1、第13章 毛細(xì)管電泳法capillary electrophoresis, CE第3節(jié) 毛細(xì)管電泳儀capillary electrophoresis apparatus第4節(jié) 毛細(xì)管電泳的分離模式separate types of CE第5節(jié) 應(yīng)用與進(jìn)展application and advances of HPCE第1節(jié) 概述generalization第2節(jié) 毛細(xì)管電泳理論basic theory of CE2022/7/25第13章 毛細(xì)管電泳法一、概述generalization二、經(jīng)典電泳法traditional electrophoresis三、毛細(xì)管電泳法capillary e

2、lectrophoresis第1節(jié)概 述generalizationcapillary electrophoresis, CE2022/7/25 利用電泳現(xiàn)象對(duì)某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。 電泳：是指帶電粒子（離子或膠粒）在電場(chǎng)的作用下，以一定的速度在緩沖溶液中的定向泳（移）動(dòng)。 第1節(jié) 概述 generalization 按實(shí)驗(yàn)設(shè)備的形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳； 按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電 泳、自由電泳； 電泳法或電泳分析：2022/7/25 高效毛細(xì)管電泳（high performance capillary electrop

3、horesis，HPCE），是一類以裝有緩沖溶液的熔融彈性石英毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的分離效率極高分離分析方法。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75 m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬(wàn)/m，促進(jìn)電泳技術(shù)的迅速發(fā)展，成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)高效毛細(xì)管電泳。傳統(tǒng)電泳法的局限性： 分離效率低、重現(xiàn)性差。 焦耳熱（離子流的內(nèi)熱）較大，譜帶增寬，柱效降低。2022/7/25 方法的原理與過(guò)程：在高壓直流電場(chǎng)力的作用下，處于很細(xì)（內(nèi)徑2575m，長(zhǎng)30100cm）毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)溶液中的不同組分，由于所帶電荷及性質(zhì)的差異，遷移速率不同，經(jīng)

4、過(guò)一定時(shí)間后，各組分將按速度的大小順序，在不同時(shí)間依次到達(dá)檢測(cè)器而被檢測(cè)，從而得到按時(shí)間分布的電泳圖譜，圖譜上的遷移時(shí)間（ tm ）用作定性，峰面積用作定量。2022/7/25HPCE的優(yōu)點(diǎn)： 電泳過(guò)程在毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行，易散熱，降低了焦耳熱 柱效高（ 105 107/m理論塔板數(shù)）、分離速度快 操作方便，分析成本低（水介質(zhì)中進(jìn)行）。 應(yīng)用范圍極廣：有機(jī)物、無(wú)機(jī)物、生物、中性分子；生物大分子等原因是：高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)。 一是 采用了很細(xì)內(nèi)徑的毛細(xì)管, 二是 施加了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。2022/7/25毛細(xì)管電泳與色譜的比較分離原理：同屬于分離方法，但原理不同。分離過(guò)程：都是差

5、速遷移過(guò)程，可用相同的理論 來(lái)描述，如色譜中所用的一些名詞概 念和基本理論，如保留值、塔板理論 和速率理論等均可借用于CE中。儀器流程：都包括進(jìn)樣部分、分離柱、檢測(cè)器和 數(shù)據(jù)處理等部分。2022/7/25第13章毛細(xì)管電泳法一、電泳和電泳淌度electrophoresis and mobility二、電滲與電滲率electroosmosis and electroosmotic mobility三、表觀淌度和權(quán)均淌度apparent mobility四、分離效率和分離度separation efficiencyand Resolution第2節(jié)毛細(xì)管電泳理論capillary electrop

6、horesis,CEbasic theory of HPCE2022/7/25第2節(jié) 基本原理當(dāng)帶電粒子以速度u在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí)，所受的電場(chǎng)力為 FE = q E 式中FE 電場(chǎng)力；q溶質(zhì)粒子所帶的有效電荷； E電場(chǎng)強(qiáng)度。帶電粒子運(yùn)動(dòng)時(shí)所受的阻力，即為摩擦力， F f = f uep 式中F f 摩擦力； f 摩擦系數(shù)； uep溶質(zhì)粒子在電場(chǎng)中的遷移速度。當(dāng)平衡時(shí)，電場(chǎng)力和摩擦力相等而方向相反，q E = f uep 一、電泳和電泳淌度 electrophoresis and mobility1.電泳和電泳速度2022/7/25則 uep = qE/f f 的大小和帶電粒子的大小、形狀以及介質(zhì)粘

