1、第6講植物細胞代謝產物制備I讓時間忘記我，讓記憶忘記我，讓思念忽略這一切。我洶涌或者平和的情緒，如水如夢。當人即使在夢中，仍不知幸福的所在，那才是最深的悲傷。一路的荒野，我們萬水千山。 田維人生苦短，若虛度年華，則短暫的人生就太長了。-英國劇作家 莎士比亞.畢業面試多，前期注意好：簡歷很重要，一定準備好；心態放端正，莫讓失眠找；保持心情好，記住常微笑；自信要帶好，發揮會更好！朋友，祝你前途一片輝煌。衣帶漸寬終不悔，為伊消得人憔悴。柳永鳳棲梧 死生契闊，與子成說。執子之手，與子偕老。佚名詩經邶風擊鼓 兩情若是久長時，又豈在朝朝暮暮。秦觀鵲橋仙 相思相見知何日？此時此夜難為情。李白三五七言 有美人

2、兮，見之不忘，一日不見兮，思之如狂。佚名鳳求凰琴歌 這次我離開你，是風，是雨，是夜晚；你笑了笑，我擺一擺手，一條寂寞的路便展向兩頭了。鄭愁予賦別 入我相思門，知我相思苦，長相思兮長相憶，短相思兮無窮極。李白三五七言 曾經滄海難為水，除卻巫山不是云。元稹離思五首其四 君若揚路塵，妾若濁水泥，浮沈各異勢，會合何時諧？曹植明月上高樓在這個世界上，只有真正快樂的男人，才能帶給女人真正的快樂。第6講植物細胞代謝產物制備I第6講植物細胞代謝產物制備I讓時間忘記我，讓記憶忘記我，讓思念忽略這一切。我洶涌或者平和的情緒，如水如夢。當人即使在夢中，仍不知幸福的所在，那才是最深的悲傷。一路的荒野，我們萬水千山。

3、田維人生苦短，若虛度年華，則短暫的人生就太長了。-英國劇作家 莎士比亞.畢業面試多，前期注意好：簡歷很重要，一定準備好；心態放端正，莫讓失眠找；保持心情好，記住常微笑；自信要帶好，發揮會更好！朋友，祝你前途一片輝煌。衣帶漸寬終不悔，為伊消得人憔悴。柳永鳳棲梧 死生契闊，與子成說。執子之手，與子偕老。佚名詩經邶風擊鼓 兩情若是久長時，又豈在朝朝暮暮。秦觀鵲橋仙 相思相見知何日？此時此夜難為情。李白三五七言 有美人兮，見之不忘，一日不見兮，思之如狂。佚名鳳求凰琴歌 這次我離開你，是風，是雨，是夜晚；你笑了笑，我擺一擺手，一條寂寞的路便展向兩頭了。鄭愁予賦別 入我相思門，知我相思苦，長相思兮長相憶，

4、短相思兮無窮極。李白三五七言 曾經滄海難為水，除卻巫山不是云。元稹離思五首其四 君若揚路塵，妾若濁水泥，浮沈各異勢，會合何時諧？曹植明月上高樓在這個世界上，只有真正快樂的男人，才能帶給女人真正的快樂。內容安排：植物細胞培養：植物細胞培生產次級代謝產物的應用舉例分析與討論：植物組織培養及應用舉例分析植物細胞培養得到的常見次級代謝物紫草寧小檗堿（黃連素）花青素，花黃素銀杏黃酮銀杏內酯白果內酯蒽醌青蒿素超氧化物歧化酶木瓜蛋白酶木瓜凝乳蛋白酶香豆素薄荷醇人參皂甙類胰島素紫杉醇地高辛利血平奎寧堿長春花堿尼古丁魚騰酮迷迭香酸紫草細胞黃連細胞玫瑰茄細胞，紫蘇細胞銀杏細胞銀杏細胞銀杏細胞巴戟天細胞黃花蒿細胞大

