1、基因工程課程實驗指導書生物技術專業黃淑堅 黃良宗 編寫佛山科學技術學院 2005年12月目 錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc124573232 前 言 HYPERLINK l _Toc124573233 實驗一 反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR） PAGEREF _Toc124573233 h 1 HYPERLINK l _Toc124573234 實驗二 DNA目的片段的回收與DNA的體外連接 PAGEREF _Toc124573234 h 7 HYPERLINK l _Toc124573235 實驗三 重組DNA的轉化 PAGEREF _Toc1245

2、73235 h 10 HYPERLINK l _Toc124573236 實驗四 重組DNA的鑒定 PAGEREF _Toc124573236 h 13 HYPERLINK l _Toc124573237 實驗五 外源基因在大腸桿菌中的誘導表達 PAGEREF _Toc124573237 h 16 HYPERLINK l _Toc124573238 實驗六 表達產物的檢測與分析SDS PAGEREF _Toc124573238 h 18 HYPERLINK l _Toc124573239 附錄 PAGEREF _Toc124573239 h 22 HYPERLINK l _Toc1245732

3、40 參考文獻 PAGEREF _Toc124573240 h 34前 言基因工程學是以生物化學、分子生物學和分子遺傳學等學科為基礎而發展起來的一門新興技術學科，自DNA重組技術于1972年誕生以來，作為現代生物技術核心的基因工程技術得到飛速的發展，并廣泛應用于醫學、農業、工業、水產、環保等行業。本實驗指導書在在方法上，力求可行性、實用性，內容涵蓋基因工程操作的基本過程，整個實驗基本上是一個連續的過程，通過學習，要求學生能在原有的相關理論知識基礎上，較全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的實驗方法，以求為以后的學習和科研工作打下良好和扎實的基礎。由于基因工程的發展異常迅速，加之編寫

4、人員水平有限，難免有疏漏與錯誤，敬請各位師生批評指正。編者2005年12月實驗一 反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）一、目的和要求了解反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）基本原理和實驗應用，掌握RT-PCR反應的基本技術。二、實驗內容RT-PCR擴增豬流感病毒M2基因部分片段。三、儀器、設備和實驗準備儀器恒溫水浴槽、移液槍、EP管、PCR管、超凈工作臺、PCR儀、電泳儀。試劑反轉錄酶、RNA酶抑制劑（RNase Inhibitor）、流感病毒RNA、隨機引物、流感病毒M2基因PCR引物、dNTP、Taq酶。3、實驗準備用RNA抽提試劑盒抽提豬流感病毒RNA。四、實驗原理RT-PCR是將RNA

5、模板的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。RT-PCR技術靈敏而且用途廣，可用于檢測產生的轉錄產物，分析表達的水平，不需構建和篩選cDNA文庫而能直接克隆cDNA產物。反轉錄反應是在反轉錄酶作用下，以RNA為模板指導合成互補的DNA鏈的過程。反轉錄反應可以使用反轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法。它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩

6、種寡核苷酸引物在適當溫度(50左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進行合成，由這三個基本步驟組成多輪循環。（一）PCR反應中的主要成份：1. 引物：PCR反應產物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA序列區域時可遵循下列原則：(1) 引物長度約為16-30bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。(2) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm4(G+C)

7、+2(A+T)。(3) 四種堿基應隨機分布，在3端不存在連續3個G或C,因這樣易導致錯誤引發。(4) 引物3端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應, 以減少由于密碼子擺動產生的不配對。(5) 在引物內, 尤其在3端應不存在二級結構。(6) 兩引物之間尤其在3端不能互補, 以防出現引物二聚體, 減少產量。兩引物間最好不存在4個連續堿基的同源性或互補性。 (7) 引物5端對擴增特異性影響不大, 可在引物設計時加上限制酶位點、核糖體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等. 通常應在5端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。(8) 引物不與模板結合位點以外

8、的序列互補。所擴增產物本身無穩定的二級結構, 以免產生非特異性擴增,影響產量。 一般PCR反應中的引物終濃度為0.2-1.0mol/L。引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體, 過低則降低產量。利用紫外分光光度計, 可精確計算引物濃度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計算：X mol/L OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T: 引物中4種不同堿基個數。 2. 4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP應用NaOH 將pH調至7.0,并用分光光度計測定其準確濃度.dNTP原液可配成5-10mm

9、ol/L并分裝,-20貯存。一般反應中每種dNTP的終濃度為20-200mol/L。理論上4 種 dNTP各20mol/L,足以在100l反應中合成2.6g的DNA。當dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現的錯誤摻入。 3. Mg2+：Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實性,影響引物退火和解鏈溫度, 影響產物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2mmol/L.對于一種新的PCR反應,可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進行預備

