1、分析細胞培養中的細部分問題二基礎篇-無菌操作基本技術 1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。 2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用

2、完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。 3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。 4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無菌操作臺(至少Class II)。操作過程中，應避免引起aerosol 之產生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，

3、并避免尖銳針頭之傷害等。 5. 定期檢測下列項目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。 5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(300小時/預濾網，3000 小時/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。基礎篇-實驗用品 1. 種類 1.1. 細胞培養實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。 1.2. TC 級培養盤表面均有coating 高分子物質以讓細

4、胞吸附，培養容器種類有Tflask，plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有2 種不同材質，其中polypropylene (PP) 為不透明材質，polystyrene (PS) 為透明材質，可依實驗需要而選擇適合材質之離心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glasswa

5、re)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml 2. 清洗 2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl 浸泡數小時，洗凈后才開始使用。 2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。3. 滅菌 3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。 3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170, 4 小時。 3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121 , 15

6、 lb, 20 分鐘處理。 基礎篇-培養基 1. 液體培養基貯存于4 冰箱，避免光照，實驗進行前放在37 水槽中溫熱。 2. 液體培養基(加血清) 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。 3. 粉末培養基配制(以1 升為例)： 3.1. 細胞培養基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養基之配制體積為900 ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養基中會造成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調整pH，而非用強酸(

7、HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養基的pH 易發生改變。 3.2. 材料： 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質非常重要) ，粉末培養基 ，NaHCO3 ，電磁攪拌器 無菌血清瓶 ，0.1 或0.2 mm無菌過濾膜 ，pH 計，真空泵，CO2 氣體 3.3. 步驟： 3.3.1. 取粉末培養基溶于700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。 3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。 3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加

8、入溶解之液體培養基中混合。混后溶液之pH 應為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調整之。若為太堿，可再通入CO2 氣體調整pH。培養基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。 3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養基種類、日期、瓶號等，貯存于4。(血清亦可加入培養基中一起過濾) 3.3.5. 配制之培養基配制須作生長試驗與污染測試。 附-配制培養基之生長測試 材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) me

9、thanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013) 步驟： 1. 以待測試培養基培養MDCK cell，接種MDCK 細胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每個well 接種1 102 活細胞，同時作對照組實驗。 2. 接種57 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。 3. 去除培養基，加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇：冰醋酸 3:1)，室溫下靜置10 min。 4. 去除固定液，水洗二次。 5. 加入1

10、 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色2-3 min。 6. 去除染液，水洗二次。 7. 以肉眼計數群落數，并比較之，若新配制或新批號的培養基對細胞生長不佳，則丟棄之。 基礎篇-抗生素 1. 細胞庫之細胞培養基不加抗生素 1.1. 培養自ATCC 引進之細胞株，培養基中不加抗生素。 1.2. 培養自其它實驗室引進之細胞株，制作token freeze 前培養基須添加抗生素，待token freeze 通過污染測試后，大量培養時則不加抗生素。 2. 寄送活細胞時，須將培養液充滿整個flask 時，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + str

11、eptomycin 100 ug/ml)。 3. 若要檢測mycoplasma，則培養基內不可添加gentamicin，因gentamicin 會抑制mycoplasma 生長。 4. 去除細菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會增強。 5. 抗生素使用種類與濃度： 工作濃度. 儲存溫度. 殺滅細菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptom

12、ycin 100 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma hotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20 yeast and molds 基礎篇-血清 1. 血清必須貯存于20 -70，若存放

13、于4，請勿超過一個月。如果一次無法用完一 瓶，可將4045 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結凍時體積會增加約10 %， 必須預留此膨脹體積之空間，否則易發生污染或容器凍裂之情形。 2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發現血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養基內一起過濾，勿直接過濾血清。 3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無菌離心管可分裝4045 ml。在溶解過程中須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發生。勿直接由20直接至37解凍，因溫度改變太大，

14、容易造成蛋白質凝結而發生沈淀。 4. heat-inactivation 是指56, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement) 去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為會造成沈淀物之顯著增多，且會影響血清之品質。補體參與之反應有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and act

15、ivation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿將血清置于37太久，若在37放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質。 6. 血清之沈淀物 6.1. 凝絮物：發生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本身之品質。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會阻塞過濾膜。

