1、原理離子交換作用一般指在固相和液相之間發(fā)生的可逆的離子交換反應(yīng)，它可用于分離 各種可解離的物質(zhì)。通常離子交換劑是在一種高分子的不溶性母體引入若干活性基因。這樣人工合成的離子交換劑具有各種各樣的性能。作為不溶性母體的高分子有樹脂、纖 維素、葡聚糖、瓊脂糖或無機(jī)聚合物等，引入的活性基因可以是酸性基團(tuán)，如強(qiáng)酸型的 含有磺酸基（一SO3H）、中強(qiáng)酸型的含有磷酸基（一PO3H2、亞磷酸基（一PO2H）、弱酸型的 含有羧基（-COOH）或酚羥基（一OH）等。也可以是堿性基團(tuán)，如強(qiáng)堿型的含季銨-N+（CH ）、弱堿型的含叔胺-N（CH ）、仲胺（一NHCH） 伯胺（一NHJ等。在一定條件下，離子交換樹脂吸附

2、的物質(zhì)數(shù)量和在溶液中的物質(zhì)數(shù)量達(dá)到平衡時(shí)， 兩者數(shù)量之比稱為分配系數(shù)（平衡常數(shù)）。理想的情況是洗脫曲線和分配系數(shù)相符合，待 分離的各種物質(zhì)的分配系數(shù)，應(yīng)有足夠的差別，以Kd表示分配系數(shù)：被吸附樣品的洗脫通常采用改變pH或鹽離子強(qiáng)度，或者兩者同時(shí)改變來實(shí)現(xiàn)，這 對分離復(fù)雜的混合物是有效的。因?yàn)樵陔x子交換劑的活性集團(tuán)中，可解離離子與被分離 物質(zhì)中具有相反電荷離子間因靜電吸引而形成的離子鍵，由于pH的改變，使被分離物 質(zhì)的解離降低，電荷減少，從而降低其親和力；或因鹽離子濃度增加，鹽離子與被吸附 物質(zhì)的親和力增大，從而降低被分離初質(zhì)與離子交換劑的親和力，導(dǎo)致已結(jié)合物質(zhì)被洗 脫下來。核酸經(jīng)酸、堿或酶水解

3、可以產(chǎn)生各種核苷酸.核苷酸的可解離基團(tuán)是第一磷酸基， 含氮環(huán)上的一NH2和第二磷酸基等，它們的解離常數(shù)（pK）和由此得到的等電點(diǎn)差異，這 是進(jìn)行離子交換層析分離的基礎(chǔ)。pKal值在0.71.0之間，pKa3值在6.16.4之間， 各個(gè)核苷酸之間的數(shù)值比較接近，因此不能作為彼此分離的主要依據(jù)。而含氮環(huán)（尿苷 酸除外）的pKa2值卻不同，在2.44.5之間，各個(gè)核苷酸之間的差別較大，導(dǎo)致各個(gè)核 苦酸的pI值有顯著差別（表5-2）.這是離子交換層析分離核首酸的主要依據(jù)。實(shí)驗(yàn)八離子交換柱層析分離核苷酸一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)以酵母RNA為材料，將RNA用堿水解成單核苷酸，再用離子交換柱層析進(jìn) 行分離，最后采

4、用紫外吸收法進(jìn)行鑒定。同時(shí)通過測定各單核苷酸的含量，可以計(jì)算出 酵母RNA的堿基組成。本實(shí)驗(yàn)的目的是：了解掌握RNA堿水解的原理和方法掌握離子交換柱層析的分離原理和方法熟練掌握紫外吸收分析方法二、實(shí)驗(yàn)原理RNA的堿水解實(shí)驗(yàn)室制備單核苷酸一般用化學(xué)水解法（酸、堿水解）和酶解法RNA用酸水解 可得到嘧啶核苷酸和嘌吟堿基；用堿水解可得到2一核苷酸和3一核苷酸的混合物；用 5一磷酸二酯酶或3一磷酸二酯酶水解則分別可得到5一核苷酸或3一核苷酸。RNA用堿水解，經(jīng)過2、3一環(huán)核苷酸中間物，而后水解生成2一核苷酸和3一 核苷酸。如下圖所示。堿水解一般采用0.3M的KOH, 37C保溫1820小時(shí)就能水解完全