10、實驗,選出最適的Mg2+濃度。在PCR反應混合物中, 應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團, 例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質,以保證最適Mg2+ 濃度。4. 模板：PCR反應必須以DNA為模板進行擴增, 模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環狀分子(線狀分子比環狀分子的擴增效果稍好)。就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數量和純度。一般反應中的模板數量為102 -105 個拷貝,對于單拷貝基因,這需要0.1g的人基因組DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大腸桿菌DNA.擴增多拷貝序列時,用量更少.靈敏的PCR可從一個細胞,一根

11、頭發,一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列。模板量過多則可能增加非特異性產物.DNA中的雜質也會影響PCR的效率。5. Taq DNA聚合酶：在100l PCR反應中,1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進行30輪循環。所用的酶量可根據DNA、引物及其它因素的變化進行適當的增減。酶量過多會使產物非特異性增加,過少則使產量降低.反應結束后,如果需要利用這些產物進行下一步實驗,需要預先滅活Taq DNA聚合酶, 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR產物經酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100加熱10min。目

12、前已有直接純化PCR產物的試劑盒可用。6. 反應緩沖液：反應緩沖液一般含10-50mmol/L TrisCl (20下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和適當濃度的Mg2+ . TrisCl在20時pH為8.3-8.8,但在實際PCR反應中,pH為6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外,反應液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩定酶活性,另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對擴增較長的DNA片段有利，各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。（二）PCR反應參數1. 變性：在第一輪循環前,

13、在94下變性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全,往往使PCR失敗,因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復性,減少DNA產量。一般變性溫度與時間為94 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時間主要是為使反應體系完全達到適當的溫度。對于富含GC的序列,可適當提高變性溫度，但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。2. 退火：引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引

14、物的濃度，實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低5。一般當引物中GC含量高,長度長并與模板完全配對時, 應提高退火溫度。退火溫度越高, 所得產物的特異性越高。有些反應甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用94和60)完成整個擴增循環, 既省時間又提高了特異性。退火一般僅需數秒鐘即可完成,反應中所需時間主要是為使整個反應體系達到合適的溫度。通常退火溫度和時間為37-60,1-2min。3. 延伸：延伸反應通常為72,接近于Taq DNA聚合酶的最適反應溫度75.實際上,引物延伸在退火時即已開始,因為Taq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從20-85。延伸反應時間的長短取決于目的序列的長

15、度和濃度。在一般反應體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成1kb長的DNA。延伸時間過長會導致產物非特異性增加。但對很低濃度的目的序列, 則可適當增加延伸反應的時間。一般在擴增反應完成后,都需要一步較長時間(7-10min)的延伸反應,以獲得盡可能完整的產物, 這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。 4. 循環次數： 當其它參數確定之后, 循環次數主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環已經足夠。循環次數過多,會使PCR產物中非特異性產物大量增加。通常經25-30輪循環擴增后, 反應中Taq DNA聚合酶已經不足, 如果此時產物量仍不夠, 需要進一步擴增, 可將擴增的DNA樣品稀釋10

16、3-105倍作為模板, 重新加入各種反應底物進行擴增, 這樣經60輪循環后, 擴增水平可達109-1010 。五、實驗步驟1 反轉錄反應（合成cDNA第一鏈）（1）依照所列順序加入以下試劑以建立一個20l 的反應體系。（依據RNA 的量，反應體積可以增減）：組分 量MgCl2, 25mM* 4l反轉錄10 X 緩沖液 2ldNTP 混合物, 10mM 2lRNasin 核糖核酸酶抑制劑 0.5lAMV 反轉錄酶（高濃度） 15u上游引物或隨機引物* 0.5g總RNA 1g加無核酸酶的水至終體積為 20l*注：* 推薦的MgCl2 濃度可根據已知序列進行優化以得到較高產量。* 反轉錄反應可以利用

17、特異引物、Oligo(dT) 15 或隨機引物隨機引物引導。如果需要由3Poly(A) 區域引導，選用Oligo(dT) 15 引物；如果需要引導全長RNA，選用隨機引物。當使用cDNA 進行克隆及PCR 反應時，通常選擇Oligo(dT) 15 引物。如果cDNA 用于RT-PCR , 有時隨機引物比較合適，特別當PCR 引物定位于RNA5-末端時更是如此,由于豬流感病毒無Poly(A)結構，本試驗不能用Oligo(dT) 15引導。* 反應組分的終濃度分別為：5mM MgCl2, 1 X 反轉錄緩沖液（10mMTris-HCl PH 9.0, 25 oC ，50mM KCl, 0.1% T