7、度有關(guān)。對(duì)于球形粒子， ；對(duì)于棒狀粒子， 其中 是離子半徑； 是液體介質(zhì)的粘度。所以或 當(dāng)E與 一定時(shí)，q/r 越大，即體積越小，電荷越高的粒子uep越高，遷移越快；q/r 越小，即體積越大，電荷越低的粒子uep越低，遷移越慢； 不同物質(zhì)在同一電場(chǎng)中，由于它們的有效電荷、形狀及其大小的差異，因它們電泳遷移速度的不同，而實(shí)現(xiàn)相互分離。球形粒子棒狀粒子中性粒子電泳速度為零！2022/7/252.電泳淌度 ：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下的平均電泳速度。 棒狀粒子球形粒子不同組分有不同的電泳淌度。2022/7/253.有效淌度 在實(shí)際溶液中，離子活度系數(shù)、溶質(zhì)分子的離解程度均對(duì)粒子的淌度有影響，考慮了這些影響因素后

8、的淌度稱為有效淌度。式中 為樣品分子的第i級(jí)離解度， 為活度系數(shù)。 總之，帶電粒子在電場(chǎng)中的遷移速度，除與電場(chǎng)強(qiáng)度和介質(zhì)特性有關(guān)外，還與粒子的解離度、電荷數(shù)及其大小和形狀有關(guān)。2022/7/25二、電滲和電滲流 electroosmosis and electroosmotic mobility1.電滲 當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面由于某種原因帶一種電荷（如石英毛細(xì)管柱內(nèi)壁，當(dāng)內(nèi)充液pH3時(shí)，表面電離成Si-O-,帶負(fù)電荷），因靜電引力使其周?chē)后w帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。2022/7/252. 電滲流（ electroosmotic flow，EOF ）電滲現(xiàn)

9、象中整體移動(dòng)著的流體叫電滲流。其速度為uos。 當(dāng)在毛細(xì)管兩端施加電壓時(shí)，帶正電荷的陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)，由于這些陽(yáng)離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起管中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)(管內(nèi)液體猶如帶電外殼所包圍)，這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)叫電滲。 （由于外加電場(chǎng)對(duì)管壁溶液雙電層的作用，所引起的管內(nèi)液體的整體流動(dòng)）2022/7/253. 電滲流的速度與方向 電滲流的速度用 表示，取決于電滲淌度 和電場(chǎng)強(qiáng)度E ，即 在通常的毛細(xì)管區(qū)帶電泳條件下，電滲流從陽(yáng)極流向陰極，其大小受電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的極性、Zeta電勢(shì)、和介質(zhì)粘度的影響。 是粒子的Zeta電勢(shì)，近似地正比于 ，即粒子的表面電荷越大，摩爾質(zhì)量越小， Ze

10、ta電勢(shì)越大。 當(dāng)其他條件一定時(shí)，不同的帶電離子可按其表面電荷密度的差異，而有不同的電滲淌度實(shí)現(xiàn)相互分離。 2022/7/252022/7/25在一般情況下，電滲流的速度是電泳速度的5-7倍。 實(shí)際電泳分析中，可按下式計(jì)算 uos = Lef/tos Lef 毛細(xì)管有效長(zhǎng)度（毛細(xì)管的進(jìn)樣端至檢測(cè)窗的長(zhǎng)度）； tos電滲流標(biāo)記物（中性物質(zhì)）的遷移時(shí)間。2022/7/25電滲流的方向 電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)： 內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極； 內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽(yáng)極； 石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法： （1）毛細(xì)管改