5、（也可以用1M KOH, 80C水解 60min 或 0.1M KOH 100C水解 20min）。水解畢，用 2M HC1O4 中和并 逐滴調(diào)節(jié)至pH=2左右，生成的KClO4沉淀，離心去除之。上清液即為各單核苷酸的混 合液。然后根據(jù)所選離子交換劑的類型，將上清液調(diào)至適當(dāng)?shù)膒H值，作樣品液備用。 一般用陽離子交換劑，pH調(diào)至1.5左右，用陰離子交換劑，pH調(diào)至89（逐滴）。此處 用KOH是為了便于除去鉀離子以降低樣品溶液中的離子強(qiáng)度。單核昔酸的離子交換柱層析分離離子交換層析是根據(jù)各種物質(zhì)帶電狀態(tài)（或極性）的差別來進(jìn)行分離的。電荷不 同的物質(zhì)對離子交換劑有不同的親和力，因此，要成功地分離某種混

6、合物，必須根據(jù)其 所含物質(zhì)的解離性質(zhì)，帶電狀態(tài)選擇適當(dāng)類型的離子交換劑，并控制吸附和洗脫條件（主 要是洗脫液的離子強(qiáng)度和pH值），使混合物中各組分按親和力大小順序依次從層析柱中 洗脫下來。在離子交換層析中，分配系數(shù)或平衡常數(shù)（Kd）是一個(gè)重要的參數(shù)：Kd = Cs / Cm式中：Cs是某物質(zhì)在固定相（交換劑）上的摩爾濃度，Cm是該物質(zhì)在流動(dòng)相中的 摩爾濃度。可以看出，與交換劑的親和力越大，Cs越大，Kd值也越大。各種物質(zhì)Kd 值差異的大小決定了分離的效果。差異越大，分離效果越好。影響Kd值的因素很多， 如被分離物帶電荷多少，空間結(jié)構(gòu)因素，離子交換劑的非極性親和力大小，溫度高低等。 實(shí)驗(yàn)中必須反

7、復(fù)摸索條件，才能得到最佳分離效果。核苷酸分子中各基團(tuán)的解離常數(shù)（pK）和等電點(diǎn)p I值見表1。表1 四種核苷酸的解離常數(shù)（pK）和等電點(diǎn)pI值核甘酸第一磷酸基pKa1第二磷酸基pKa2含氮環(huán)的亞氨基（-NH =）pKa3等電點(diǎn)pl值*尿昔酸UMP鳥昔酸GMP腺昔酸AMP胞昔酸CMP1.00.70.90.86.46.16.26.32.43.74.51.552.352.65*注：pI = （pKa1 + pKa3） / 2由表1可見，含氮環(huán)亞氨基的解離常數(shù)（pK ）值相差較大，它在離子交換分離四 種核昔酸中將起決定作用。用離子交換樹脂分離核昔酸，可通過調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值使它們的可解離基團(tuán)解 離，

8、帶上正電荷或負(fù)電荷。同時(shí)減少樣品溶液中除核昔酸外的其它離子的強(qiáng)度。這樣， 當(dāng)樣品液加入到層析柱時(shí)，核昔酸就可以與離子交換樹脂相結(jié)合。洗脫時(shí)，通過改變pH 值或增加洗脫液中競爭性離子的強(qiáng)度，使被吸附的核昔酸的相應(yīng)電荷降低，與樹脂的親 和力降低，結(jié)果使核昔酸得到分離。混合核昔酸可以用陽離子或陰離子交換樹脂進(jìn)行分離。采用陽離子交換時(shí)，控制樣 品液pH值在1.5，此時(shí)UMP帶負(fù)電，而AMP、CMP、GMP帶正電，可被陽離子樹脂 吸附。然后通過逐漸升高pH值，將各核甘酸洗脫下來，次序是UMP-GMP-CMP-AMP。 AMP與CMP洗脫位置的互換，是由于聚苯乙烯樹脂母體對嘌吟堿基的非極性吸附力大 于對嘧

