1、基 因 工 程第一章：1.基因工程：在分子水平上進行的遺傳操作，指將一種或多種生物體的基因或基因組提取出來，或者人工合成的基因，按照人們的愿望進行嚴密的設計，經過體外加工重組，轉移到另一種生物體的細胞內，使之能在受體細胞遺傳并獲得(hud)新的遺傳性狀的技術。 供體、受體、載體是重組DNA技術(jsh)的三大基本元件。(工具酶也是必備元件)基本用途：大規(guī)模生產生物活性物質，設計(shj)、構建生物的新性狀甚至新物種。2.基因工程研究的主要內容：目的基因的分離與制備，DNA片段和載體的連接，外源DNA片段引入受體細胞，選擇目的基因，目的基因表達。3.基因工程的意義：大規(guī)模生產生物分子，設計構建新

2、物種，搜尋、分離和鑒定生物體。發(fā)展前景：農林牧漁業(yè)中的應用，工業(yè)中的應用，在醫(yī)學中的應用。第二章：（結合課本劃線內容）1.限制性核酸內切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能：識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈，主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵；（發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象：寄主細胞的限制和修飾作用。）hsd R：編碼限制性核酸內切酶，hsd M：編碼限制性甲基化酶，hsd S：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達。（限制核酸內切酶類型：I型，II型，III型；）2. 屬名 種名 株名Haemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌d株 先后分離出3種限制酶：HindI HindII

3、HindIII，EcoRI在抗藥性R質粒上發(fā)現(xiàn)的第一個酶。同尾酶：識別不同的序列，能產生相同的黏性末端的酶；同位酶：不同微生物來源的酶，能識別相同的序列，切割方式相同或不相同。3.II型限制性核酸內切酶的切割方式：在識別序列的對稱軸上同時切割形成平末端如EcoRV;在識別序列的雙側末端進行切割，若于對稱軸5端突出的末端如EcoRI;反之產生3端突出的末端如PstI。限制性核酸內切酶反應的注意事項：限制性核酸內切酶為濃縮酶；濃縮的酶液要用核酸內切酶緩沖液稀釋，（不能用水稀釋，以免酶變性）；核酸內切酶在含有50%甘油的緩沖液中，于-20度穩(wěn)定保存；反應中盡可能少加水，使反應體積減到最小；延長反應時

4、間，使所需酶量減少。影響限制性核酸內切酶活性的因素：DNA樣品的純度；DNA樣品的甲基化程度；核酸內切酶的緩沖液性質；4.DNA連接酶基本性質：修復雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵；修復與RNA鏈結合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵；連接多個平頭雙鏈DNA分子。（注意：DNA連接酶所連接的是DNA分子上相鄰核苷酸之間的切口，即Nick鏈接，不能鏈接兩條單鏈DNA或環(huán)化的單鏈DNA分子。） DNA連接酶的種類：T4噬菌體DNA連接酶（最常用）、大腸桿菌DNA連接酶（最常見）、T4噬菌體RNA連接酶。5.DNA聚合酶：大腸桿菌(d chn n jn)DNA聚合酶 I的基本性質：53的DNA聚合酶活性；

5、53的核酸(h sun)外切酶活性；35的核酸外切(wi qi)酶活性。用途：主要用于雜交探針的制備。切口平移法是目前實驗室中最常用的一種脫氧核糖核酸探針標記法。Klenow酶的基本性質：大腸桿菌DNA聚合酶I經枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶；Klenow酶仍擁有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：補平由核酸內切酶產生的5粘性末端；DNA片段的同位素末端標記；cDNA第二鏈的合成；雙脫氧末端終止法測定DNA序列。T4-DNA酶的基本特性：53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性；在無dNTP