18、riton X-100），1mM 每種dNTP ，1u/l 重組RNasin 核糖核酸酶抑制劑，15u/g AMV 反轉錄酶（高濃度），0.5g Oligo(dT)15 引物或隨機引物/g RNA，50ng/l Poly(A)+ mRNA 或總RNA。（2）如果使用Oligo(dT)15 引物，將反應體系于42 oC 溫育15 分鐘。如果使用隨機引物，將反應體系于室溫溫育10 分鐘，然后于42 oC 溫育15 分鐘。增加的室溫溫育步驟有利于引物的伸展，使得當溫度升高到42 oC 時引物仍處于雜交狀態。（3）將樣品于95 oC加熱5分鐘，然后于0-5 oC放置5分鐘。這一步將使AMV反轉錄酶失活

19、并阻止其與DNA結合。第一鏈cDNA可用于第二鏈cDNA的合成、PCR擴增或瓊脂糖凝膠分析。也可以將第一鏈cDNA存放于-20 oC備用。2 PCR反應（1）用TE 緩沖液或無核酸酶的水將第一鏈cDNA 合成反應的體積稀釋到100l。（2）將下列試劑混合在一起以配制25l 擴增反應體系。組分 量第一鏈cDNA 反應物(模板) 10ldNTP 混合物, 2.5 mM 4l10 X PCR緩沖液(含Mg2+) 5l上游引物20M 1l下游引物20M 1lTaq DNA 聚合酶 2 單位加無核酸酶的水至終體積為 25l（3）將混合物在94下加熱5分鐘后冰冷,迅速離心數秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入

20、Taq DNA聚合酶（0.5l約2.5U），混勻后稍離心,加入一滴礦物油覆蓋于反應混合物上。（4）用94變性30秒，55退火30秒, 72延伸30秒, 循環30輪,進行PCR。最后一輪循環結束后, 于72下保溫10分鐘，使反應產物擴增充分。 （5）電泳檢測PCR產物，取10l擴增產物用1瓊脂糖凝膠進行電泳分析,檢查反應產物及長度。六、實驗注意事項1、反轉錄操作過程中，嚴防RNase污染，應戴手套操作。2、TRizal試劑有致癌作用，避免皮膚接觸。七、思考1.降低退火溫度對反應有何影響？ 2.延長變性時間對反應有何影響？ 3.PCR循環次數是否越多越好？為何？4.如果出現非特異性帶,可能有哪些原

21、因？實驗二 DNA目的片段的回收與DNA的體外連接一、目的和要求學會從瓊脂糖凝膠中回收DNA片斷的基本技術，掌握目的DNA與載體連接的操作技術。二、實驗內容1、從脂糖凝膠中回收酶切DNA目的片斷(APP APXI)。2、目的DNA片段與載體連接。三、儀器和實驗準備1、器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式離心機，瓊脂糖凝膠電泳系統，微波爐，水漂，恒溫水浴槽。2、試劑 電泳緩沖液，溴化乙錠溶液，電泳級瓊脂糖粉，10加樣緩沖液，DNA分子量標準，DNA凝膠回收試劑盒。T 載體，pMAL -c2X酶切載體， T4 DNA 連接酶，連接酶緩沖液，無菌

22、dd H2O。 3、實驗準備配制TAE電泳緩沖液（10儲存液），1000溴化乙錠儲存液（0.5mg/ml），10加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）；1.5ml離心管裝入飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）。四、實驗原理DNA酶切片斷經過電泳后，按分子量大小被分開，排列在瓊脂糖凝膠中，可以將特定的某條DNA帶所在的凝膠切下來，加熱或用特殊的試劑熔解凝膠，使DNA溶回到溶液中，再經過乙醇沉淀或過柱即可獲得目的DNA片斷。在Mg2+和ATP存在下，T4 DNA連接酶能催化載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端聯接成重組DNA分子。五

23、、實驗步驟1. DNA目的片段的回收（1）用1TAE配制1%瓊脂糖凝膠。（2）在膠上加樣孔中加入50l DNA，電泳。（3）在紫外燈下找到目的DNA帶，用刀片切下大膠中DNA產物所在的凝膠（盡量不要多余的凝膠），轉移至一個稱量過的干凈的1.5ml微量離心管中。再稱量后計算出膠的重量。（4）按照DNA凝膠回收試劑盒的說明書操作，回收DNA目的片段：1）Sangon UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒操作步驟：（1）按400ml/100mg凝膠的比例加入Binding Buffer II，置于50-60水浴中10min，每2min混勻一次，使膠徹底熔化。（2）將熔化的膠溶液移到套放在2ml收集管

