1、第四章 基因操作中大分子的分離和分析三、分子雜交分子雜交：指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或 RNA），在一定條件下按堿基互補配對原則經過退火 處理，形成異質雙鏈的過程。由于操作方式相似，通 常將檢測蛋白質的抗原抗體反應也看作是分子雜交。作用：用于檢測混合樣品中特定核酸分子或蛋白質 是否存在，以及其相對分子質量的大小。 分類：根據檢測對象的不同可分為Southern雜交、 Northern雜交、Western雜交。Southern雜交： 即DNA-DNA雜交分析，檢測樣品中特定的DNA及其含量 。Northern雜交： 即RNA-DNA雜交分析。檢測樣品中是否含有特定 基因的轉錄產物（

2、mRNA）及其含量 。Western雜交： 即利用抗原-抗體反應，檢測轉移到硝酸纖維素 膜上的特異性蛋白質。 Southern雜交 1975年，英國Southern創建 1.是一種檢測DNA分子的一種方法，通過southern印跡轉移將瓊脂糖凝膠上的DNA分子轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后進行分子雜交，在濾膜上找到與核酸探針有同源序列的DNA分子。2.主要步驟：（1）待測DNA樣品的制備、酶切（2）待測DNA 樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳（3）凝膠中DNA的變性：堿變性（4）Southern轉膜： 硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜 毛細管虹吸印跡法、電轉印法、真空轉移法（5）探針的制備（6）Sou

3、thern雜交(預雜交、雜交） 預雜交的意義：將濾膜的空白處用魚精DNA或牛奶蛋白 封閉起來，防止在雜交過程中濾膜本身對探針的吸附。 （7）洗膜 經過一定的洗滌程序將游離的探針分子除 去。 （8）雜交結果的檢測3.Southern 印跡轉移（轉膜）印跡轉移（blotting) ：通過電泳將DNA、RNA或蛋 白質樣品進行分離，使不同相對分子質量的的分子 在凝膠上展開，然后將凝膠上的樣品通過影印的方 式轉移到濾膜上的過程稱為印跡。 4.探針及探針的標記 探針：分子雜交中被標記的已知序列的核酸片斷稱為探針。 （1）探針的種類： 根據探針的標記物不同：放射性探針和非放射性探針； 根據探針的來源及核酸

4、性質不同：分為DNA探針,RNA探針，cDNA探針，及寡核苷酸探針等幾類。 Western雜交中的抗體被看作探針。（2）探針的標記： i）標記物 同位素標記：32P、35S、3H等 非同位素標記：生物素、地高辛、熒光素等ii）標記方法 a 均勻標記 b末端標記帶有放射性的已知序列的核酸片斷標記已知序列的核酸片斷5 標記已知序列的核酸片斷3 a 切口平移法(nick translation)：大腸桿菌的DNA聚合酶b 隨機引物法(random primer)：六核苷酸殘基的引物c PCR擴增標記法:d末端標記法: 5335535355PCR擴增法標記示意圖T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T

5、4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5-OH上加磷5 HO3 HOOH 3 OH 5 T4-PNPMg2+ pppATP（g-32P-ATP3 HOp 5 5 p HO 3 a. 放射性標記的優缺點：制作簡單、 高比放射性、 放射自顯影效果好。優點：缺點：半衰期短（32P只有14.3天）、 不易保存、 對人體有害。 要求在專門實驗室操作。（3）標記物及其檢測b.非放射性標記： 地高辛標記地高辛可以與dNTP連接成地高辛-dUTP( UTP)等，參入DNA(RNA)的合成過程，形成地高辛標記的DNA(RNA)探針。利用抗地高辛的抗體通過酶聯免疫反應來完成。探針檢測原理地高辛探針

6、序列待測基因地高辛抗體酶底物產物探針DNA用地高辛標記。地高辛抗體與酶偶聯。酶催化一個顯色反應。地高辛抗體與地高辛結合。偶聯酶及其底物酶：堿性磷酸酶 （Alkaline Phosphatase, AP）催化一些特殊的反應，反應的過程生成有色的產物。酶的作用：AP的顯色反應底物(4) 單鏈探針的獲取f1-orilacZPT7MCSpBluescriptPT32958 bpAprNorthern 印跡雜交(Northern bloting)檢測RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳轉膜：不需變性Western雜交印跡轉移的是蛋白質雜交過程：抗原抗體反應探