6、時，可以從任何3-OH端外切；在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止；在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位。T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內切酶產生的3粘性末端（注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多）；DNA片段的同位素末端標記。反轉錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈；雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈6.核酸酶:單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII），大腸桿菌的核酸外切酶VII反應不需要Mg2+。 雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII），大腸桿菌的核酸外切酶 III 特異性地從3 端外切。單、雙鏈核酸外切

7、酶：l 核酸外切酶（ lExo），l核酸外切酶特異性地從5 端外切。 單鏈核酸內切酶：S1核酸酶，來自稻谷曲霉菌。基本特性：降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍，降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍，是降解單鏈RNA的核酸內切酶，反應條件：Zn2+必需，最適pH范圍為4.0 - 4.3，需要NaCl 10 - 300 mM。S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA。單鏈內切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶，來自艾氏交替單胞菌。基本用途：誘發(fā)DNA突變。 核酸修飾酶：末端脫氧核苷酰轉移酶（TdT），來自小牛胸腺。基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，隨機摻入dNTPs。堿性

8、磷酸單酯酶：來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP），來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）。基本用途：催化核酸分子的脫磷作用，使DNA或RNA的5磷酸變?yōu)?-OH末端，防止載體的自身環(huán)化。T4-PNP（T4噬菌體多核苷酸激酶）的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5-OH上加磷，用于探針的末端同位素標記。7.如何防止載體自身環(huán)化作用？答：使用堿性磷酸酶處理，去除其5末端的磷酸基團，這樣載體DNA分子的兩個黏性末端發(fā)生退火互補，失去了鏈接能力，不能形成共價環(huán)化結構，這種分子是不穩(wěn)定的，在連接部位容易解鏈形成開環(huán)的線性分子，通過堿性磷酸酶預處理線性載體，提高插入片段的用量，可以有效防止載體自

9、身環(huán)化。第三章1.在基因工程操作中，把能攜帶外源DNA進入受體細胞的DNA分子叫載體。基因工程對載體的要求：在宿主細胞內能獨立復制(fzh)，有選擇性標記，有一段多克隆位點。，外源DNA插入其中不影響(yngxing)載體的復制，分子量小，拷貝數(shù)多，容易從宿主細胞中分離純化。載體(zit)的種類：質粒、單鏈DNA噬菌體M13、 噬菌體的衍生物 2.質粒:是獨立于染色體以外的能自主復制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子。存在于細菌、霉菌、藍藻、酵母等細胞中。質粒的一般生物學特性:分子小（1-200kb）、編碼基因少、環(huán)形狀（雙鏈環(huán)狀DNA）。質粒的空間構型： 共價閉合環(huán)狀DNA（ccDNA)即SC構型，

10、開環(huán)DNA（ocDNA）即OC構型， 線形DNA （lDNA）。同一質粒盡管分子量相同，不同的構型電泳遷移率不同：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。質粒的基本特征：質粒的自主復制性，質粒的不相容性，質粒的可轉移性，攜帶特殊的遺傳標記。（拷貝數(shù)：細胞內質粒/染色體數(shù)）反應質粒復制的強度。質粒獨立復制的三個特性：在宿主細胞內，單向，由自主和宿主細胞雙重遺傳控制。質粒的類型：（1）接合型質粒：如：F質粒。除了帶有自我復制所必需的遺傳信息外還帶有一套控制細菌配對和質粒接合轉移的基因。在天然條件下，能從一個細胞自行轉移到另一個細胞，大部分屬于嚴緊型質粒。（2）2. 非接合型質粒：如R質粒（

11、抗性質粒）、Col質粒。雖然帶有自我復制所必需的遺傳信息，但失去了控制細菌配對和質粒接合轉移的基因，因此不能從一個細胞轉移到另一個細胞。在天然條件下不能自己轉移到另一個細胞中。大部分屬于松弛型質粒，符合基因工程的安全要求。注：基因工程中所用的非接合型質粒載體缺乏轉移所必須的mob基因，所以不能發(fā)生自我轉移。質粒的復制類型：1. 嚴緊型質粒：拷貝數(shù)少，只有13份拷貝。2. 松弛型質粒：拷貝數(shù)多，有1060份拷貝。3理想質粒載體的必備條件：常見可用于基因工程的天然質粒有pSC101、CoLEl。第一個用于基因克隆的天然質粒是pSC101，是一個嚴緊型質粒，每個宿主細胞僅有1-2個拷貝，具有多個限制