9、啶堿基的吸附力造成的。本實(shí)驗(yàn)采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季銨堿型粉末陰離子樹脂Q01X8）分離四種核苷酸.首先使RNA堿水解液中的其它離子強(qiáng)度降至0.02以下，然后調(diào)pH值至6以 上，使樣品核苷酸都帶上負(fù)電荷，它們都能與陰離子交換樹脂結(jié)合。結(jié)合能力的強(qiáng)弱， 與核苷酸的pI值有關(guān)，pI 越大，與陰離子交換樹脂的結(jié)合力越弱，洗脫時(shí)越易交 換下來。由表1可見，當(dāng)用含競爭性離子的洗脫液進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫下來的次序應(yīng)該是 CMP、AMP、GMP和UMP。由于本實(shí)驗(yàn)所用的樹脂的不溶性基質(zhì)是非極性的，它與嘌 吟堿基的非極性親和力大于與嘧啶堿基的非極性親和力。所以，實(shí)際洗脫下來的次序?yàn)椋?CMP、AMP、UMP

10、和GMP。對于同一種核甘酸的不同異構(gòu)體而言，它們之間的差別僅 在于磷酸基位于核糖的不同位置上，2一磷酸基較3一磷酸基距離堿基更近，因而它的 負(fù)電性對堿基正電荷的電中和影響較大，其pK值也較大。例如2-胞苷酸的pK1=4.4， 3-胞苷酸的pKi = 4.3，因此2一核苷酸更易被洗脫下來。應(yīng)注意的是，樣品不易過濃，洗脫的流速不宜過快，洗脫液的pH值要嚴(yán)格控制。 否則將使吸附不完全，洗脫峰平坦而使各核苷酸分離不清。核昔酸的鑒定由于核苷酸中都含有嘌吟與嘧啶堿基，這些堿基都具有共軛雙鍵（一C=CC=C 一），它能夠強(qiáng)烈地吸收250280毫微米波段的紫外光，而且有特征的紫外吸收比值。 因此，通過測定各洗

11、脫峰溶液在220300毫微米波長范圍內(nèi)的紫外吸收值，作出紫外吸 收光譜圖，與下圖所示的標(biāo)準(zhǔn)吸收光譜進(jìn)行比較，并根據(jù)其吸光度比值250nm/260nm, 280nm/260nm, 290nm/260nm ）以及最大吸收峰與下頁“表2”所列標(biāo)準(zhǔn)值比較后，即可 判斷各組分為何種核苷酸。根據(jù)各組分在其最大吸收波長以max）處總的吸光度（總Amax ）以及相應(yīng)的摩爾消 光系數(shù)（E26o nm），可以計(jì)算出RNA中四種核苷酸的微摩爾數(shù)和堿基摩爾數(shù)百分組成。四種核苷酸在pH = 24時(shí)的紫外吸收光譜曲線（1）某核苷酸微摩爾數(shù) 該核苷酸峰合并液七x該峰體積（誠）x 103 該核苷酸E 260 nm（2）某堿基