16、 6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經過熱處理之血清，沈淀物的形成會顯著的增多。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認為血清遭受污染，而將血清放在37中欲培養此“微生物“，但在37環境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認為微生物之增殖，但以培養細菌之培養基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點應不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品質，應立即停用，更換另一批號的血清。 附-血清之生長測試 材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12

17、000-022 ) 6-well TC plate (or 35mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013) 步驟： 1. 以a-MEM with 10 % FBS (已測試過) 培養MDCK 細胞于T75 flask 至80% confluency。 2. 以trypsin-EDTA 處理細胞，離心后，加入適量不加血清之a-MEM 制成細胞懸浮液，并測細胞濃度。以不加血清之a-MEM 稀釋細胞濃度為1102活細胞數/ ml。 3. 將1 ml 細胞懸浮液接種入6-well p

18、late 中，并另加入1 ml 含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最終濃度為10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。 4. 37 oC，5 % CO2 培養箱培養5-7 天，期間不需更換培養基，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。 5. 去除培養基，加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇:冰醋酸 3:1)，室溫下靜置10 min。 6. 去除固定液，水洗二次。 7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，

19、室溫下靜置染色2-3 min。 8. 去除染液，水洗二次。 9. 以肉眼計數群落數 10. 計算SPE ( Serum Plating Efficiency )： SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 % 11. 計算RPE(Relative Plating Efficiency)： SPE = total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) x100 % 比較各濃度血清培養基之RPE，即可得知待測血清對細胞生長的影響。訂購多量同一批號的優良血清

20、，置于70 保存之基礎篇-細胞傳代培養 1. 細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6，依細胞種類而異。 2. 材料： 2.1. 無菌磷酸生理緩沖液(Dulbeccos phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)： 以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于20，使用前放在37 水槽回溫。 2.3. 新鮮

21、培養基 2.4. 無菌吸管/離心管/培養瓶 3. 步驟： 3.1. 附著型胞(adherent cell) 3.1.1. 吸掉舊培養液。 3.1.2. 用D-PBS 洗滌細胞一至二次。 3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 作用數分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA 溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA 作用后，加入適量含血清之新鮮培養基終止trypsin 作用，離心后再吸掉上清液。) 3.1.4. 輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養基，以

22、吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。 3.2. 懸浮型細胞(suspension cell) 3.2.1. 吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。 3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養基，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶中，以正常培養條件培養。 3.3. 融合瘤(hybridoma) 3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養三天以上才會產生抗體，若是更換培養基，則可能會失去抗體。因此繼代培養不需離心后更換培養基，直接添加新鮮培養基稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養

23、瓶中。 基礎篇-細胞冷凍保存 （一）1. 注意事項： 1.1. 欲冷凍保存之細胞應在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態，約為80 90 致密度。 1.2. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質，例如hybridoma 應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。 1.3. 注意冷凍保護劑之品質。DMSO 應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22 micronFGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650)，以510 ml 小體積分裝，4避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后

24、對細胞會有毒性。 1.4. 冷凍保存之細胞濃度： 1.4.1. normal human fibroblast: 13 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 13 x 106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 57 x 106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 510 x 106cells/ml, huma

25、n lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。 1.5. 冷凍保護劑濃度為5 或10 DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。 1.6. 冷凍方法： 1.6.1. 傳統方法: 4 10 分鐘- -20 30 分鐘- -80 16 - 18 小時(或隔夜) - 液氮槽vapor phase 長期儲存。 1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機以1 -3/分鐘之速度由室溫降至120，放在液氮槽vapor phase 長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma 之保存。 基礎篇-細胞冷凍保存 （二）2. 材料

26、： 2.1. 生長良好之培養細胞 2.2. 新鮮培養基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球計數盤與蓋玻片 2.7. 等速降溫機(KRYO 10 Series II) 3. 步驟： 3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形。 3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養基中，最后濃度為5-10，混合均勻，置于室溫下待用。 3.3. 依細胞繼代培養之操作，收集培養之細胞