12、性核酸內切酶的單一酶切位點；另一個天然質粒載體是CoLEl，它唯一單酶切位點EcoRI位于大腸桿菌素EI的編碼基因內。質粒載體必須具備的基本條件：（1）具有復制起點；（2）具有抗菌素抗性基因；（3）若干限制性內切酶的單一位點；（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。多克隆位點：指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制性核酸內切酶酶切位點的DNA片段。抗菌素抗性:氨芐青霉素抗性(殺死生長的細菌)，卡那霉素抗性（殺死細菌），四環(huán)素抗性(殺死生長的細菌)，鏈霉素抗性（殺死細菌），氯霉素抗性（殺死生長的細菌）。3.重要的大腸桿菌質粒載體：（1）pBR322：松弛型復制、氯霉素可擴增、拷貝數(shù) 50 - 1

13、00 / cell、用于基因克隆。（2）pUC18 / 19：拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell、裝有多克隆位點（MCS）正選擇(xunz)顏色標記 lacZ、用于基因克隆(k ln)和測序。注：pUC7是最早構建的一種PUC質粒載體。pGEM-3Z：多拷貝(kobi)、裝有多克隆位點（MCS）、正選擇顏色標記 lacZ、用于外源基因的高效表達。 克隆載體：指專用于基因或DNA片段無性繁殖的質體載體。（名詞解釋）4.容菌周期（裂解周期）：感染細菌后立即在菌體內復制和合成蛋白質外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。容原性周期：感染細菌后，將自己的DNA整

14、合到細菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化。5.單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13、f1、fd 噬菌體。特點：單鏈DNA；復制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA；RF DNA和ssDNA都能轉染感受態(tài)大腸桿菌。并產生噬菌斑；不存在包裝限制；可產生大量的含有外源DNA插入片 斷的單鏈分子，便于作探針或測序。（1） M13 噬菌體基本特性：寄主；DNA長度：6407bp；DNA提純：容易提取；沒有包裝限制。優(yōu)點：（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2） Xgal顯色反應，可供直接選擇（3）無包裝限制，克隆能力大（4）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。缺點：插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯

15、著下降。人工染色體：酵母人工染色體（YAC）、細菌人工染色體（BAC）、P1派生人工染色體、哺乳動物人工染色體（MAC）。第四章1.基因組DNA提取方法：堿抽提法（最常用）、煮沸法、去污劑裂解法。堿抽提法提取質粒DNA原理：閉合環(huán)狀的質粒DNA，在變性后不會分離，復性快，染色體線性DNA和或有缺口的質粒DNA變性后雙鏈分離，難以復性而形成纏繞的結構，與蛋白質SDS復合物結合在一起，在離心的時候沉淀下去。堿抽提法提取質粒DNA的步驟：溶菌；破膜，蛋白質和DNA變性；中和；離心除去沉淀；純化DNA；沉淀DNA。所用的試劑作用： 溶菌酶：能水解菌體細胞壁的肽聚糖中的-1，4糖苷鍵 葡萄糖：增加溶液的

16、粘度，維持滲透壓EDTA：Mg2+、Ca 2+的螯合劑，抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解NaOH-SDS：NaOH使DNA雙鏈變性，SDS溶解細胞膜蛋白和細胞內蛋白，使蛋白質變性沉淀 NaAc-HAc緩沖液：用來中和NaOH變性液，使DNA復性 乙醇:用于沉淀DNA RNase A:降解RNA渣滓 TE緩沖液: DNA保存液 酚-氯仿: 蛋白變性劑,使蛋白質沉淀。2.影響質粒DNA產量的因素：受體菌株；質粒拷貝數(shù)；質粒大小。(1).細菌基因組DNA的制備:（1）細胞裂解（2）DNA純化（3）沉淀DNA(2) 哺乳動物細胞基因組DNA的抽提:（1）組織粉碎（2）細胞裂解（3）純化DNA（4

