )染色是常 用的一種方法，FAD本身無熒光，無極性，可透過完整的原生質膜。 一旦進入原生質體后，由于受到酯酶分解而產生 具有熒光的極性物 質熒光素。它不能自由出入原生質膜，因此有活力的細胞能產生熒 光，無活力的原生質體不能分解FAD無熒光產生。PEG作為一種高分子化合物，2050%的濃度能對原生質體產生瞬間 沖擊效應，原生質體很快發生收縮與粘連，隨后用高Ca高pH法進 行清洗.使原生質體融合得以完成。PEG誘導融合的機理：PEG由于含有醚鍵而具負極性，與水、 蛋白質和碳水化合物等一些正極化

3、基團能形成氫鍵，當PEG分子足 夠長時，可阼為鄰近原生質表面之間的分子橋而使之粘連。PEG也能 連接Ca2+等陽離子，Ca2+可在一些負極化基團和PEG之間形成橋， 因而促進粘連。在洗滌過程中，連接在原生質體膜上的PEG分子可 被洗脫.這樣將引起電荷的紊亂和再分布.從而引起原生質體融合： 高Ca高pH由于增加了質膜的流動性，因而也大大提高了融合頻率， 洗滌時的滲透壓沖擊對融合也可能起作用。原生質體分離純化或融合后，在適當的培養基上應用合適的培養 方法，能夠再生細胞壁，并啟動細胞持續分裂，直至形成細胞團，長 成愈傷組織或胚狀體，再分化發育成苗。其中，選擇合適的培養基及 培養方法是原生質體培養中最

4、基礎也是最關鍵的環節。三、實驗用品材料：綠豆，煙草幼苗葉片，油菜或菠菜或煙草等。試劑：酶解液(綠豆)：1%(W/V)纖維素酶，1% (W/V)果膠酶，0.7mol/L 甘露醇;10mmol/L CaCl，2.2H2O, 0.7mmol/L KH2PO4, pH 6.8 7.0。 13%CPW 洗滌液（綠豆）：27.2mg/L KH2PO4，101.0 mg/L KNO3,1480.0mg/LCaCl, 2.2 H20 , 246.0 mg/L MgSO4, 0.16 mg/L KI, 0.025 mg/L CuSO4 5H2O, 13%(W/V)甘露醇，pH 6.0。0.1%2-N-嗎啡啉乙磺

5、酸鈉或三羥 甲基氨基甲烷溶液：內含20% 蔗糖，pH6.0。0.02%二乙基熒光素(FDA):5mgFDA溶于1ml丙酮中，避光4C下 貯存，使用 時取0.22mlFDA貯存液加入5ml0.65mol/L甘露醇中. 使用時，使最終濃度為0.01%。20%蔗糖溶液無菌蒸餾水。儀器：搖床，離心機，倒置顯微鏡，普通顯微鏡，超凈工作臺， 培養皿，離心管，載玻片，刀片，鑷子，過濾漏斗，200日篩網，吸 管，高壓蒸汽，消毒鍋，鑷子，解剖刀。四、實驗方法步驟1.分離原生質體綠豆幼苗下胚軸： 綠豆種子用70%乙醇消毒，自來水流 水浸泡4h左右，于濕濾紙 上萌發。25C黑暗中培養約60h。取幼苗下胚軸或根為材料

6、進行分離 原生質體。(2)取黃化幼苗下胚軸23g，從彎鉤下3mm處 向下切取約5mm的 切段，切成0.5mm的薄片置于10 ml酶解液中(也可以取1cm左右的 綠豆幼苗的根尖作為實驗材料，直接置于酶解液中)。置于搖床上，2528C，6070r/min，酶解 67h。(3)用200日篩網過濾酶解液(制一張裝片，觀察)，濾液經1000rpm 離心5min，棄去上清液。 用34ml13%CPW液洗滌并溶解沉淀，懸液經1000rpm離心 5min，留1ml上清液，其余棄之。取10ml離心管1支，注入3ml20%25%蔗糖，將沉淀的原生質 體懸浮，用滴管吸出懸液小心地鋪于蔗糖溶液上，1000rpm離心5

7、 8min，將位于中間一層的原生質體用吸管小心吸出至另一離心管中， 沉淀制一張裝片，觀察。用13% CPW液洗滌12次，每次1000rpm離心5min，得到較 為純凈的原生質體。用13% CPW液懸浮至一定密度并制一張裝片， 觀察。取1滴原生質體提取液在載玻片上，加入相同體積的0.02%FDA 稀釋液，靜置2min后，于熒光顯微鏡下觀察，發綠色熒光的為有活 力的原生質體，沒有產生熒光的原生質體無活力。將1-2滴原生質體混合物(密度分別為105 一 106/ml )滴入小培 養皿，靜置810分鐘。相對方向加入2滴40%的PEG溶液，靜置 10分鐘，依次間隔5分鐘加入0.5ml、1 ml和2 ml含13%甘露醇的 CPW洗液洗滌，注意在第二、三次洗液加入前，用移液器輕輕吸走部 分溶液，但不能吸干，否則原生質體破碎死亡；最后用液體培養基洗 l 一 2次即可進行培養： 培養將原生質體或融合體懸液鋪于愈傷組織誘導培養基(固體)上進行淺 層培養，在溫度252C，光照度1000Lx，光照1416h/d的條件下 培養，經1-2個月后在培養基上出現肉眼可見的細胞團。細胞團長到 24mm左右，即可轉移到分化培養基上，誘導分化芽和根，長成小 植株。3、收集純化用吸管將酶解液吸至5mL離心管中，以600rpm離心5分鐘以 上，使原生質體沉降