1、Protein第章 蛋白質的共價結構蛋白質 （Protein）“生命是蛋白體的存在方式，這種存在方式本質上就在于這些蛋白體的化學組成部分的不斷的自我更新。” 恩格斯反杜林論 1878年1838年，J. J. Berzelius提出，由proteios衍生而來， 第一重要，首要的物質蛋白質存在于所有生物細胞中，是構成生物體最基本的結構物質和功能物質。蛋白質是生命活動的物質基礎，參與了幾乎所有的生命活動過程。一、蛋白質通論（一）、蛋白質的化學組成和分類、元素組成蛋白質是一類含氮有機化合物 、蛋白質的含氮量蛋白氮占生物組織所有含氮物質的絕大部分。大多數蛋白質含氮量接近于16% 蛋白質含量 = 每克樣

2、品中含氮的克數6.25凱氏定氮法三聚氰胺含氮量：66.7%含氮量是蛋白質的4.16倍。、蛋白質的分類（1）、依據外形分類球狀蛋白質：globular protein 外形接近球形或橢圓形，溶解性較好纖維狀蛋白質：fibrous protein 形似纖維或細棒，分可溶性/不溶性兩種膜蛋白質：membrane protein 親水性殘基少于胞質蛋白（2）、依據蛋白質的組成分類單純蛋白 simple protein 單純蛋白，僅由氨基酸組成綴合蛋白 conjugated protein由簡單蛋白與其它非蛋白成分結合而成單純蛋白清蛋白和球蛋白 albumin and globulin 廣泛存在于動物組

3、織谷蛋白和醇溶谷蛋白 glutelin and prolamin 植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/堿魚精蛋白和組蛋白 堿性蛋白存在于細胞核硬蛋白 存在于軟骨、腱、毛發、絲等組織中， 分為角/膠原/彈性/和絲蛋白等綴合蛋白糖蛋白：簡單蛋白+糖類物質脂蛋白：簡單蛋白+脂類結合核蛋白：簡單蛋白+核酸磷蛋白：含與Ser,Thr和Tyr殘基的羥基酯化的磷酸基。金屬蛋白：含有金屬離子的蛋白質血紅素蛋白：金屬蛋白的一個亞類；輔基為血紅素，是卟啉化合物。黃素蛋白：含黃素，輔基為FMN和FAD。（3）蛋白質按生物學功能分類酶：如核糖核酸酶，胰蛋白酶等調節因子：如胰島素、促生長素、促甲狀腺素等轉運蛋白：如血紅蛋白

4、、血清清蛋白、和葡糖轉運蛋白貯存蛋白：如卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白和鐵蛋白收縮和游動蛋白：肌動蛋白、肌球蛋白、動力蛋白結構蛋白：角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白、絲蛋白和蛋白聚糖支架蛋白：如胰島素受體底物-1、A激酶錨定蛋白和信號傳遞轉錄激活劑保護和開發蛋白：如免疫球蛋白、凝血酶、血纖蛋白原、抗凍蛋白、蛇和蜂毒蛋白、白喉毒素等異常蛋白：如應樂果甜蛋白、節肢彈性蛋白和膠質蛋白（二）、蛋白質的大小與分子量蛋白質是分子量很大的生物分子對任一種給定的蛋白質，其所有分子在AA組成和順序以及肽鏈的長度方面都應是相同的，即所謂均一的蛋白質。人為規定Pr分子量上下限下限一般認為從胰島素開始，其相對分子量為5700（

5、51個氨基酸殘基）某些Pr由兩至多個亞基經 非共價結合而成（寡聚蛋白）分子量高達數百/千萬。如谷酰胺合成酶（12個亞基組成），如煙草花葉病毒（2130個亞基和一條RNA鏈構成。蛋白質與多肽無嚴格的界線 通常將6000Dr以上的多肽稱為蛋白質。蛋白質分子量變化范圍很大蛋白質月示胨多肽肽AA 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500對于不含輔基的單純蛋白質，相對分子量/110aa殘基數20種aa的平均分子量約為138，較小的氨基酸占優勢，因此平均分子質量為128。形成一個肽鍵失去一分子水（分子量18），aa殘基的平均分子量為110。100個氨基酸殘基的蛋白質，分子量約