17、）沉淀DNA（5）除去RNA污染。（3）.從植物組織中制備 DNA：（1）組織粉碎（2）細胞裂解（3）純化DNA（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染。-（了解看看）3.DNA的定量和純度測定：核酸在波長260nm處有最大的吸收峰，蛋白質的最大吸收峰在280nm。（注:閉合環(huán)狀卷曲超螺旋遷移最快， 線性分子次之， 伸展開環(huán)狀最慢）4.瓊脂糖凝膠電泳:瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點后溶解，冷卻(lngqu)后又凝固成均勻的的膠體“胨”。瓊脂糖的濃度決定(judng)凝膠的空隙（密度）,空隙大小決定其分辨分子大小的能力,空隙小，分辨率高，空隙大，分辨率低。聚丙烯酰胺凝膠電泳：優(yōu)點(yudin)

18、是比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多。瓊脂糖凝膠電泳：100050000bp。聚丙烯酰胺凝膠電泳：11000bp基因擴增技術-PCR技術；通過加熱或變性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA稱為DNA變性；解除變性條件后，變性的單鏈可以重新結合起來，形成雙鏈，稱DNA復性。（退火） 應用：核酸的基礎研究 、序列分析、轉基因檢測。 第五章1.目的基因：準備要分離、改造、擴增或表達的基因。基因組DNA片斷化：限制性內切酶法、隨機片斷化、機械切割法。化學合成目的基因：（常用的方法）磷酸二酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法。2.基因文庫：將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些

19、片斷都與適當?shù)妮d體連接，引入相應的宿主細胞中保存和擴增。構建基因文庫的載體選用：（常用的載體）載體系列：容量為 24 kp cosmid載體： 容量為 50 kb YAC：容量為1 Mb。基因文庫構建的一般步驟：染色體DNA大片段的制備；載體與基因組DNA大片段的連接；3.基因組文庫的大小：N=ln(1-p)/ln(1-f) N為重組子數(shù)量；p為所需要的概率；f為分離基因片段與該生物基因組大小的比值。 （了解）4. 構建cDNA文庫的一般步驟：總RNA（total RNA）提取；mRNA的分離純化；cDNA的合成。 cDNA文庫：利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接

20、，轉入細菌細胞中進行保存和擴增。cDNA文庫的特點：不含內含子序列。可以在細菌中直接表達。包含了所有編碼蛋白質的基因。比DNA文庫小的多，容易構建。cDNA文庫的大小:N=ln(1-p)/(1-1/n) N為克隆數(shù)；P為要求的概率；1/n為低豐度mRNA在總RNA中所占的比例。 （了解）第六章1.DNA片段的體外連接：粘性末端的連接、齊平末端（blunt end）的連接、（DNA接頭連接法：DNA連接子法、DNA接頭法）2.DNA體外連接應注意的事項：插入片斷與載體的酶切位點互補（注：相同的粘性末端才能有效地連接。盡量避免平端連接。決不能進行非粘性末端連接。用相同的酶切。用同尾酶切。）；DNA

21、插入的方向正確；插入基因的開放閱讀框（ORF）正確；防止載體自身環(huán)化連接。（方法：提高插入片斷的用量；用堿性磷酸酶處理載體。）3.感受態(tài)細胞：受體細胞處于外源DNA的狀態(tài)。 制備原理：一般用0.01-0.05mol/l氯化鈣處理受體細胞，增大細胞的通透性。感受態(tài)大腸桿菌(d chn n jn)的制備:培養(yǎng)大腸桿菌、OD600至0.3-0.4、On ice 5-10 min、4離心(lxn)收集菌、On ice 30 min、用冰冷(bnglng)的60mMCaCl2重懸、4離心收集菌、用冰冷的60mMCaCl2重懸、4離心收集菌、用冰冷的60mMCaCl2重懸、分裝、-70 凍存。外源DNA導