5、蒜細胞番木瓜細胞番木瓜細胞胡桐細胞，薰衣草細胞薄荷細胞人參細胞苦瓜細胞紅豆杉細胞毛地黃細胞羅夫木細胞金雞納細胞長春花細胞煙草細胞魚藤細胞鼠尾草細胞，鞘心花細胞色素，消炎消炎、止瀉食用色素，抗氧化疏通血管，抗氧化治療心血管疾病治療大腦和神經系統疾病抗菌消炎，抗腫瘤抗瘧疾，退熱藥抗氧化、抗輻射、抗衰老消炎，肉質嫩化治療骨質增生，血型檢測抗病毒，香精食用香精調節免疫功能，保健治療糖尿病抗腫瘤強心藥降血壓抗瘧疾治療白血病殺蟲殺蟲消炎，抗氧化長春新堿長春堿長春花細胞培養生產生物堿銀杏細胞培養生產黃酮、萜類化合物紅豆杉細胞培養生產紫杉醇玫瑰茄等植物細胞培養生產色素一 植物細胞培養的定義植物細胞培養（Pla

6、nt cell culture）是在離體條件下，將分離的植物細胞通過繼代培養增殖，獲得大量細胞群體的一種技術。獲得的細胞群體可以作為制備有價值代謝產物的原料，也可以作為基礎研究的材料。同時植物細胞培養技術也是人工種子、原生質體培養、花藥培養等的支撐技術。二 植物細胞特點三 植物細胞培養歷史20世紀50年代，泰爾克（Talecke）和尼克爾（Nickell）證實植物細胞可生長在懸浮培養液中。隨后，人們發現離體培養的植物細胞具有合成代謝產物的能力。1956年，尼克爾（Nickell）和盧荻（Routin）申請了第一個用植物細胞培養生產化學物質的專利。20世紀80年代后期，紫草寧等細胞培養生產獲得了

7、產業化（紫草寧可以用作創傷、燒傷以及痔瘡的治療藥）。四 植物細胞培養技術（一）培養基植物細胞培養的培養基主要由碳源、氮源、無機鹽、維生素、植物生長激素、有機酸和一些復合物質組成。目前應用廣泛的基礎培養基有MS、B5、N6等。問題2：植物組織培養的培養基組成有哪些？無機鹽：大量元素NSPKCaMg等、微量元素有機物：糖類、氨基酸、維生素等調節物質：激素與微生物培養基相比：需要大量無機鹽；多種維生素和激素；一般采用無機氮源；一般以蔗糖為碳源。（二）植物單細胞分離與初步培養植物細胞培養首先需要從植物樣品制備單細胞問題3：植物組織培養、細胞融合時單個植物細胞是如何獲得的？1.由完整的植物器官分離單細胞

8、（1）酶解法 選擇專一性水解酶在溫和的條件下將植物細胞壁物質（纖維素、果膠、多糖）降解，從而使細胞彼此分開，這種方法稱為酶解法。經常采用的生物酶包括：纖維素酶、果膠酶等。（1） 酶解法Takebe等（1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞。加酶過濾、離心內容安排：植物細胞培養：植物細胞培生產次級代謝產物的應用舉例分析與討論：植物組織培養及應用舉例分析植物細胞培養得到的常見次級代謝物紫草寧小檗堿（黃連素）花青素，花黃素銀杏黃酮銀杏內酯白果內酯蒽醌青蒿素超氧化物歧化酶木瓜蛋白酶木瓜凝乳蛋白酶香豆素薄荷醇人參皂甙類胰島素紫杉醇地高辛利血平奎寧堿長春花堿尼古丁魚騰酮迷迭香酸紫草細胞黃連

9、細胞玫瑰茄細胞，紫蘇細胞銀杏細胞銀杏細胞銀杏細胞巴戟天細胞黃花蒿細胞大蒜細胞番木瓜細胞番木瓜細胞胡桐細胞，薰衣草細胞薄荷細胞人參細胞苦瓜細胞紅豆杉細胞毛地黃細胞羅夫木細胞金雞納細胞長春花細胞煙草細胞魚藤細胞鼠尾草細胞，鞘心花細胞色素，消炎消炎、止瀉食用色素，抗氧化疏通血管，抗氧化治療心血管疾病治療大腦和神經系統疾病抗菌消炎，抗腫瘤抗瘧疾，退熱藥抗氧化、抗輻射、抗衰老消炎，肉質嫩化治療骨質增生，血型檢測抗病毒，香精食用香精調節免疫功能，保健治療糖尿病抗腫瘤強心藥降血壓抗瘧疾治療白血病殺蟲殺蟲消炎，抗氧化三 植物細胞培養歷史20世紀50年代，泰爾克（Talecke）和尼克爾（Nickell）證實植