6、為多少？（三）、蛋白質構象和結構的組織層次蛋白質的結構層次一級結構二級結構三級結構四級結構高級結構空間構象蛋白質的各級結構的基本概念一級（1o）結構：肽鏈中的氨基酸排列順序。二級（2o）結構：多肽鏈借助氫鍵排列成自己特有的a螺旋和b折疊股片段。三級（3o）結構：多肽鏈借助各種非共價鍵（非共價力）彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀構象。四級（4o）結構：寡聚蛋白質中各亞基之間在空間上的相互關系和結合方式。一個蛋白質分子為獲得復雜結構所需的全部信息都含于1o結構即多肽鏈的氨基酸序列中示例肌紅蛋白的三級結構和丙酮磷酸異構酶的三級結構血紅蛋白四級結構（四）、蛋白質功能的多樣性1. 催化功能-酶2. 調

7、節功能-激素、基因調控因子3. 轉運功能-膜轉運蛋白、血紅/血清蛋白4. 貯存功能-乳、蛋、谷蛋白5. 運動功能-鞭毛、肌肉蛋白6. 結構成分-皮、毛、骨、牙、細胞骨架7. 支架作用-接頭蛋白8. 防御功能-免疫球蛋白9. 異常功能生老病死，萬物輪回(蛋白質層次)生（誕生、生長）：在酶催化下老細胞 計劃性凋亡和新細胞的再生（新陳代謝）、活細胞的代謝老？蛋白質功能普遍衰退(?) 病個別蛋白質的功能障礙死？蛋白質功能的全部停止/分解 蛋白質生物功能分子單細胞生物胞外酶鞭毛-蛋白質（運動器官）細胞壁-糖、脂、肽細胞膜-載運蛋白、膜蛋白細胞質-酶蛋白（催化物質代謝）細胞核-酶蛋白（遺傳）多細胞動物個體

8、層次毛發、皮膚 -角蛋白骨骼、牙齒 -鈣+膠原蛋白肌肉 -肌球蛋白/肌絲蛋白二、肽（peptide）AA-NH2與另一AA-COOH間失水形成的酰胺鍵稱肽鍵，所形成的化合物稱肽。由兩個AA組成的肽稱為二肽。含幾個至十幾個AA的肽鏈稱為寡肽由20個AA以上組成的肽則稱為多肽。組成多肽的AA單元稱為氨基酸殘基。多肽鏈中AA殘基按一定順序排列：氨基酸順序含游離-氨基的一端：氨基端或N-端 含游離-羧基的一端：羧基端或C-端AA順序是從N-端開始以C-端氨基酸殘基為終點 如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln反過來寫的是一個不同的肽肽鍵是aa間的基本連接方式。證據：、Pr中游離氨基和羧基很

9、少。、人工合成的多肽能被蛋白酶水解。、Pr能發生雙縮脲反應（紫紅色或藍紫色）、人工合成的多聚aa的射線衍射圖案和紅外吸收光譜與天然的纖維狀蛋白質十分相似。、我國首次人工合成結晶牛胰島素。（一）、肽和肽鍵的結構肽鍵的特點是：N上孤對電子與羰基有明顯的共軛作用。肽鍵中C-N鍵有部分 雙鍵性質 不能自由旋轉組成肽鍵原子處于 同一平面（肽平面）鍵長及鍵角一定大多數情況以反式 結構存在共價主鏈 （二）、肽的物理化學性質離子晶格，在水溶液中以偶極離子存在。肽末端-羧基pKa值比游離AA中的大。 肽末端-氨基pKa值比游離AA中的小。酸堿性質取決于： -羧基、-氨基、側鏈基團的解離等電點，靜電荷為零時溶液的