22、入細菌的幾種方法:轉化、轉染、轉導。 轉化方法：熱休克法、電轉化法。4. 影響轉化率的因素：重組質粒、感受態(tài)細胞、外源基因導入真核細胞：一、導入酵母細胞：1. 菌株選擇；2. 酵母的轉化方法：（1）利用原生質球進行轉化、（2）利用Li+鹽進行轉化；3.導入植物細胞方法：葉盤法、電擊法；4.導入哺乳動物細胞方法：磷酸鈣沉淀法、脂質體載體法、顯微注射法。（了解）5.如果在轉化實驗中，對照組不該長出菌落的平板長出了菌落，這種現(xiàn)象說明實驗可能存在哪些問題？ 答：倒平板時培養(yǎng)基溫度過高，加入的氨芐青霉素會失效；抗生素添加的量太少，濃度不夠；培養(yǎng)平板滅菌不徹底，存在雜菌污染；培養(yǎng)平板上的部分菌株未轉化成功

23、；感受態(tài)細胞受到污染；培養(yǎng)時間過長，可能出現(xiàn)衛(wèi)星菌落等等。6.基因工程上游工程操作技術：細菌的培養(yǎng)、染色體DNA的提取、凝膠電泳確認、PCR擴增反應（提純、再次電泳確認）、PCR產物酶切過夜、PCR/ER產物電泳過程純化。PBBSK/DH5轉化子培養(yǎng)、PBBSK質粒提取、質粒的電泳、PBBSK/ER產物、PBBSK/ER產物電泳。 兩個步驟結合連接、轉化、平板培養(yǎng)、篩選，鑒定重組子1 基因工程操作的三大基本元件是【】I 供體 II 受體 III 載體 IV 抗體 V 配體 I + II + III I + III + IV II + III + IV II + IV + V III + IV

24、+ V 2 根據當今生命科學理論，基因工程的用途是【 】 I 分離純化基因 II 大量生產生物分子 III 構建新型物種 IV 提高基因重組效率 I + II + III I + II + IV I + III + IV II + III + IV I + II + III + IV 3 基因工程的三大理論基石是【 】 經典遺傳學、細胞生物學、微生物學 分子遺傳學、分子生物學、生化工程學 動物學、植物學、微生物學 生物化學、生化工程學、化學工程學 生理學、仿生學、免疫學 4 根據基因工程的定義，下列各名詞中不能替代基因工程的是【 】 基因誘變 分子克隆 DNA重組 遺傳工程 基因無性繁殖 5

25、基因工程的單元操作順序是【 】 增，轉，檢，切，接 切，接，轉，增，檢 接，轉，增，檢，切 檢，切，接，增，轉 切，接，增，轉，檢 6 生物工程的上游技術是【 】 基因工程及分離工程 基因工程及發(fā)酵工程 基因工程及酶工程 基因工程及細胞工程 基因工程及蛋白質工程 7 基因工程作為一種技術誕生于【 】 上世紀 50 年代初 上世紀 60 年代初 上世紀 70 年代初 上世紀 80 年代初 上世紀 90 年代初 8 利用基因工程擴增基因是依據【 】 基因定向重排 強化啟動基因 增強子重組 SD 順序的存在 載體自主復制 9 第一個由重組(zhn z)大腸桿菌生產的人類蛋白（多肽）藥物是【 】 生長