27、，取少量細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數細胞濃度及凍前存活率。 3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。 3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 10 分鐘 -20 30 分鐘 -80 1618 小時(或隔夜) 液氮槽vapor phase 長期儲存。 3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。程序為: program 7: HB CELL 基礎篇-冷凍細胞活化 1. 冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避

28、免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。 2. 細胞活化后，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常(例如產生單株抗體或是其它蛋白質)。 3. 材料 37 恒溫水，新鮮培養基，無菌吸管/ 離心管/ 培養瓶，液氮或干冰容器 4. 步驟： 4.1 操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。 4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。 4.3 將新鮮培養基置于37 C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。 4.4 取出冷凍管，立即放入37 C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全

29、部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。 4.5 取出0.9 ml 解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內(稀釋比例1:101:15)，混合均勻，放入CO2 培養箱培養。另取0.1 ml 解凍細胞懸浮液作存活測試。 4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO 或glycerol)，依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養基之離心管內，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入CO2 培養箱培養。 4.7 若不需立即去除冷凍保存劑，則在

30、解凍培養后隔日更換培養基。基礎篇-收到細胞的處理方式 (一)1. 收到細胞株包裹時， 請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養， 或立即冷凍保存(置于70 C， 隔夜后， 移到液氮)。 2. 冷凍細胞解凍程序: 2.1. 依據細胞株數據單指定之基礎培養基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養基。絕大多數之細胞均無法立即適應不同之基礎培養基或不同之血清種類， 若因實驗需要， 必須有所不同時， 務必以緩慢比例漸次改變培養基組成， 確定細胞適應后， 方進行所需之實驗。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf

31、serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對細胞而言差異極大，請務必依據細胞株資料單指定之血清種類培養之。 2.3. 將培養基置于37 C 水槽中回溫， 回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺內。取出冷凍管， 立即放入37 C 水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿， 否則易發生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內。 2.4. 依據細胞種類和濃度，于無菌操作臺內取10 ml 培養基加至T25 或T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 fl

32、ask 內之培養基， 混合均勻，放入37 C，5 % CO2 培養箱培養。 2.5. 對絕大多數細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除， 待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數因對DMSO 敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養基中，離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養基，將細胞均勻混合后， 轉移至培養瓶中， 再放入37 C， 5 % CO2 培養箱培養。基礎篇-收到細胞的處理方式 (二)收到T25

33、flask 細胞時， 處理方式為 1. 于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養基。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現象，若有任何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。 2. 將原封之T25 flask 靜置于37 C， 5 % CO2 培養箱中，使細胞回溫至37 C， 并讓運送過程中少數脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內取出flask內之培養基，(取出之培養基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養基于flask 內，依一般培養方式再將細胞置入培養箱中，或細胞已長滿盤， 則將細胞做傳代培養。 附-細胞計數與存活測試

34、（一） 1. 原理： 1.1. 計算細胞數目可用血球計數盤或是Coulter counter 粒子計數器自動計數。 1.2. 血球計數盤一般有二個chambers，每個chamber 中細刻9 個1 mm2 大正方形，其中4 個角落之正方形再細刻16 個小格，深度均為0.1 mm。當chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以104，即為每ml 中之細胞數目。 1.3. 存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料

35、無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue 染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。 附-細胞計數與存活測試（二）2. 材料： 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca+/Mg+ free saline 血球計數盤及蓋玻片(H

36、emocytometer and coverslip) ，計數器(counter) ，低倍倒立顯微鏡 粒子計數器(Coulter counter, Coulter Electronics) 3. 步驟： 3.1. 取50ml 細胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等體積混合均勻于1.5ml 小離心管中。3.2. 取少許混合液(約15ml) 自血球計數盤chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色- Erythrosinbluish)。 3.3. 計數四個大方格之細胞總數，再除4

37、，乘以稀釋倍數(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，最后乘以104，即為每ml 中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。 4 大格*細胞總數x 2 x 104 / 4= 細胞數/ml *每一大格的體積= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 3.4. 若不用血球計數盤，可用Coulter counter 作自動計數，惟無法辨別死細胞或活細胞。 3.5. 范例： T75 monolayer culture 制成10ml 細胞懸浮液，取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中，取