24、內的UNIQ-10柱中，室溫放置2min。（3）8000rpm室溫離心1min。取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液。（4）將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，加入500ml Wash Solution，8000rpm室溫離心1min。（5）重復上一步洗滌一次。（6）取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放回到同一個收集管中，12000rpm室溫離心1min。（7）將UNIQ-10柱放入一個新的1.5ml微量離心管中，在柱子膜中央加40ml Elution Buffer（或dd water，pH7.0），室溫或37放置2min（55-80洗脫效果更好）。（8）120

25、00rpm室溫離心1min，離心管中的液體就是回收產物。2）華美生物公司的RESINcolumnTM瓊脂糖DNA純化系統操作步驟：（1）向切割下來的膠塊中加入等體積的熔膠劑，65水浴5-15min直到膠完全融化。（2）充分混勻瓊脂糖-DNA純化樹脂，抽出0.6ml樹脂懸浮液加入到溶膠液中，顛倒4-5次混勻。 （3）抽出注射器活塞，將注射器筒插入微量離心柱，并擰緊。然后將樹脂-DNA混合物加入注射筒，靜置1min。（4）將注射器活塞插入注射器，緩慢用力向下壓，排出所有的液體和空氣。（5）從微量離心柱上拔掉整個注射器，抽出活塞，將注射器筒插入微量離心柱，并擰緊。（6）將2ml I-型柱子清洗液加入

26、注射器。將注射器活塞插入注射器，緩慢用力向下壓，排出所有的液體和空氣。（7）取下微量離心柱，將微量離心柱插入一個新的1.5ml無蓋離心管，并擰緊。（8）向離心柱中加入150ul I-型柱子清洗液，1500 0rpm室溫離心1min。（9）將微量離心柱插入一個新的1.5ml離心管，并擰緊，向離心柱中加入30-50ul TE或dd water，靜置1min，12000 rpm室溫離心20s，洗脫DNA。（10）可取2l-5l回收產物電泳，檢測是否有目的DNA帶。2 . DNA的體外連接1）PCR產物與T載體直接連接： （1）取一個滅菌的PCR管，加入：4ml PCR 產物混合液1ml T載體0.5

27、ml T4 DNA連接酶（TaKaRa, 350U/ul）1ml 連接酶緩沖液3.5 ml dd Water 總量 10ml 體系 （2）述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于14C水中保溫過夜。（3）連接后的產物可以立即用來轉化感受態細胞或置4C冰箱備用。 2）DNA回收片斷與載體（pMAL -c2X）連接：（1）取一個滅菌的PCR管，加入:4ml 回收DNA片斷1ml 酶切后回收的pMAL -c2X載體0.5ml T4 DNA連接酶（TaKaRa, 350U/ul）1ml 連接酶緩沖液3.5 ml dd H2O 總量 10ml 體系 （2）上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于16C干式

28、恒溫儀（或PCR儀）中保溫過夜。（3）連接后的產物可以立即用來轉化感受態細胞或置4C冰箱備用。實驗三 重組DNA的轉化一、目的和要求學會CaCl2法制備大腸桿菌感受態細胞，掌握重組DNA轉化感受態受體細菌技術。二、實驗內容三、儀器、設備和實驗準備1、器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式冷凍離心機，制冰機，恒溫搖床，分光光度計，超凈工作臺，恒溫培養箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環。2、試劑E. coli DH5a，E. coli BL21（DE3），LB培養基，0.1 mol/L CaCl2溶液，無菌dd Water3、實

29、驗準備1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）；平板培養基，LB培養基（滅菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（滅菌），無菌dd Water，搖菌試管（滅菌），三角燒瓶（滅菌）。旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機，恒溫搖床，培養皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養箱。四、實驗原理細菌在0C CaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的狀態（感受態）。質粒DNA粘附在細菌感受態細胞表面，經過42C短時間的熱擊處理，促進吸收DNA。然后在非選擇培養基中培養一

30、代，待質粒上所帶的抗菌素基因表達，就可以在含抗菌素的培養基中生長，從而得到重組DNA轉化菌。五、實驗步驟1感受態細胞制備（1）取一支無菌的搖菌試管，在超凈工作臺中加入2ml LB（不含抗菌素！）培養基。（2）從超低溫冰柜中取出DH5a菌種和TB1菌種，放置在冰上。在超凈工作臺中用燒紅的接種環插入凍結的菌中，然后接入含2ml LB培養基的試管中，37搖床培養過夜。（3）取0.5ml上述菌液轉接到含有50mL LB培養基的三角燒瓶中，37下250r/min搖床培養23h，測定OD590為0.375（0.40.6，細胞數108/mL，此為關鍵參數！）。以下操作除離心外，都在超凈工作臺中進行。（4）將