10、pH值。肽的化學反應也和AA一樣，游離的-羧基、-氨基、側鏈基團可以發生類似AA的反應，如茚三酮反應。具有雙縮脲反應肽特有的反應。（紫紅色或藍紫色）（三）、 天然存在的活性肽生物體中多肽最重要的存在形式是作為蛋白質的亞單位；有許多分子量比較小的寡（多）肽以游離狀態存在，這類肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽、激素類多肽、抗生素類多肽、 谷胱甘肽、蛇毒多肽等 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-腦啡肽 Leu-腦啡肽 L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn

11、 L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短桿菌肽S(環十肽) 由細菌分泌，含有D-AA和一些不常見AA，如鳥氨酸（Ornithine, Orn）。 鵝膏覃堿是一種環狀八肽，真核生物RNA聚合酶II的抑制劑（能與RNA聚合酶緊緊結合）三、蛋白質一級結構的測定蛋白質AA順序測定是蛋白質化學研究的基礎1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構現已有成千上萬種不同蛋白質的一級結構被測定。 什么是Pr的一級結構？蛋白質中氨基酸的排列順序。1.樣品必需純（97%以上）2.知道蛋白質的分子量3.知道蛋白質由幾個亞基組成4.測定蛋白質的AA組成并根據分子量 計算每種AA的個數5.測定水解液中的

12、氨量計算酰胺的含量蛋白質測序前提（一）、蛋白質測序策略(1) 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數目。蛋白質一級結構的測定（一）、蛋白質測序策略(2) 多肽鏈的拆分蛋白質一級結構的測定（一）、蛋白質測序策略幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體。可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基)。蛋白質一級結構的測定（一）、蛋白質測序策略(3) 斷開二硫鍵在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生

13、成的巰基，防止重新被氧化。蛋白質一級結構的測定巰基（-SH）的保護（一）、蛋白質測序策略蛋白質一級結構的測定(4)測定每條多肽鏈的AA組成，并計算出AA成分的分子比部分樣品進行完全水解，測定氨基酸組成（一）、蛋白質測序策略(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端(6)多肽鏈斷裂成多個肽段采用兩/多種不同的斷裂方法將多肽 斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。蛋白質一級結構的測定（一）、蛋白質測序策略(7)測定每個肽段的氨基酸順序蛋白質一級結構的測定(8)確定肽段在多肽鏈中的次序 利用兩/多套肽段的AA順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的AA順序。(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。（一）、蛋白質測序

14、策略蛋白質一級結構的測定胃蛋白酶水解兩類多肽鏈末端氨基酸殘基： N-端氨基酸 C-端氨基酸在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸殘基測定Sanger法1、 末端分析 二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+ H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸（二）、末端氨基酸殘基的鑒定N堿性條件二硝基苯衍生物黃色二甲氨基萘磺酰-AA有強熒光，檢測靈敏度高 丹磺酰氯（DNS）法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、 末端分析1N堿性條件(DNS-aa)苯異硫氰酸酯（PITC)法（二）、

15、末端氨基酸殘基的鑒定、 末端分析1NN=C=S + NCH CONHCHHR1PITCNCNCHCONHCHHRSPTC-多肽NCHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF苯異硫氰酸酯PITCR2多肽+NCH CONHCHHR2R3少一個氨基酸的多肽肽鏈外切酶:從多肽鏈N-端逐個向里水解根據不同反應時間測出釋放的AA種類和數量， 按反應時間和AA殘基釋放量作動力學曲線 蛋白質N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 水解以Leu殘基為N-末端的肽鍵速度最大。氨肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、 末端分析1N氨基酸酰肼可與苯甲醛縮合成不溶于水的物質。上清中的氨基酸可通過其他方法鑒定

16、肼解法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、 末端分析2C1n-1（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、 末端分析2C C末端AA 氨基醇 水解肽鏈，鑒定氨基醇 還原法硼氫化鋰肽鏈外切酶:從多肽鏈C-端逐個水解根據不同反應時間釋放出的AA種類和數量 蛋白質C-末端殘基順序。四種羧肽酶：A,B,C和Y； A和B(胰臟)、C(柑桔葉)、Y(面包酵母)A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA殘基 B:只水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵 Y：可作用于任何一個C-末端殘基的肽鍵羧肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、 末端分析2C（三）、二硫鍵的斷裂鹽酸胍/尿素解離多肽鏈間的非共價力。應用過甲酸氧化法或巰基