12、 =該核苷酸微摩爾數(shù)四種核苷酸微摩爾總數(shù)x 100 %溶液的pH值對核苷酸的紫外吸收光度值影響較大，故測定時(shí)需要調(diào)至一定的pH 值。三、試劑與器材試劑：酵母RNA強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂201X8。聚苯乙烯一二乙烯苯一三甲胺季銨堿型， 全交換量大于3毫摩爾/克干樹脂，粉末型100200目。1M甲酸：21.4ml 88%甲酸定容至500ml。1M甲酸鈉：34.15g純甲酸鈉（注意結(jié)晶水問題）用蒸宜留水溶解，定容至500ml。0.3 M KOH: 1.68g KOH用蒸宜留水溶解定容至100ml。2 M 過氯酸 HClO4： 17ml 過氯酸（7072 % ）定容至 100ml。2 M NaOH （5

13、0ml），0.5 M NaOH （100ml）。1M HCl （100ml）。1% AgNO3 溶液。器材：層析柱梯度洗脫器，電磁攪拌器恒流泵自動(dòng)部分收集器酸度計(jì)紫外分光光度計(jì)旋渦混合器核酸蛋白檢測儀臺(tái)式離心機(jī)四、操作步驟1. RNA的堿水解：稱取20mg酵母RNA，置于刻度離心試管中，加2ml新配制的0.3 M KOH,用細(xì)玻 璃棒攪拌溶解，于37C水浴中保溫水解20小時(shí)。然后用2M HClO4 （過氯酸）調(diào)水解 液pH至2以下（要少量多次，只需幾滴即可）。由于核苷酸在過酸的條件下易脫嘌吟， 216所以滴加HC1O4時(shí)需用旋渦混合器迅速攪拌，防止局部過酸，再以4000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離 心15分

14、鐘，置冰浴中10分鐘，以沉淀完全。將清液倒入另一刻度試管中，用2 M NaOH 逐滴將清液pH值調(diào)至89，作上樣樣品液備用。樣品液上柱前，取0.1ml稀釋到500 倍，測定其在260nm波長處的光吸收值，用以最后計(jì)算離子交換柱層析的回收率。離子交換樹脂的預(yù)處理：取201X8粉末型強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂8克（濕），先用蒸餾水浸泡2小時(shí)，浮選 除去細(xì)小顆粒，同時(shí)用減壓法除去樹脂中存留的氣泡，然后用四倍樹脂量的0.5M NaOH 溶液浸泡1小時(shí)，除去樹脂中的堿溶性雜質(zhì)。用去離子水洗至近中性后，再用四倍量1M HC1浸泡半小時(shí)，以除去樹脂中酸溶性雜質(zhì)。接著用蒸餾水洗至中性（可以上柱洗）， 此時(shí)陰離子交換

15、樹脂為氯型。離子交換層析柱的裝柱方法：離子交換層析柱可使用內(nèi)徑約1cm、長10 cm的層析柱，柱下端有燒結(jié)上的垂熔濾 板，柱上端使用橡皮塞，塞子中間打一小孔。緊緊插入一根細(xì)聚乙烯管，層析柱夾在鐵 架臺(tái)上，調(diào)成垂直，柱下端細(xì)膠管用螺旋夾夾緊，向柱內(nèi)加入蒸餾水至2/3柱高，再用 滴管將經(jīng)過預(yù) 處理的離子交換樹脂加入柱內(nèi)，使樹脂自由沉降至柱底，放松螺旋夾， 使蒸餾水緩慢流出，再繼續(xù)加入樹脂，使樹脂最后沉降的高度約為67cm.。注意在裝 柱和以后使用層析柱的過程中，切勿干柱，樹脂不能分層，樹脂面以上要保持一定高度 的液面（不能太高，約1cm），以防氣泡進(jìn)入樹脂內(nèi)部，影響分離效果。樹脂的轉(zhuǎn)型處理：樹脂的