11、性 表面鍵合陽(yáng)離子基團(tuán)； （2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑 內(nèi)充液中加入大量的陽(yáng)離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽(yáng)極。2022/7/254. 電滲流的流形 高效液相色譜中的溶液流動(dòng)為層流（壓力流），拋物線流型，引起譜帶展寬較大。不同驅(qū)動(dòng)力的流型和相應(yīng)的譜帶峰形電滲流的優(yōu)點(diǎn)之一是具有平面流型！譜帶展寬很小！2022/7/255. 電滲流的作用 電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的57倍； 各種電性離子在毛細(xì)管柱中的實(shí)際（表觀）遷移速度為： 陽(yáng)離子: 電泳方向與電滲流方向一致,實(shí)際遷移速度最大,最先流出柱. 中性粒子:uef = 0， uap = uos ,隨電滲流同行,

12、 中間流出柱. 陰離子:電泳方向與電滲流相反,最后流出柱或無(wú)法流出柱. 陽(yáng)離子陰離子中性分子 uef uos， uap電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出。相反時(shí)，無(wú)法流出 帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。2022/7/25操作條件的選擇工作電壓 柱效隨工作電壓的增大而增高，但工作電壓增加，工作電流也增大，焦耳熱的影響加劇，柱效反而下降。 一般通過(guò)作IV曲線來(lái)選擇體系的最佳外加電壓值。2. 緩沖液的選擇2022/7/25（1） 緩沖液的種類 所選擇的pH值范圍內(nèi)有很好的緩沖容量。 檢測(cè)波長(zhǎng)的吸收低。 自身的淌度低，即分子大而電荷小，以減少電流的產(chǎn)生。 為了達(dá)到有效的進(jìn)樣和合適的電泳淌度，

13、緩沖液的pH值至少必須比分析物質(zhì)的等電點(diǎn)高或低1個(gè)pH單位。 只要條件允許就盡可能采用酸性緩沖液，在低pH值下，吸附和電滲流值都很小，毛細(xì)管涂層的壽命較長(zhǎng)。一般多采用磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液。2022/7/25（2）緩沖液的pH值pH值增大，表觀淌度增大，分離時(shí)間縮短，柱效提高。 緩沖溶液的離子強(qiáng)度增大，電滲流減小，遷移時(shí)間延長(zhǎng)。 對(duì)于遷移時(shí)間較短的組分，其柱效隨濃度的增加而明顯增大。 （3）緩沖溶液的離子強(qiáng)度或濃度（4）緩沖溶液添加劑 在緩沖溶液中適當(dāng)添加其它試劑，如表面活性劑、有機(jī)溶劑、中性鹽類、兩性物質(zhì)和手性選擇劑等，可以改善柱效，改變選擇性，進(jìn)而改善分離度。2022/7/25圖13-7金銀

14、花樣品的毛細(xì)管電泳指紋圖譜（s）.綠原酸2022/7/252022/7/25藥物分析analysis of pharmaceutics2022/7/25應(yīng)用實(shí)例1.CZE測(cè)定葛根及其制劑正心泰膠囊中葛根素的含量 緩沖液為3OmmolL硼砂緩沖溶液(pH9.37)，電壓30 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，雙氯滅痛為內(nèi)標(biāo)物。葛根素的線性范圍10100gml，回收率為97.53%，RSD為0.9%(n=5)。2. CZE測(cè)定枸櫞酸苷多芬的含量 采用40cm75m毛細(xì)管柱，以粉防己堿為內(nèi)標(biāo)，25mmolL硼砂(pH7.89)為緩沖液，電壓14kV，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，在4min內(nèi)可完成枸櫞酸苷

15、多芬與內(nèi)標(biāo)物的分離和測(cè)定，最低檢測(cè)濃度為5gml，在2448gml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r一0.999 8)，日內(nèi)RSD1.58，日間RSD2.46%，回收率為95%105%。2022/7/253.CZE測(cè)定三烯酸腺苷二鈉制劑含量及有關(guān)物質(zhì) 采用熔融石英毛細(xì)管柱，以0.025molL磷酸氫二鈉(pH 10.2)為緩沖液，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，電壓21kV的條件下進(jìn)行定量分析。三烯酸腺苷二鈉的線性范圍為0.32.0 mgml，(r=0.993 9)，回收率99.1% ，RSD2.0 ，最小檢出濃度0.5gml。4.CZE拆分布洛芬對(duì)應(yīng)體異構(gòu)體 以20mmolL硫酸鹽為運(yùn)行緩沖液(pH 7.1)，5