31、菌液分裝到1.5mL預冷無菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置10min，然后于4，5000rpm離心10min。（5）將離心管倒置以倒盡上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。（6）4，5000rpm離心10min，棄上清液后，用1mL 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂懸，插入冰中放置30min。（7）4，5000rpm離心10min，棄上清液后，用200L 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂懸，超凈工作臺中按每管100mL分裝到1.5mL離心管中。可以直接用作轉化實驗，或立即放入-80超低溫冰柜中保藏（可存放

32、數月）。（8）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面。2 重組DNA的轉化（1）事先將恒溫水浴的溫度調到42。（2）從-70 超低溫冰柜中取出一管（100L）感受態菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴510min。（3）加入5L連接好的質粒混合液（DNA含量不超過100ng），輕輕震蕩后放置冰上20min。（4）輕輕搖勻后插入42水浴中12min進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置35min。（5）在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500L LB培養基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37震蕩1h。（6）在超凈工作臺中取上述轉化混合液100300L，分別滴到含合適抗菌素的固

33、體LB平板培養皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂）。（7）如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40L 2% X-gal，7L 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。（8）在涂好的培養皿上做上標記，先放置在37恒溫培養箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養基里后，再倒置過來放入37恒溫培養箱過夜。（9）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。（10）觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。六、實驗注意事項（1）調準轉化溫度，控制好熱沖擊時間。（2）

34、制備Amp平板時，嚴禁溫度過高時加入Amp，防止抗生素失效。七、思考（1）制作感受態菌的過程中，應注意那些關鍵步驟？（2）CaCl2溶液的作用是什么？（3）影響轉化效率的因素有哪些？（4）白色菌落出現的原理是什么？實驗四 重組DNA的鑒定一、目的和要求學會用酶切法或PCR法篩選重組質粒轉化成功的克隆菌。二、實驗內容酶切法或PCR法篩選重組質粒轉化成功的克隆菌。三、儀器、設備和實驗準備1、器材旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機，恒溫搖床，超凈工作臺，酒精燈，無菌牙簽，搖菌管。2、試劑LB培養基（加抗菌素）

35、，PCR用試劑，引物，質粒提取用試劑，酶切需要的限制性內切酶及其緩沖液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8.0）。3、實驗準備無菌dd water，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）；牙簽（滅菌），搖菌管（滅菌），100mg/mL氨芐青霉素。四、實驗原理利用轉化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質粒上帶有外源基因插入片斷的克隆菌落。五、實驗步驟方法一：酶切鑒定（1）在超凈工作臺中取3支無菌搖菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨芐青霉素），用記號

36、筆寫好編號。（2）在超凈工作臺中將70%乙醇浸泡的小鑷子頭用酒精燈烤過，鑷取一支無菌牙簽。用牙簽的尖部接觸轉化的平板培養基上的一個白色菌落，然后將牙簽放入盛有3mL LB（含50mg/mL氨芐青霉素）的搖菌管中。用此法隨機取3個白色菌落，分別裝入3個搖菌管中。（3）37搖菌過夜后，用堿裂解法分別提取質粒。搖菌管中的剩余菌液保留在4冰箱中。（4）將提取到的3管質粒樣品與空質粒同時電泳，根據分子量判斷和選區有插入片段的質粒，然后可用酶切、與目的片段一同電泳來鑒定其上的外源插入片斷大小是否與預期相符。（5）將經過鑒定判斷為正確的質粒保存。按照編號找到冰箱中原菌液。根據需要進行放大培養提取其質粒或進行

37、誘導表達，或取500mL菌液與500mL 65%甘油混合后-80保存。（6）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。方法二：快速PCR篩選法（1）在轉化的平板培養基上隨機選取3個邊緣清晰的白色菌落，接種到1mlLB液體培養基中，37過夜培養。（2）在0.2ml PCR 微量離心管中配制25l反應體系。 dd water 17.5l 10PCR buffer 2.5l 2.5mmol/L dNTP 2l（每種dNTP終濃度0.2mM） 10mol/L Primer1 1l（12.525pmoles） 10mol/L primer2 1l（12.525pmoles） Taq酶 0