26、激素(shn chn j s)（Growth hormone） 胰島素（Insulin） 干擾素（Interferon） 白細胞間溶菌素（Interleukin） 生長激素釋放(shfng)抑制素（Somatostatin） 10 下列有關基因的敘述，錯誤的是【 】 蛋白質是基因表達的唯一產物 基因是 DNA 鏈上具有編碼功能的片段 基因也可以是 RNA 基因突變不一定導致其表達產物改變結構 基因具有方向性。AEBAB A第九章1.重組子：含有重組DNA分子的轉化細胞。 轉化子：指導入外源DNA后獲得了新的遺傳標志的細菌細胞。 重組子的篩選方法：直接篩選（DNA鑒定、載體篩選）、間接篩選（翻譯

27、產物、轉錄產物）。具體方法：抗藥性標記插入失活、B-半乳糖苷酶顯色反應篩選法。B-半乳糖苷酶顯色反應篩選法原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點。 受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。可以被IPTG誘導表達。 載體和受體菌基因組可以互補形成完整有功能的-半乳糖苷酶。(了解看看)乳糖 半乳糖+ 葡萄糖Xgal 半乳糖 + 5-溴-4-氯靛藍（深藍色） 注：反應條件為B-半乳糖苷酶。注：由互補產生的lac+細菌較易識別，它在X-gal的存在下被IPTG誘導形成藍色菌落。假陽性：如果插入的外源DNA正好是3的倍數(shù)并且沒有中止密碼

28、。2. 一個攜帶有氨芐青霉素和卡那霉素抗性基因的質粒，被僅在卡那霉素基因中有識別位點的EcoR I消化。消化物與酵母DNA片段連接后轉化對氨芐青霉素和卡那霉素兩種抗生素都敏感的E coli菌株。 （1) 利用哪一種抗生素抗性選擇接受了質粒的細胞? （2) 怎樣區(qū)分接受了插入酵母DNA的質粒的克隆? 答：（1）氨芐青霉素。 （2）轉化后涂在只加氨芐青霉素的平板上，將這個平板上的菌落轉到加卡那霉素的平板上，將兩個平板對照，選擇只在氨芐青霉素的平板上生長的菌落，即為插入酵母DNA的質粒的克隆。3. 以pBR322 DNA作為載體，從四環(huán)素抗性基因區(qū)克隆外源DNA時，可采用環(huán)絲氨酸富集法篩選重組體，說

29、明其基本原理和基本操作過程。答：原理：由于四環(huán)素的作用只是抑制細菌蛋白質的合成，而不是殺死細菌；而氨基酸類似物環(huán)絲氨酸如果摻人蛋白質，則是致命的。因此在有四環(huán)素的條件下，環(huán)絲氨酸能夠殺死tetr而不殺死tets的細菌。經過環(huán)絲氨酸處理后，存活的細胞中tets型得到很大富集，而經過若干次連續(xù)處理，即能獲得在tetr基因內含有插人物的質粒的細胞。基本操作：(1)轉化后有三種表型的細菌，其中只有一種是重組體：AprTcs；(2)用重組DNA轉化受體菌后，將受體菌培養(yǎng)在加有四環(huán)素和環(huán)絲氨酸的培養(yǎng)液中培養(yǎng)；此時只有非重組的雙抗性菌可以生長，其他都被抑制；(3)由于有環(huán)絲氨酸的存在，AprTcs表型的菌生

30、長到一定程度就會死亡；(4)由于四環(huán)素只有抑菌而無殺菌作用，此時若解除四環(huán)素(離心洗滌)，加入氨基芐青霉素繼續(xù)培養(yǎng)，則可使重組體大量生長。課件講解(jingji)：（1）四環(huán)素：抑制(yzh)細菌生長，但不殺死細菌。（2）氨芐青霉素抗性基因(jyn)：產生-內酰胺酶，使氨芐青霉素轉變?yōu)榍嗝雇幔沟?青霉素指示液（藍灰色）褪色。（3）環(huán)絲氨酸：殺死生長的細菌，但不殺死停止生長的細菌。4.根據插入基因的表型選擇原理：1.彌補缺陷：轉化進來的外源基因產物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷；2. 增加新性狀：使被轉化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。（了解看看）DNA電泳檢測法:直接電泳檢測法(從轉化后的菌體