17、還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。1、酸水解常用6M鹽酸或4M硫酸優點：水解產物不消旋缺點：Trp被沸酸完全破壞 含羥基Ser、Thr、Tyr部分分解 Asn、Gln酰胺基被水解（四）、氨基酸組成的分析2、堿水解一般用5M氫氧化鈉缺點：許多AA受到不同程度的破壞 部分水解產物發生消旋化優點：Trp不受破壞（四）、氨基酸組成的分析1、酶解法:內切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解 （五）、多肽鏈的部分裂解和 肽段混合物的分離純化目前序列分析方法最長只能幾十個殘基，因此需要裂解多肽，然后分離純化。R1=Lys（K）或Arg（R）專一性較強，水解速度快

18、R2=Pro（抑制）肽鏈水解位點胰蛋白酶trypsin減少斷裂點： 保護Lys側鏈-NH2或修飾Arg胍基增加斷裂點： 將Cys變為類似Lys的結構R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制） pH8-9肽鏈水解位點糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度與相鄰AA性質有關: 酸性：-/堿性：+R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性強的AA水解速度較快肽鏈水解位點R2= Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜熱菌蛋白酶（th

19、ermolysin)R1和/或R2Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、 Leu（L）及其它疏水性AA水解速度較快 R1=Pro（抑制）pH2肽鏈水解位點胃蛋白酶Pepsin肽鏈水解位點羧肽酶和氨肽酶2、化學裂解法 溴化氰水解法(Cyanogen bromide)選擇性地切割由Met羧基形成的肽鍵。（五）、多肽鏈的部分裂解和 肽段混合物的分離純化多肽鏈的選擇性降解 NH2OH斷裂： 較專一性斷裂Asn-Gly之間的肽鍵 Asn-Leu及Asn-Ala鍵也能部分斷裂 3、肽段的分離純化： 凝膠過濾、凝膠電泳和HPLC法N-端分析法特點：能夠不斷重復循環，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解

20、離。1、 Edman法（六）、肽段氨基酸序列的測定（苯異硫氰酸酯法）Edman于1950年首先提出。無水氨基非質子化PITCPTC-肽2、氨肽酶法或羧肽酶法3、質譜法（MS） 靈敏度高、所需樣品少、測定速度快核糖體蛋白質鏈4.根據核苷酸序列的推定法根據核苷酸序列的推定法：（1）用待測的蛋白質作抗原免疫動物 抗體（2）分離多核糖體（3）抗體沉淀此種蛋白質多核糖體（4）分離該蛋白質的模板mRNA，（5）反轉錄成cDNA（6）根據測定cDNA序列推測蛋白質的AA序列。 注意：必須知道蛋白質N-末端和C-末端氨基酸殘基（七）、肽段在多肽鏈中次序的決定重疊肽（overlaping peptide）胃蛋白

21、酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈經電泳分離各肽段用過甲酸斷開二硫鍵，含有-S-S-的肽段帶電性質發生變化，轉向90二次電泳，曾含二硫鍵的肽段遷移率發生變化然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置（八）、二硫鍵位置的確定胃蛋白酶最適pH約2，此時二硫鍵不斷開專一性低、肽段短（九）、蛋白質測序舉例（十）蛋白質序列數據庫 www.ncbi. nlm. 同源蛋白質：來自不同生物體、 執行同一 /相似功能的蛋白質 同種蛋白質：來自相同生物體、 執行同一功能的蛋白質 同源蛋白質的AA序列具有明顯的相似性 序列同源性（sequence homology） 不變殘基/可變殘基1、同源蛋白質四、蛋白質的A