38、.5l（1.5u） 菌液 0.5l 總體積 25l （3）設置PCR儀的循環程序： 94 5min 94 30s 56 30s 72 3min30s goto 30times 72 10min（4）PCR結束后，取5l產物進行瓊脂糖凝膠電泳（與原始插入片斷同時比對）。觀察膠上是否有預計的主要產物帶。（5）根據需要進行放大培養提取其質粒。（6）提取到的質粒與原先的空載體（或已知分子量的質粒）再對比電泳，用酶切以進一步確認。 六、思考（1）PCR法篩選的優點和缺點是什么？（2）酶切法與PCR法篩選方案哪個更可靠？（3）最終確認克隆的方法有哪些？實驗五 外源基因在大腸桿菌中的誘導表達一、目的和要求了

39、解外源基因在原核細胞中表達的特點，掌握原核誘導表達操作。二、實驗內容IPTG誘導pMAL -c2X APXI重組轉化菌的表達。三、儀器、設備和實驗準備1、器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式冷凍離心機，制冰機，恒溫搖床，分光光度計，超凈工作臺，恒溫培養箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環。2、試劑LB培養基（加抗菌素），100mg/ml IPTG，20%葡萄糖3、實驗準備無菌dd water，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）；牙簽（滅菌），搖菌管（滅菌），100mg/ml IPTG （

40、過濾滅菌）（100ml分裝，-20C保存），100mg/mL氨芐青霉素（過濾滅菌）（100ml分裝，-20C保存）。配制20%葡萄糖（8磅滅菌20分鐘，添加至上述LB中，終濃度為0.2%）。四、實驗原理外源基因克隆在含有lac啟動子的表達系統中。先讓宿主菌生長，lac I產生的阻遏蛋白與lac操縱基因結合抑制下游的外源基因轉錄。向培養基中加入誘導物IPTG（異丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表達。表達的蛋白可經SDS或Western-blotting檢測。五、實驗步驟（1）晚上9：00接種。在超凈工作臺中接種含有pMAL -c2X APXI重組載體的菌株，培養于兩個三角燒瓶各

41、20ml LB-葡萄糖培養基（含抗菌素Amp 120g/ml）的搖菌管中， 70-90轉/分鐘30C搖菌過夜。（2）至第二天上午8：30 OD600約為0.5，加IPTG至 100g/ml，150-170轉/分鐘37C誘導1.5-3h。同時做不加IPTG誘導和非轉化的空菌誘導的對照培養。（3）4000rpm離心15min棄掉上清液，收獲菌體，SDSPAGE電泳分析。菌體也可放在-20C以下保存備用。（4）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。六、思考（1）IPTG的作用原理是什么？（2）為什么要增加抗菌素的用量？實驗六 表達產物的檢測與分析SDS一、目的和要求學習SDS的基

42、本操作，學會用SDS檢測蛋白。二、實驗內容SDS檢測分析pMAL -c2X APXI轉化菌表達產物。三、儀器、設備和實驗準備1、器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式冷凍離心機，制冰機，超聲波破碎儀，電磁爐，電泳儀，垂直電泳槽及配套的玻璃和密封條、梳子等，搖菌試管，三角燒瓶，接種環，飯盒。2、試劑 SDS（十二烷基磺酸鈉），Acr（丙烯酰胺），Bis（N,N-亞甲基雙丙烯酰胺），Tris（三羥甲基氨基甲烷），甘氨酸，鹽酸，Aps（過硫酸氨），TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量標準（97.4，66.2，43，31，20.1，14.4 kDa

43、），溴酚藍，甘油，冰醋酸，乙醇，b-2-巰基乙醇，考馬斯亮藍R250，甲醇，乙醇。3、實驗準備4X分離膠緩沖液：1.5mol/L Tris-HCL pH 8.8, 0.4% SDS溶液,4 保存；4X濃縮膠緩沖液：0.5mol/L Tris-HCL pH 6.8, 0.4% SDS，4 保存；1.5mol/L Tris HCl，pH8.8（4C保存）；0.5mol/L Tris HCl，pH6.8（4C保存）；30%Acr/Bis（30g Acr+0.8g Bis dd water 定容至100mL，4C保存）；10%Aps （-20C保存）；2上樣緩沖液（0.5mol/L Tris HCl，

44、pH6.8 2mL，甘油2mL，20%SDS 2mL，0.1%溴酚藍 0.5mL，b-2-巰基乙醇 1.0mL，dd water 2.5mL，室溫存放）；5電泳緩沖液（Tris 7.5g ，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加dd water至500mL，使用時稀釋5倍）；考馬斯亮藍染色液（考馬斯亮藍R250 0.25g + 45ml甲醇+10mL冰醋酸，用dd water定容至100mL）；脫色液（95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5，體積比）；四、實驗原理蛋白質在加熱變性以后與SDS結合，帶上負電荷，在電場的作用下，向正極移動，結果按分子量大小排列在膠板上，含量多的蛋白帶紋粗。五、實