31、克隆中分離質粒，電泳、比較其分子量)、酶切電泳篩選法(比較DNA代數(shù)和長度)。5. PCR擴增檢測法：1. 原理：PCR能在模板序列上擴增出預期DNA片斷。2. 過程：（1）從重組克隆中提取質粒（或DNA）（2）用外源DNA插入片斷引物作PCR（3）電泳PCR產物（4）檢查是否有PCR產物（5）PCR產物的長度是否與外源基因一致。6.核酸雜交檢測法原理：1.核酸雜交：重組克隆與探針雜交2. 檢測用的探針：與外源DNA插入片斷互補的序列。3. 識別標記：放射性同位素如32P，非放射性同位素如熒光素。7.Southern blotting（Southern印跡雜交法）：用DNA（或RNA）探針檢測

32、DNA樣品。定義：將重組子DNA提取出來，用合適的限制性核酸內切酶將DNA切割，并進行凝膠電泳分離，然后經堿變性，最后同標記的核酸探針進行分子雜交的方法。（1）原位雜交篩選特點：應的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。（了解）（2）R-環(huán)檢測法：DNA和RNA雜交，外源基因的mRNA與重組載體雜交。（了解）8. Northern blotting（Northern印跡雜交法）：用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。定義：指從宿主細胞中提取RNA，再用探針雜交的方法。9.免疫化學檢測法：對表達產物的檢測。蛋白蛋白“雜交。放射性抗體檢測法：抗體與產物的結合方式；免疫沉淀檢測法：抗原抗體凝

33、集反應。10.酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）步驟：（1）固定樣品（2）一抗結合（3）二抗結合（4）顯色反應（5）比色：在特殊的分光光度儀（酶標儀）上比色，打印出結果。局限性：準確性稍差11.免疫(miny)印跡（western blotting）法：指在蛋白質凝膠電泳以后(yhu)，用轉膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質泳帶的方法。第十章1.表達載體：要使克隆基因在宿主細胞中表達，就要(ji yo)將它放入帶有基因表達所需要的各種元件的載體中，這種載體稱為表達載體。2.大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢：全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架；基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善；繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺

34、傳穩(wěn)定。劣勢：缺乏對真核生物蛋白質的復性功能；缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統(tǒng)；內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白；細胞周質內含有種類繁多的內毒素。3.真核基因在大腸桿菌中表達存在的困難有哪些？在大腸桿菌mRNA 核糖體結合位點上，含有一個翻譯起始密碼子及與16S核糖體RNA3末端堿基互補的序列，即為SD序列；絕大多數(shù)真核生物的mRNA分子，在5末端有帽子結構，3端有A尾巴，而原核生物沒有；許多真核基因的蛋白質產物需要經過翻譯后的加工修飾；外源真核基因所表達的蛋白質分子往往能夠被細菌的蛋白酶識別，并被當做異己分子降解掉。原核生物基因表達的特點：只有一種RNA多聚酶；以操縱子為單位；轉錄

35、和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行；不含內含子，缺乏轉錄后的加工系統(tǒng)；調控主要在轉錄水平上；mRNA的核糖體結合位點。原核表達系統(tǒng)的注意事項：外源基因不能帶有內含子；必須用cDNA；不能直接用真核基因組DNA；防止外源基因產物對宿主細胞的毒害。（了解）4.常用的大腸桿菌表達載體：（1）表達載體的一般組成：一般載體+啟動子+核糖體結合位點+翻譯起始點AUG。（2）大腸桿菌表達載體的組成部分：啟動子：是DNA上的能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。 啟動子必須具備的條件：必須是一種強啟動子；應是可誘導型的；這種啟動子應能呈現(xiàn)出一種低限的基礎轉錄水平。 注：Lac啟動子來源于大腸桿菌的乳糖操縱子。 （