16、轉(zhuǎn)型處理就是使樹脂帶上洗脫時(shí)所需要的離子。本實(shí)驗(yàn)需要將陰離子交換樹 脂由氯型轉(zhuǎn)變?yōu)榧姿嵝停扔?00ml 1M甲酸鈉洗柱，用1%AgNO3檢查柱流出液，直 至不出現(xiàn)白色AgCl沉淀為止。然后改用約200ml 0.2M甲酸繼續(xù)洗柱，測定流出液的 A260 W 0.020為止。最后用蒸餾水洗柱，直至流出液的pH值接近中性（或與蒸餾水的 pH相同）。加入樣品并淋洗除去不被樹脂吸附的組分：加樣就是將RNA堿水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到離子交換層析柱內(nèi)，使其被離子交換樹脂吸附。 先將柱內(nèi)液體用滴管輕輕吸去，使液面下降到剛接近樹脂表面。旋緊下端螺旋夾，用滴 管準(zhǔn)確移取1.0 ml RNA堿水解樣品液，沿柱壁小心加到樹脂

17、表面，然后松開下端螺旋 夾，使樣品液面下降至樹脂表面，接著用滴管加入少量蒸餾水，當(dāng)水面降至樹脂表面時(shí)， 再用約200ml蒸餾水洗柱，將不被陰離子交換樹脂吸附的嘌吟及嘧啶堿基，核苷等雜質(zhì) 洗下來。檢查流出液在260nm波長處的吸光度，直至低于0.020為止。關(guān)恒流泵，旋緊 柱下端螺旋夾。梯度洗脫：在梯度洗脫器的混合瓶內(nèi)加入300ml蒸餾水，貯液瓶中加入300ml 0.20M甲酸一 0.20M甲酸鈉混合液（注意：梯度洗脫器底部的連通管要事先充滿蒸餾水，趕盡氣泡】 洗脫器出口與恒流泵入口用細(xì)塑料管相連，打開兩瓶之間的連通伐和出口伐，打開電磁 攪拌器，松開柱下端螺旋夾，開啟恒流泵，控制流速為5ml /

18、管/ 10分，開啟部份收 集器，分管收集流出液。以蒸餾水為對照，測定各管在260nm波長下的A260值，給各 管編號，并標(biāo)出最高峰的收集管。核苷酸的鑒定：分別測定最高峰管內(nèi)液體在230nm 300nm之間，每相差5nm間隔的光吸收值。 其中包括有250、260、280，290nm各點(diǎn)（注意：液體均要保留，切勿倒掉。測量時(shí)用 石英杯）。由于在小于250nm時(shí)，甲酸（HCOOH ）具有很強(qiáng)的光吸收值，因此測定 時(shí)所用參比對照液近似為：第一個(gè)峰用0.05M甲酸一0.05M甲酸鈉第二個(gè)峰用0.10M甲酸一0.10M甲酸鈉第三個(gè)峰用0.15M甲酸一0.15M甲酸鈉第四，五兩峰用0.20M甲酸 0.20M

19、甲酸鈉也可以根據(jù)最高峰所在位置，計(jì)算甲酸、甲酸鈉的濃度選擇參比液。測定各種核苷酸的含量和總回收率：分別合并（包括最高峰管在內(nèi)）各組份洗脫峰管內(nèi)的洗脫液，用量筒測出溶液總體 積，然后測定其A260值，參比對照液同上。根據(jù)層析柱上樣液的A260值以及層析后所 得到的各組份A260值之和，可以計(jì)算出離子交換柱層析的回收率。（注：RNA的摩爾消 光系數(shù)E260nm為7.7 7.8X10，水解后增值40 %）。樹脂的再生：使用過的離子交換樹脂經(jīng)過再生處理后，可重復(fù)使用。可以在柱內(nèi)處理，也可以將 樹脂取出后處理。取出樹脂的方法是用橡皮球由層析柱的下端向柱內(nèi)吹氣，用燒杯收集 流出的樹脂。樹脂再生的方法與未使用的新樹脂預(yù)處理方法相同。也可以直接用1M NaCl溶液浸泡或洗滌，最后用蒸餾水洗至流出液的pH值接近中性。五、結(jié)果處理作出陰離子交換樹脂柱層析分離核苷酸的洗脫曲線，以層析流出液管數(shù)（或體積）