45、驗步驟（1）將表達后的菌體與2上樣緩沖液按1：1混勻于微量離心管中。（2）用超聲波破碎儀脈沖10次，每次10秒。中間間隔時放入冰中降溫。注意一定要將超聲波探頭插入容液底部，在溶液表面或上部時容易起泡！（3）將上述微量離心管插入水漂中，放在電磁爐鍋里的沸水中煮35min。然后立即插入冰中。（可在-20C冰柜中保存）。（4）按照教師的演示組裝電泳玻璃并用細橡膠管密封底部和側面然后用夾子夾住（不能夾玻璃的上端以免以免夾斷玻璃的突出段！）。插入梳子后在玻璃上距離梳子齒底部1cm的地方做一個標記。（5）配制10%分離膠。按順序和量（注意體積單位！）取下列溶液混在一個50mL的小燒杯中（注意Tris為 p

46、H8.8）：10分離膠 單位：ml4X分離膠緩沖液 3.95H2O 5.930丙稀酰胺 5.010過硫酸胺 0.15TEMED 0.006 總體積： 15（6）加完APS后拿起燒杯輕輕轉動幾下底部將溶液混勻后，立刻緩緩倒入玻璃夾縫中，直到液面與所作的標記齊平。剩下的膠液留在小燒杯中，傾斜放置。然后在上部用1000ml微量移液器輕輕地沿玻璃壁來回移動加滿dd water（盡可能不破壞下面的膠液）。然后靜置30min。直到燒杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸餾水，并倒置玻璃盡可能將水倒盡。（7）配濃縮膠。按順序和量（注意體積單位！）取下列溶液混在一個50mL的小燒杯中（注意Tris為 pH6.8）：5濃縮

47、膠 單位：ml4X濃縮膠緩沖液 1.04H2O 2.230丙稀酰胺 0.6710過硫酸胺 0.04TEMED 0.004（8）加完APS后拿起燒杯輕輕轉動幾下底部將溶液混勻后，立刻倒入玻璃夾縫中，液面與玻璃上邊緣齊平。然后再慢慢插入梳子，靜置約20min。燒杯中剩下的溶液傾斜放置直到溶液凝固。（此狀態可以用塑料薄膜包起來放入冰箱過夜）。（9）小心拔出梳子以后，用注射器針頭（剪平尖部）吸取梳子齒形成的加樣槽中的水，并修平加樣槽底部的膠面。（10）選取幾個形態好的加樣槽，在一張紙上做好對應的標記，用微量移液器在側面的一個加樣槽中加入20mL 蛋白分子量，其它槽中加入1020mL自己制作的樣品。（1

48、1）加完樣品后，再用微量移液器吸取電泳緩沖液小心把加樣槽液面都補平。電泳槽上部倒滿電泳緩沖液（約250ml,淹沒過加樣槽的液面！），電泳槽的下部倒入一半電泳緩沖液（約180ml）。（12）接好電極，將電流調至10mA，待溴酚藍移到分離膠后，在將電流調至18mA，電泳約23h，期間隨時觀察電泳槽上部的液體是否有泄漏（泄漏導致液面下降，電流中斷）！當溴酚藍移到玻璃距底部0.5cm時切斷電源。（13）在一個搪瓷盤里準備適量的考馬斯亮藍染色液。（14）倒掉電泳槽中的緩沖液，取下玻璃，小心用鏟子從下部將帶有缺口的玻璃板撬起（切不可損壞膠！）。用鏟子切去上部的支持膠，并把分離膠從玻璃上剝離 倒染液搪瓷盤里

49、（切不可損壞膠！）。（15）染色2h后，將染液倒回瓶子里以備重復使用。把膠移入脫色液，過夜。（16）觀察脫色后膠里的藍色帶紋，與對照比較或尋找異常粗的帶紋，并比較其分子量（APXI蛋白約110kDa），判斷是否是預期的基因產物。（17）清理桌面，寫實驗報告。六、思考（1）影響表達的因素有哪些？（2）如何確定凝膠上的某條蛋白質帶就是所要表達的外源基因產物？（4）本實驗能否判斷表達產物一定是APXI蛋白？還需要什么方法？（5）如何估計表達產物的分子量？附錄1 本實驗使用表達載體相關資料IMPACTTMpMXB10 蛋白表達純化載體(蛋白單柱親和純化)概述: NEB IMPACTTM 系統是一種新型