7、針是針對某一蛋白質的特異性的抗體。其他分子雜交菌落雜交：就是將細菌菌落影印到濾膜上，或將菌種點種在濾膜上然后再生長出可見的菌落，對濾膜上的菌體進行原位裂解使 DNA 釋放出來，并使之固定在濾膜上。然后通過分子雜交，判斷哪個或哪些菌落含有與探針同源的DNA 。菌落雜交主要用來從用質粒或 Cosmid 構建的基因文庫中尋找陽性克隆。噬菌斑雜交：以噬菌斑改為菌落。斑點雜交：是分子雜交中最簡單的一種，直接將DNA或RNA分子以斑點的形式固定在雜交濾膜上，然后進行分子雜交。 其雜交的信號比菌落雜交和噬菌斑雜交受到蛋白質等細胞成分的干擾小，其結果的可靠性更強。 當核酸分子的斑點面積變得更小，在單位面積濾膜

8、上處理的樣品數量就更多，當檢測的靈敏度進一步提高后，就發展成 DNA 芯片。 四、基因芯片技術（一）、生物芯片的定義 生物芯片（Biochip）是指通過機器人自動印跡或光引導化學合成技術在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列，根據分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學領域中不連續的分析過程集成于芯片表面，以實現對細胞、蛋白質、基因及其它生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。基因芯片：又稱 DNA 芯片或DNA陣列，是生物芯片的一種類型，它是將 DNA 分子固定于支持物上，并與標記的樣品雜交，通過自動化儀器檢測雜交信號的強度來判斷樣品中靶分子的數量，進而得知樣品中mRNA的表達量。也

9、可進行基因突變體的檢測和基因序列的測定。6400點的基因芯片 （面積 12X14 mm)基因芯片分析的過程主要包括：樣品及其標記處理、芯片制作、分子雜交、信號的檢測和數據處理及分析等。（三）、生物芯片的分類 1按載體材料不同 玻璃芯片 硅芯片 陶瓷芯片 目前，玻片材料因易得、熒光背景低、應用方便等優點在國際上被廣泛接受。通常是將玻片用化學方法處理并連接上活性基團，如氨基、醛基、巰基等，使生物分子通過共價鍵或離子鍵與載體結合。 2按點樣方式不同 原位合成芯片（Loci-synthetic DNA Chip微矩陣芯片（Microarray）電定位芯片（Microelectronic） 是利用靜電吸

10、附的原理將DNA快速定位在硅基 質、導電玻璃上。3按芯片固定的生物分子類型 基因芯片或 DNA 芯片 蛋白質芯片（Protein Chip） 芯片實驗室（Lab-on-Chip） 在微小的硅材料表面，制造出能夠對微量樣品進行變性、分離、純化、電泳、PCR擴增、加樣及檢測等微小結構，使過去一個實驗的各個實驗步驟微縮于一個芯片上，這種技術被稱為芯片實驗室。顧秉林校長參觀北京博奧生物芯片有限公司 博奧研制的獸藥殘留蛋白芯片檢測平臺系統 4按芯片使用功能和用途不同分類 測序芯片 表達譜芯片 基因差異表達分析芯片 基因功能分析研究 將成千上萬個我們克隆到的特異性靶基因固定在一塊芯片上，對來源于不同個體、

11、不同組織、不同細胞周期、不同發育階段、不同分化階段、不同病變、不同刺激（包括不同誘導不同治療手段）下細胞內的mRNA或逆轉錄所得的cDNA進行檢測，從而對這些基因表達的個體特異性、組織特異性、發育階段特異性、分化階段特異性進行綜合評定與判斷，極大加快這些基因功能的確立。（四）、基因芯片技術的特點高通量、微型化： 基因芯片技術的特點的核心是微型化。芯片每平方厘米固體表面上可固定十萬個 DNA 片段、數萬個基因。一次分析可得到數萬個基因的表達信息。微型化的另一方面是樣品用量與試劑用量的微量化，用納克級的 mRNA 、微升級的雜交液就能分析成 千上萬個基因的表達信息。平行化： 基因芯片技術可在同一張