38、少許混合液加入血球計數盤，計數四大方格內之細胞數目。 活細胞數/方格：55 ,62, 49, 59 死細胞數/方格：5, 3, 4, 6 細胞總數= 243 平均細胞數/方格= 60.75 稀釋倍數= 2 細胞數/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 細胞數/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率：225/24392.6 %升級篇-細胞培養11 冷凍管應如何解凍？ 取出冷凍管后， 須立即放入37 C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中

39、取出解凍時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。 2 細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO？ 除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）， 在解凍之后， 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。 3 可否使用與原先培養條件不同之培養基？ 不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基， 若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基， 細胞大都無法立即適應， 造成細胞無法存活。 4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類？ 不能。血清是細胞培養上一

40、個極為重要的營養來源， 所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。 升級篇-細胞培養25 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。 6 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？ 一般培養基中大都使用H

41、CO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統， 而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10 % CO2；當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養細胞。 7 何時須更換培養基？ 視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。 8 培養基中是否須添加抗生素？ 除于特殊篩選系統中外， 一般正常培養狀態下， 培養基中不應添加任何抗生素。 9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？ 一般使用之trypsin

42、-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于20 C，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機會。 10 懸浮性細胞應如何繼代處理？ 一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養液太多時， 可將培養角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶， 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度， 重復前述步驟即可。 升級篇-細胞培養311 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？ 欲回收動物細胞， 其離心速率一般為300 xg (

43、約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉速， 將造成細胞死亡。 12 細胞之接種密度為何？ 依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。 13 細胞冷凍培養基之成份為何？ 動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中， 必須使用前先行配制完成。 14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？ 冷凍保存使用之DMSO

44、等級， 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無菌狀況， 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4C， 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。15 冷凍保存細胞之方法？ 冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 C 3060 分鐘 (-20 C30 分鐘*) -80 C 1618 小時(或隔夜) 液氮槽vaporphase 長期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 C 至80 C 以下， 再放入

45、液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 升級篇-細胞培養416 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？ 冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 17 應如何避免細胞污染？ 細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低

46、污染之最好方法。 18 如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？ 加入相應抗生素。直接滅菌后丟棄之。 19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。 20 支原體污染會對細胞培養有何影響？ 支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數， 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。 21 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？ 直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。 22 CO2 培養箱之水盤如何保持清潔？ 定期(至少每兩周一次)

47、 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。 升級篇-細胞培養523 為何培養基保存于4 C 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？ 培養基保存于4 C 冰箱中， 培養基內之CO2 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調整pH 值。 24 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？ 不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之

48、影響， 惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。 25 購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？ 研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心， 應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。 26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？ 研究人員在細胞培養時出現存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置

49、于80 C 太久。 27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？ 冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊 升級篇-細胞培養628 如何選用特殊細胞系培養基？ 培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始，各種目的無血清培養最好首選AIM V（12

50、005）培養基（SFM）。 29 L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？ L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。 30 GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？ GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽

51、非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。 31 什么培養基中可以省去加酚紅？ 酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。 升級篇-細胞培養732 培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話

52、，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。 34二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？ 二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。 33 目錄上說，Hanks 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hanks 平衡鹽溶液(HBS)和Earles平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別？HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高

53、水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。升級篇-細胞培養8 35 當在無血清培養基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結合和滅活一些抗生素。在無血清培養條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。 36 一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。 37 大部分添加物和試劑

54、最多可以凍融3次，如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。 38 在溶解的一周內使用貯存在4冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩定。 細胞分離試劑（1） 大部分連續細胞系，強貼壁細胞系，許多早代細胞HBSS或無鈣鎂PBS0.25胰蛋白酶溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中細胞表面蛋白完整性重要的連續細胞系HBSS或無鈣鎂PBS0.05胰蛋白酶溶解在0.53mM EDTA弱貼壁表皮細胞轉化成纖維細胞（要求細胞表面完整性），原代細胞HBSS或無鈣鎂PBSEDTA,甘油 溶解在檸檬酸鈉中強貼壁早代細胞系HBSS或無鈣鎂PBS0.25胰蛋白酶溶解在1mM EDTA，Dispase 0.6-2.4單位/ml 溶解在PBS細胞分離試劑（2）上皮細胞0.5mM -1mM