50、的蛋白融合表達及純化系統，能應用到蛋白質工程的許多重要領域。IMPACTTM 表達的目的蛋白與蛋白自剪接元件(稱為內含肽，intein)及幾丁質結合蛋白形成融合蛋白, 通過幾丁質柱親和純化融合蛋白。然后誘導內含肽的肽鍵裂解活性，在幾丁質介質上將目標蛋白釋放出來，而內含肽與幾丁質結合蛋白仍結合在幾丁質介質上，達到單柱分離純化蛋白的目的(圖1, 2)。將目的蛋白連接到pMXB10載體intein的N端，還原劑(DTT)可誘導內含肽N端肽鍵裂解，將目標蛋白釋放出來。與其它利用融合蛋白純化的方法比較，IMPACTTM 系統不需用蛋白酶。因此，這是一種快速而經濟的蛋白純化方法。IMPACT-TWIN 和

51、IMPACT-CN系統有數種其它用途，產生的目的蛋白可帶有N末端的半胱氨酸和/或C末端的硫酯鍵，進行蛋白的標記、連接和環化。圖1: 利用pMXB10 載體表達純化蛋白: 采用IMPACT pMXB10載體系統，目的蛋白C末端與內含肽Intein形成融合，通過DTT(1,4-dithiothreitol)誘導的內含肽裂解作用可將目的蛋白分離釋放。采用MESNA(2-mercaptoethanesulfonic acid)誘導內含肽裂解時，目的蛋白C端帶有活化的巰酯基團，可與N端為半胱氨酸的多肽高效連接。圖2: 利用pMXB10 載體表達純化蛋白 Maltose binding protein (

52、MBP, 43 kDa):目的蛋白 MBP C末端與內含肽Intein形成融合，通過DTT(1,4-dithiothreitol)誘導內含肽的肽鍵裂解活性，在幾丁質介質上將目標蛋白釋放出來，而內含肽與幾丁質結合蛋白仍結合在幾丁質介質上，達到單柱分離純化MBP蛋白的目的。12% SDS分析:Lane 1: Uninduced E. coli cellsLane 2: Induced cell lysate (觀察蛋白表達量)Lane 3: Clarified cell lysate (after sonication and centrifugation) (觀察細胞破碎和蛋白可溶性)Lane

53、4: Lysate after passage of a chitin column (觀察親和柱的蛋白結合效率)Lane 5: Eluted MBP after 16 hour on-column cleavage with DTT at 4 degree (分析洗脫的目的蛋白)Lane 6: Chitin after elution indicating efficient cleavage (觀察intein裂解效率及未洗脫的目的蛋白)附錄2 核酸抽提常用方法動植物組織總RNA提取一、材料 水稻葉片或小鼠肝組織。 二、設備 研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，

54、電泳儀，電泳槽。三、試劑 1、無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180 2小時）裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。 2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。 3、1層析柱加樣緩沖液；20mmol/L TrisCl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。4、洗脫緩沖液：10mmol/L TrisCl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。四、操作步驟 動植物總RNA提取-Tr

55、izol法 Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。 2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。 3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇

56、的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。 4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4下7500g離心5分鐘。5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55-60水溶 10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70。注意1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。 2、加氯仿前的勻漿液可在-70保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。2、植物病毒RNA提取大多植物病毒RNA為單鏈R

57、NA，并且其極性與mRNA極性相同，植物病毒RNA提取較為簡單，一般使用酚氯仿即可獲得滿意結果。 一、材料 提純TMV病毒液（10mg/ml）。 二、設備 冷凍臺式離心機，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。 三、試劑 TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無RNA酶的雙菌水。 四、操作步驟 1、取一eppendorf管加入提純TMV（10mg/ml)400ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4下12000g離心10分鐘。2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機相交界面無蛋白為止

58、。3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數十秒，4下12000g離心10分鐘。4、取水相，加入1/10倍體積的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-2030分鐘。 5、4下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4下12000g離心5分鐘。6、小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中。7、取10ml進行電泳分析，另10ml用于cDNA合成。 注意1、整個操作應盡可能在低溫下進行。 2、由于病毒RNA鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝去病毒外殼蛋白，一般需要多

59、次進行酚/氯仿的抽提。3. 從植物組織提取基因組DNA一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（蘋果）幼嫩葉子。 二、設備 移液器，冷凍高速離心機，臺式高速離心機，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離心管（有蓋）及5ml和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。 三、試劑 1、提取緩沖液：100mmol/L TrisCl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取緩沖液：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、 RnaseA母液：配方見第一章。

60、 5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步驟：（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA提取 1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液, 60水浴預熱。2. 水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預熱的離心管中, 劇烈搖動混勻, 60水浴保溫30-60分鐘(時間長,DNA產量高), 不時搖動。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套, 防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機相分層(必要時可重新混勻)。 4. 室溫下5000rpm離心5分鐘。 5. 仔細移取上清液至