22、A序列與生物功能（一）同源蛋白質的物種差異與生物進化 一百多個AA殘基 MW約12.5103 2 8個不變殘基 序列間AA差異數與物種間系統發生差異成比例；進化位置上相差愈遠，AA序列之間的差別愈大。 細胞色素C的AA序列差異可用于核對各物種間的分類學關系以及繪制系統樹/進化樹。2、細胞色素C與系統樹invariant residues (yellow) conservative substitutions (blue)nonconservative or variable residues (unshaded)Conservation and variation of cytochrome

23、c sequences 序列同源關系表明隨機突變導致一級 結構方面AA取代/趨異事件的進化順序。1、氧合血紅蛋白（二）同源蛋白質具有共同的進化起源該酶類活性中心的Ser殘基起關鍵作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、 凝血酶和纖溶酶有序列同源性對底物偏愛不同2、絲氨酸蛋白酶類卵清中的溶菌酶（lysozyme）- 乳清蛋白（lactalbumin）三級結構很相似 也可能具有共同的祖先。3、一些功能差異很大的蛋白質（三）血液凝固與AA序列的局部斷裂 凝血酶原血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纖蛋白原轉變為不溶性的血纖蛋白網。可溶性的血纖蛋白原酶有活性的凝血酶不溶性的血纖蛋白網（一）肽的人工

24、合成 保護（氨基、羧基、側鏈活性基團） 活化（氨基、羧基） 縮合劑 （二）胰島素的人工合成（三）固相肽合成五、肽與蛋白質的人工合成樹脂掛接1.有一多肽經酸水解后產生等摩爾的Lys，Gly和A1a.如用胰蛋白酶水解該肽，僅發現有游離的Gly和一種二肽。下列多肽的一級結構中，哪一個符合該肽的結構? A.Gly-Lys-Ala-Lys-Gly-Ala B.Ala-Lys-Gly C.Lys-Gly-Ala D.Gly-Lys-Ala E.Ala-Gly-Lys2.測定小肽氨基酸順序的最好方法是 A.2，4-二硝基氟苯法(FDNB法) B.二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-Cl法) C.氨肽酶法 D.苯異硫

25、氰酸法(PITC法) E.羧肽酶法選擇題 3.用下列方法測定蛋白質含量，哪一種方法需要完整的肽鍵? A.雙縮脲反應 B.克氏定氮 C.紫外吸收 D.茚三酮反應 E.奈氏試劑4.下列關于蛋白質中L-氨基酸之間形成的肽鍵的敘述，哪些是正確的? (1).具有部分雙鍵的性質 (2).比通常的C-N單鍵短 (3).通常有一個反式構型 (4).能自由旋轉 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,41 珠蛋白也是球蛋白2 用羧肽酶A水解一個肽，發現從量上看釋放最快的是Leu，其次是Gly，據此可斷定，此肽的C端序列是gly-leu3 等電點不是蛋白質的特征參數4 催產素和加壓素只有三

26、個氨基酸地殘基不同5 胰蛋白酶專一地切在多肽鏈中堿基氨基酸的N端位置上6 溴化氰能作用于多肽鏈中的甲硫氨酸鍵7 在蛋白質和多肽分子中，連接氨基酸殘基的共價鍵除肽鍵外，還有就是二硫鍵二、是非題（）（）（）（）（）（）（）1 胰凝乳蛋白酶專一性的切斷 和 的羧基端肽鍵2 胰島素的分子量大約是 3 一條肽鏈；AsnHisLysAspPheGluIleArgGluTyrGlyArg經胰蛋白酶水解，可得到 個肽4 肽經溴化氰（CNBr）處理后，在 殘基右側的肽鍵被裂解，裂解后該殘基變成 5 繼Sanger之后， 與 二人共同建立了蛋白質一級結構的測定技術獲得了諾貝爾獎6 胰蛋白酶的專一性就是在 殘基右側的肽鍵上水解填空題7 胰島素是 分泌的多肽激素，是由前胰島素原經專一性蛋白水解，失去N端的 成為 。再經肽酶激活失去 ）肽，最后形成具有生物活性的胰