10、物細胞可生長在懸浮培養液中。隨后，人們發現離體培養的植物細胞具有合成代謝產物的能力。1956年，尼克爾（Nickell）和盧荻（Routin）申請了第一個用植物細胞培養生產化學物質的專利。20世紀80年代后期，紫草寧等細胞培養生產獲得了產業化（紫草寧可以用作創傷、燒傷以及痔瘡的治療藥）。四 植物細胞培養技術（一）培養基植物細胞培養的培養基主要由碳源、氮源、無機鹽、維生素、植物生長激素、有機酸和一些復合物質組成。目前應用廣泛的基礎培養基有MS、B5、N6等。問題2：植物組織培養的培養基組成有哪些？無機鹽：大量元素NSPKCaMg等、微量元素有機物：糖類、氨基酸、維生素等調節物質：激素與微生物培養

11、基相比：需要大量無機鹽；多種維生素和激素；一般采用無機氮源；一般以蔗糖為碳源。（二）植物單細胞分離與初步培養植物細胞培養首先需要從植物樣品制備單細胞問題3：植物組織培養、細胞融合時單個植物細胞是如何獲得的？1.由完整的植物器官分離單細胞（1）酶解法 選擇專一性水解酶在溫和的條件下將植物細胞壁物質（纖維素、果膠、多糖）降解，從而使細胞彼此分開，這種方法稱為酶解法。經常采用的生物酶包括：纖維素酶、果膠酶等。（1） 酶解法Takebe等（1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞。加酶過濾、離心（2）機械法第一種方法：用刀片刮葉片撕去下表皮露出葉肉細胞用解剖刀刮下細胞第二種方法：葉片研碎

12、、離心研碎成粉加研磨介質過濾、離心 2.由愈傷組織分離單細胞 通過培養植物外植體誘導產生愈傷組織，并使其大量增殖，再通過機械震蕩或者酶解的方法使細胞分離從而獲得游離的細胞。莖段步驟：誘導產生愈傷組織；(2) 愈傷組織反復繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；搖床用于振蕩繼代懸浮15ml medium/1g120rpm culturetransfer 1time/3d 3 weeks100-130目網過濾Centrifuge(離心） isolation(3)（Suspension culture)將愈傷組織在液體培養基中培養，建立懸浮培養物 細胞平板培養概念：將制備好的單細胞懸浮液，按照一

13、定的細胞密度，接種在1mm左右的薄層固體培養基上進行培養，稱之為平板培養。主要技術要點： 單細胞的分離：一般采用酶分離法，小細胞團不能超過6個細胞，因此過濾時網篩的網眼要選擇合適。 單細胞懸浮液的制備：分離的單細胞經培養基洗滌2次以后，調整密度為5105/ml。 植板：將1份已調整好密度的單細胞懸浮液與4份35的固體培養基充分混合均勻，然后均勻的平鋪于培養皿中，其厚度為1-2mm。待植板后的培養基完全凝固后，用石蠟或封口膜將培養皿封嚴以防污染，在25黑暗條件下培養3周即可長出肉眼可見的細胞團。細胞懸浮過濾與培養基混合植板培養克隆愈傷組織看護培養nursing culture） 用一塊活躍生長的

14、愈傷組織來看護單個細胞，使其持續分裂和增殖。這塊愈傷組織被稱為看護組織。由繆爾（Muir）于1953年創立。具體方法：將單個細胞接種于濾紙上，再置于愈傷組織之上培養。優點是：簡便、成功率高。缺點是不能在顯微鏡下直接觀察。微室培養概念：人工制造一個小室，將單細胞培養在小室中的少量培養基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法，稱微室培養。飼養層培養（Feeder layer culture） 把處理過的（如X射線處理）無分裂能力或分裂很慢的細胞來飼養所需培養的細胞，使其分裂和生長。（三）繼代培養1.固體培養 平板培養法是經常采用的一種固體培養方式，將一定量細胞接種到或混合到裝有一薄層固體培養基（含瓊脂A