36、了解看下） 翻譯的起始位點：核糖體結合位點（ RBS）、起始密碼。轉錄終止子翻譯終止密碼翻譯增強子 （了解看看）5.幾種類型的原核表達載體：（1）非融合型表達載體：載體表達出的外源基因蛋白質不與細菌的任何蛋白質融合在一起。如，pKK223-3 載體組成結構： 強啟動子: tac（trp-lac）操縱基因調節(jié)基因終止子S-D序列和插入位點區(qū)表達誘導物。（2）分泌型表達載體（3）融合蛋白表達載體系統(tǒng)-pGEX系列：表達出的外源基因產物蛋白是與質粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。 優(yōu)點：便于融合蛋白的分離和純化，可誘導高效表達。（了解）6.外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位：（1）細胞質中表達： 優(yōu)點：使

37、重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細胞； 缺點：回收的蛋白生物活性差。(2)周質中表達優(yōu)點： 容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。（3）胞外表達。7.如何有效地提高外源基因的表達效率？選擇(xunz)強啟動子序列，如tac 等；調整(tiozhng)S-D序列(xli)與AUG堿的距離；改變起始密碼下面的幾組密碼子；增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性；減輕宿主細胞的代謝負荷。影響外源基因表達效率的因素（或提高外源基因表達效率的方法）：（1）啟動子的結構對表達效率的影響；如，一致順序 即-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離和-35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序。（2）轉譯起始序列對表達效率的影響；

38、如SD序列；（3）啟動子與外源基因之間的距離；（4）轉錄終止區(qū)對表達效率的影響；（5）載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達效率的影響；（6）外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對表達效率的影響。 （了解看看）8.提高表達產物的穩(wěn)定性，防止其降解：（1）設計成融合蛋白（2） 使用突變菌株，保護外源蛋白不被降解（3）表達分泌蛋白。 9.外源基因在真核細胞中的表達：（外源基因：啟動子+MCS+polyA信號+終止子）（一）酵母表達體系：（1） 酵母克隆載體分為：整合型載體(YIp)。特點：轉化率低；不能在酵母細胞中自主復制；整合到酵母的染色體上；不能從酵母細胞中提取載體。復制型載體(YRp) 。特點：轉化率高；可從大腸桿菌

39、和酵母中提取質粒；著絲粒質粒(YCp)。特點：能穩(wěn)定遺傳，不易從細胞中提取；附加體型載體(YEp)。特點：很高的轉化活性，拷貝數(shù)多，比YRP穩(wěn)定。10.酵母轉化和表達的一般過程：Lau- 酵母，（酶去壁）原生質體，（氯化鈣處理）感受態(tài)，（轉化）插入外源基因，酵母載體，（提取）大腸桿菌。酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點：已經分離出很強的啟動子，有翻譯后的加工，安全性高。缺點：表達量普遍低，常常發(fā)生質粒丟失。第十一章1.Ti質粒：是一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，根據其誘導植物細胞產生冠癭堿種類不同分為章魚堿型、胭脂堿型、農桿堿型、農桿菌素堿型。根癌農桿菌的生物學特征：zaenen等在根癌農桿菌體內分離出一種與腫瘤有關的質粒稱為Ti質粒。根癌農桿菌侵染植物后產生兩種物質：類植物激素和冠癭堿。各種質粒在結構上可分為四個部分：毒性區(qū)：又稱Vir區(qū)，該區(qū)段上的基因能激活 T-DNA 轉移，使農桿菌表現(xiàn)出毒性。T-DNA區(qū)： 是農桿菌侵染植物細胞時，從 Ti 質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段 DNA，稱之為轉移 DNA。該 DNA 片段上的基因與腫瘤的形成有關。接合轉移區(qū)