16、0mmolL-CD和3OmmolL去氧膽酸鈉(SDC)為手性選擇試劑，石英毛細(xì)管柱47 cm75m，二級(jí)管陣列檢測(cè)器，214nm處檢測(cè)，運(yùn)行電壓12kV，溫度23 ，布洛芬的加樣回收率分別為97.8%和101.4% ，RSD分別為0.14%和0.26%。2022/7/25二、 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEKC）micellar electrokinetic chromatography，MEKC 由于CZE無(wú)法分離不同結(jié)構(gòu)的中性分子，為了分離不同結(jié)構(gòu)的中性分子，發(fā)展了MEKC。 該法集電泳、電滲與分配于一體，是一種電泳技術(shù)與色譜技術(shù)相結(jié)合的分離方法，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍。 MEKC是Te

17、rabe等在1984年提出的。將高于臨界膠束濃度的離子型表面活性劑加入緩沖液中形成膠束，被分析物在膠束(假固定相，準(zhǔn)固定相)和水相中進(jìn)行分配，中性化合物根據(jù)其分配系數(shù)的差異進(jìn)行分離，帶電組分的分離機(jī)理則是電泳和色譜的結(jié)合。2022/7/25 膠束準(zhǔn)固定相：在含有緩沖溶液的毛細(xì)管中加入離子型表面活性劑，當(dāng)濃度增加到一定程度時(shí)，表面活性劑分子在溶液中形成疏水基向內(nèi)，親水基向外的多分子聚集體，稱作膠束。形成膠束的最低濃度被稱作臨界膠束濃度（critical micellar concentration,CMC）。低于該濃度時(shí)，主要是以單個(gè)分子或離子狀態(tài)存在。如十二烷基硫酸鈉所形成的帶負(fù)電荷的球體膠束

18、。 在MEKC系統(tǒng)中，存在類似于色譜的兩相：一是流動(dòng)的水相，另一是起到固定相作用 的膠束相。由于該相（“固定相”）是可移動(dòng)的，這種移動(dòng)的“固定相”被稱之為準(zhǔn)固定相或假固定相。2022/7/251分離原理在MEKC中，中性溶質(zhì)按其疏水性不同，在緩沖溶液（水相）和膠束（準(zhǔn)固定相）之間分配。疏水性強(qiáng)的溶質(zhì)分配到膠束中的多，Kp大；反之，親水性強(qiáng)的溶質(zhì)分配到膠束中的少， Kp小。 當(dāng)溶質(zhì)進(jìn)入膠束時(shí)，以膠束的速度向陰極遷移；溶質(zhì)進(jìn)入緩沖溶液時(shí)，以電滲的速度向陰極遷移。在膠束中分配系數(shù)越大的溶質(zhì)，在柱中遷移時(shí)間越長(zhǎng)。從而使疏水性稍有差別的不同中性物質(zhì)在電泳中得以分離 。 總之：中性化合物根據(jù)其分配系數(shù)的差

19、異進(jìn)行分離，帶電組分的分離機(jī)理則是電泳和色譜的結(jié)合。疏水性強(qiáng)的溶質(zhì)后流出，疏水性弱的溶質(zhì)先流出2022/7/25 2.應(yīng)用 MEKC在天然藥物和中成藥的有效成分分析中最具特色，它可以排除高含量組分的基本干擾，能分離CZE無(wú)法分離的電中性化合物，適用于天然藥物中各種復(fù)雜組分的測(cè)定。中藥的有效成分種類繁多， MEKC目前主要用于生物堿、黃酮類、葸醌類、苷類化合物等各種成分的分離。2022/7/25三、毛細(xì)管凝膠電泳 capillary gel electrophoresis ，CGE 特點(diǎn)：抗對(duì)流性好，散熱性好，分離度極高。 無(wú)膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜

20、、易制備。 CGE是在毛細(xì)管內(nèi)壁將聚丙烯酰胺等交聯(lián)生成聚合物凝膠，當(dāng)帶電的被分析物在電場(chǎng)的作用下進(jìn)入毛細(xì)管后，聚合物起著類似“分子篩”的作用，試樣中各組分按分子尺寸大小進(jìn)行分離。小的分子容易進(jìn)入凝膠而后流出毛細(xì)管，大分子則受到較大的阻礙而先流出毛細(xì)管。2022/7/25四、毛細(xì)管電色譜capillary electrochromatography ，CEC五、非水毛細(xì)管電泳（NACE）non-aqueous capillary electrophoresis在有機(jī)溶劑為主要的非水體系中進(jìn)行的毛細(xì)管電泳。CEC是在毛細(xì)管中填充或在管壁涂布、鍵合類似HPLC的固定相，在毛細(xì)管的兩端施加高電壓，以電

21、滲流代替高壓泵推動(dòng)流動(dòng)相。試樣組分在兩相間的分配為分離機(jī)理的電動(dòng)色譜過(guò)程。CEC將HPLC的高選擇性和CE的高柱效有機(jī)地結(jié)合在一起。2022/7/25思考題1.簡(jiǎn)述毛細(xì)管電泳的分離機(jī)制和特點(diǎn)以及與色譜的區(qū)別。2.請(qǐng)用色譜基本理論來(lái)解釋CE能實(shí)現(xiàn)高效和高速分離的 原因。3.在CE中影響譜帶展寬的因素有哪些？4. MECC和CZE的區(qū)別是什么？5.設(shè)某CE系統(tǒng)的電壓為25kV，柱長(zhǎng)Ld為55cm，某離子的擴(kuò) 散系數(shù)為2.010-9 m/s，該離子通過(guò)柱的時(shí)間是10min。 求該毛細(xì)管柱的理論塔板數(shù)。6.設(shè)某CZE系統(tǒng)的毛細(xì)管長(zhǎng)度L=65cm，由進(jìn)樣口至檢測(cè)器 長(zhǎng)度Ld=58cm，分離電壓V=20k

22、V，擴(kuò)散系數(shù)D= 5.010-5 cm/s。測(cè)得某中性分子A的遷移時(shí)間是9.96min。求出 該系統(tǒng)的電滲淌度；求電泳淌度為2.010-5 cm/(Vs)的 陰離子B的遷移時(shí)間；以A計(jì)算的理論塔板數(shù)；求A和 B的分離度。2022/7/25第十一章高效毛細(xì)管電泳分析法一、離子分析analysis of ion二、藥物分析analysis of pharmaceutics三、手性化合物分析analysis of chiral compounds四、氨基酸分析analysis of amino acids五、核酸分析及DNA測(cè)序analysis of nucleic acids and sequen

23、ce of DNA六、新進(jìn)展及熱點(diǎn)問(wèn)題advances and special topics第五節(jié)高效毛細(xì)管電泳應(yīng)用與進(jìn)展high performance capillary electrophoresis,HPCEapplication and advances of HPCE2022/7/25一、離子分析 analysis of ion陽(yáng)離子分析 遷移方向和電滲流方向一致； 4.5min內(nèi)分離了24種金屬離子； 陽(yáng)極進(jìn)樣，陰極檢測(cè)； 具有很高的靈敏度；2022/7/25陰離子分析 陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時(shí)間長(zhǎng)、效率低； 質(zhì)量小、電荷密度大的離子如：SO4-2、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽(yáng)極端流出，在陰極端無(wú)法檢測(cè)； 加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內(nèi)分離36種陰離子；陰極進(jìn)樣，陽(yáng)極檢測(cè)；離子價(jià)態(tài)及存在形態(tài)分析；2022/7/25二、藥物分析 analysis of pharmaceutics 檢測(cè)體液或細(xì)胞中某些代