15、gar）的培養皿內進行培養。類似于微生物細胞的平板培養，具體步驟包括：單細胞懸浮液的制備、計數、調節細胞密度、培養基選擇、澆平板、接種培養。2.液體培養 采用液體培養基進行細胞培養。（四）植物細胞懸浮培養懸浮培養的生物反應器 一般所說的生物反應器是指細胞培養生物反應器，是為細胞生長提供合適的化學與物理環境并能檢測控制細胞生長的裝置。一般都有三部分組成：反應罐、控制系統、檢測分析系統。問題4.與傳統微生物發酵罐相比，植物細胞培養的生物反應器有什么特點？植物細胞培養的特殊要求植物細胞培養反應器最初大多采用微生物反應器。由于植物細胞與微生物細胞形態結構不同，植物細胞較微生物細胞大，對剪切力耐受性差，

16、而且對氧的要求相對微生物要低得多，因此微生物反應器并不完全適合于植物細胞生長與生產。植物細胞培養具有周期長、細胞抗剪切能力弱、易團聚等特點。同時，植物細胞規模培養的目的是生產天然產物，而這些天然產物均為細胞次生代謝物。所以，植物細胞培養反應器的設計，不僅要考慮有利于細胞生長，同時還要考慮有利于產物的積累和分離。總體上講，適合植物細胞的反應器應該具有適宜的氧傳遞、良好的流動性和較低的剪切力。光照的提供：外光源、內光源，透明材料。結構盡量簡單。機械攪拌式生物反應器（Stirred tank bioreactor）一般由罐體、攪拌槳、控溫系統、氣路、傳感器等組成。依靠攪拌器使液體產生軸向流動和徑向流

17、動。該生物反應器的優點是攪拌充分，供氧能力和混合效果較好。攪拌罐中產生的剪切力大，容易損傷細胞，直接影響細胞的生長和代謝，特別對于次級產物生成影響極大。需要對攪拌罐進行改進，包括改變攪拌形式、葉輪結構與類型、空氣分布器等，力求減少產生的剪切力，同時滿足供氧與混合的要求。不同葉輪產生剪切力大小順序為：渦輪狀葉輪平葉輪折葉漿螺旋狀葉輪Kaman等采用帶有1個雙螺旋帶狀葉輪helical ribbon impeller)和3個表面擋板的攪拌罐，證明適于剪切力敏感的高密度細胞培養。離心槳生物反應器采用三葉螺旋槳，同時采用微孔金屬絲網作為空氣分布器，能提供良好的混合狀態，具有比機械攪拌槳低的剪切力。氣升

18、式生物反應器(Air-lift bioreactor)由氣升室、氣降室、除氣室和底部四部分組成。培養液循環的動力來自于氣升室、氣降室中因含氣量不同而在底部產生的壓力差，因而比鼓泡型有更均一的流動形式。根據反應器內部結構與氣體分布器的位置不同可分為內環流和外環流兩種鼓泡式生物反應器(Bubble column bioreactor)又稱為鼓泡塔式反應器，是最簡單的氣動式生物反應器。氣體分布器一般位于底部中央，氣體從底部通過噴嘴或孔盤進入反應器。它不含轉動部分，整個系統密閉，易于無菌操作。不同于氣升式生物反應器，液體在反應器內部呈無規律的湍流狀態。培養過程中沒有機械能消耗，適合于培養對剪切力敏感的

19、細胞。然而對高密度及粘度較大的培養物，反應器的混合效率會降低。其它類型生物反應器轉鼓式生物反應器(Rotating drum bioreactor)因為轉子的轉動帶動培養罐轉動，促進了氣體交換與營養物質的吸收，具有懸浮系統均一、低剪切力、防止細胞粘附在壁上的優點，適合于高密度植物懸浮細胞的培養，已用于長春花、紫草的細胞懸浮培養。（五）植物細胞固定化培養問題5：植物細胞固定化培養有什么優點？細胞固定化培養（Cell immobilization culture）是指將游離的細胞包埋在支持物內部或表面進行培養的一門技術。是在20世紀70年代的酶固定化催化技術基礎上發展起來的。1979年，布洛德利斯

20、（Brodelius）首次成功利用固定化的毛地黃、長春花細胞制備次級代謝產物。與細胞懸浮培養相比，植物細胞固定化培養具有以下優點：1.細胞經包埋后使所受的剪切力損傷減小，維持了細胞的穩定性，適合脆弱的植物細胞的培養，同時也利于采用傳統生物反應器大規模培養。2.懸浮細胞培養體系中細胞密度比較高時會因粘度增加引起傳質困難。固定化細胞培養系統中細胞密度遠高于懸浮培養，但并不會改變培養液流體性質，利于傳質。3.大多數植物次級代謝產物合成在生長停止后才大量合成。采用固定化培養可以將細胞生長與產物合成分成兩個階段。4.細胞生長較為緩慢，利于次級代謝產物的積累。5.固定化增加了細胞與細胞間的接觸，促進了細胞