12、芯片上同時對實驗組和對 照材料進行雜交分析，實現了平行化操作，避免了各種 誤差，提高了信息的重現性和準確性，使實驗結果具有 可比性。自動化： 芯片制作及分析過程易于自動化。芯片設計制作可 實現自動化，可根據要求將需要分析的基因制作成符合 要求的芯片；雜交、洗片等過程都可實現自動化，工作 效率大幅提高。 （五）、 基因芯片的制作 必須要有代表所要分析基因的DNA樣品。1DNA 樣品的來源 （1）從細胞或組織中提取mRNA 后反轉錄成cDNA文庫，經測序及生物信息學分析得到代表各個基因的DNA序列，利用PCR擴增技術或DNA固相合成獲取所期望的各種基因片段；（2）利用基因組測序數據，經生物信息學分

13、析得到代表各個基因的序列數據，再利用PCR擴增技術或DNA固相合成技術獲取人們期望的各種基因片段。2生物芯片的制作 生物芯片微陣列的制作按照制作方法可分為兩大類，即原位合成和預合成后點樣。 接觸點樣法 噴墨法 光刻 DNA 合成法 （五）、 基因芯片的雜交及結果分析 1探針的標記 標記的方法通常是在反轉錄的底物中加入帶有標記基團的寡核苷酸單體，通過反轉錄將標記分子摻入 cDNA 分子中。 雙色熒光標記技術（Cy3,Cy5)是常用的標記技術. 2雜交 在一定的條件下，分子間氫鍵的斷裂與恢復是 DNA/DNA 、 DNA/RNA 分子間選擇性結合的根本動力，這一過程稱之為雜交。3芯片結果讀取與掃描

14、儀 生物芯片掃描儀：激光系統掃描儀（共聚焦/非共聚焦） 和CCD系統掃描儀 分次掃描，同時掃描， 4生物芯片的軟件系統與數據處理 偽色圖： Cy3,Cy5 若以紅色表示處理樣品，以綠色表示對照樣品，重疊變成黃色，如某一點（代表一個基因）呈紅色就表明該基因的表達上升，若某一點呈綠色就表明該基因的表達下降，表達量 。相等為黃色（六）、 基因芯片的應用 1基因表達分析；2基因型及多態性分析； 3雜交測序； 4核酸和蛋白質相互作用的研究；5疾病的診斷與治療；6藥物開發； 7在營養與食品衛生領域的應用； 8在環境科學領域中的應用。 五、RNAi技術1. 定義RNA干擾( RNA interference

15、, RNAi) ：是指在生物體 細胞內，由于外源或內源性雙鏈RNA的存在，誘導體內 同源mRNA高效特異性降解的現象。 不破壞或改變原來的目的基因，但可以降低目的基因的 表達。因此是一種序列特異性的轉錄后基因沉默( post transcriptional gene silencing, PTGS) 機制。2.RNAi的發現“ 共抑制( co- suppression)” 發生在轉錄后的RNA 水平1990年, Napoli CD 1995年，Guo S等試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C. elegans）中的par-1基因的表達。設計： 反義RNA 特異性地阻斷par-1基因的表達； 正義RNA

16、以期觀察到基因表達的增強。結果: 二者都同樣地切斷了par-1基因的表達途徑。這是與傳統上對反義RNA技術的解釋不相符合。該研究小組一直沒能給這個意外以合理解釋。 RNAi的提出uninjected, no probeuninjected, mex-3 probeantisense mex-3 RNA, mex-3 probe double-stranded mex-3 RNA injected, mex-3 probe1998年2月，Fire A和Mello C體外轉錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲，基因抑制效應變得十分微弱經過純化的雙鏈RNA能夠高效特異性阻斷相應基因的表達證實，Guo S

17、博士遇到的正義RNA抑制基因表達的現象，以及過去的反義RNA技術對基因表達的阻斷，都是由于體外轉錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。該小組將這一現象稱為RNA干擾（RNA interference，簡稱RNAi）。Zamore, P. D. Science 296, 1265-1269 (2002)dsRNA55RNA-induced silencing complex (active, 100kDa complex)small interfering RNAsMechanism of RNAi post-transcriptional gene silencing(inactive,

18、250-500kDa complex)(endonucleolytic cleavage in the region of homology)(a critical step in the activation of RISC)Zamore, P. D. Science 296, 1265-1269 (2002)RNAi 誘導特異性基因沉默的機制研究（1） dsRNA的降解，siRNA的形成 dsRNA 進入細胞內, 與一種核酸內切酶Dicer 結合, 并被酶切成19 23nt 的小干擾RNA( small interference RNA, siRNA) , （2 ）沉默復合物的形成 siRNA