21、間信息傳遞，利于代謝產物的合成。6.固定化細胞可以反復使用，可以方便地進行產物的連續性收獲，降低了成本。1.固定化方法吸附、交聯、共價結合、包埋等。（1）吸附固定法 通過物理吸附、離子吸附（依靠靜電引力固著在帶有異電荷的載體上）等方法使細胞固定在載體上。（2）共價結合法 細胞表面的基團（如氨基、巰基、咪唑基、酚羥基等）和固相支持物表面的基團之間形成化學共價鍵連接，從而成為固定化細胞。（3）包埋法將細胞包埋在多孔載體內部制成固定化細胞。優點：步驟簡便、條件溫和、負荷量大、細胞泄漏少，抗機械力損傷，是目前采用較多的細胞固定方法。缺點：擴散限制，并非所有細胞都能處于最佳基質濃度，且大分子基質不能滲透

22、到內部。A 凝膠包埋/v_show/id_XMTM4MzI3NTI0.html問題5：與前面講過的哪個內容相似？微囊化（Microencapsulation）是利用天然的或者合成的高分子材料作為囊壁材料將細胞包裹成微米級的微小球囊，形成的微囊膜是親水半透膜，培養基的營養成分以及代謝產物可以通過微囊膜進行交換。海藻酸鹽(Alginate)-多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)微囊化在Ca2+離子等多價陽離子的存在下，海藻酸鹽的羧基和陽離子之間形成離子鍵。因海藻酸鈣不溶于水，從而在細胞表面形成凝膠。如果采用磷酸、檸檬酸、EDTA等螯合劑處理將Ca2+離子除去，又能使膠體溶解釋放出細胞。當海藻酸

23、鈣微囊用多聚賴氨酸處理后，使凝膠微球表面成膜，不會再被螯合劑溶解。再用檸檬酸去除鈣離子，球內海藻酸鈉成液態，細胞懸浮在微囊內。瓊脂糖(Agarose)凝膠包埋將細胞懸浮于經過滅菌處理的瓊脂糖中，不斷攪拌，待混合物凝結后，將包埋有細胞的瓊脂糖凝塊擠進無菌的金屬網中，使其分散成小顆粒。清洗顆粒后轉入適當的培養基中進行培養。這種方法雖然簡單，但因制得的顆粒較大、形狀不規則。2.固定化細胞的活力測定染色法 例如：熒光素二乙酸酯（Fluorescein diacetate,FDA）染料能被活細胞吸收，酶解脫去乙?；惯@種染料產生熒光。死亡的細胞沒有這種現象，因此可以判定固定化后的細胞是否具有活性。呼吸

24、強度測定 采用氧電極法測定細胞的呼吸作用來表示細胞的存活率。細胞生長和分解速率的測定 細胞數量或重量的增加可以作為細胞活性的指標。由于植物細胞的聚集性特點，采用濕重或干重法比較方便實用。3.固定化細胞培養的生物反應器對于固定化的植物細胞可以：（1）采用合適的機械攪拌式生物反應器、氣升式生物反應器、鼓泡式生物反應器等進行培養。（2）也可將細胞直接吸附或包埋在特殊設計的生物反應器內的介質表面或內部進行培養。流化床生物反應器(Fluid-bed bioreactor)通過通入液體或氣體使固定化細胞懸浮于反應器中。傳質效率高，但是碰撞會破壞固定化細胞。填充床生物反應器(Pipe-cone bio-filter reactor)細胞固定在支持物的內部或表面，細胞固定不動，流體按照一定方向從反應器中流過實現混合和傳質?？梢允谴怪钡?，也可以是水平的。一種垂直的填充床生物反應器示意圖如圖。優點是單位體積細胞的容量大。缺點是混合效率低、易造成傳質困難、固定床顆?；蛑С治锼槠瑫枞后w的流動。涓流床生物反應器(Trickle bed bioreactor)又稱滴流床反應器，細胞固定在反應器內部，氣體從下往上流動，而液體