1、PAGE PAGE 8權 利 要 求 書一種(y zhn)用于檢測(jin c)海水環境雌激素污染(wrn)的新技術，其特征在于它是以新型海水模式魚種海洋青鳉魚雄魚（Oryzias melastigma）為受試對象，采用生物學效應分析環境雌激素污染的污染程度。根據權利要求1所述的檢測技術，其特征在于采用同源克隆法，獲取了海洋青鳉魚卵黃蛋白原（VTG1）編碼基因序列片段。根據權利要求1所述的檢測技術，其特征在于根據克隆得到的VTG1編碼基因序列，設計VTG1熒光定量PCR引物（序列為：F: 5-TTGGCAGAGATGCAGCAGCGGT-3；R: 5-GGAAATGCAGGACACCCCAGT

2、AGCC-3）。內參基因18S熒光定量PCR引物（序列為：5-AACGCTGTGCTGCGTAGCCTCAATT-3； R: 5-AGAAGAAGCCCCACTTTTCCTCGCA-3）。根據權利要求1所述的檢測技術，其特征在于建立相對定量PCR法，分析環境樣品誘導魚卵黃蛋白原表達水平的差異。根據權利要求4所述的檢測技術，其特征在于對海洋青鳉魚進行環境樣品暴露，并設立陰性和陽性對照，進行系統控制，評估樣品的環境雌激素污染程度。說 明 書 摘 要本發明屬于環境檢測領域，涉及一種基于新型廣鹽性模式魚類卵黃蛋白原的水體環境雌激素污染檢測方法。選擇適應能力強的廣鹽性動物青鳉魚雄魚（Oryzias me

3、lastigma）作為活體模型。首先采用同源克隆法獲得卵黃蛋白原（vitellogenin, VTG）基因編碼序列片段，設計引物，采用實時定量PCR方法檢測VTG1的表達，并以18S核糖體RNA（18S）為內參基因，建立了VTG1轉錄水平的檢測體系。第二，對雄魚進行17-雌二醇暴露和干凈海水暴露，摸索合適的暴露時間，提取肝臟RNA，檢測VTG1的表達量，分別作為陽性和陰性對照。第三，采集水樣，進行暴露，分析VTG1的表達水平，從而分析水樣的環境雌激素污染程度。說 明 書 附 圖一種(y zhn)基于海洋(hiyng)青鳉卵黃蛋白原的水體(shu t)雌激素污染檢測方法A new method

4、for detection of environmental estrogen in water based on the vitellogenin 1 of marine medaka (oryzias melastigma)技術領域：本發明屬于環境檢測領域，涉及一種基于新型廣鹽性模式魚類卵黃蛋白原的水體環境雌激素污染檢測方法，可廣泛運用于濱海城市內湖，河流入海口，海水等區域的環境雌激素檢測。背景技術：目前，針對環境雌激素的污染問題主要采取的是化學檢測的方法，如液相色譜和質譜聯用法（HPLC-MS）等。這些方法的優點是靈敏度高，但這些方法所需的分析儀器價格昂貴，成本非常高，難以進行推廣和普及

5、。并且這些方法對樣品的要求較高。環境樣品與一般樣品不同，具有化合物種類繁多、含量低、樣品組成復雜、具有流動性和不穩定性等特點。當待測污染物濃度低于現有方法的檢出限或者樣品復雜，機體干擾嚴重的情況下，直接測定是不可能的。與化學方法相比，生物檢測可以避開成分檢測，直接分析環境雌激素對健康的危害程度。但目前的生物檢測法尚處于初始發展階段，極少有海洋小型模式動物運用生物學檢測。因而有必要開發基于海洋生物活體模型的檢測技術，從海水的綜合生物學和毒理學活性來直接評估海水污染的健康危害程度。我們選擇了新興模式生物海洋青鳉魚。海洋青鳉（Oryzias melastigma 或 Oryzias dancena）

6、，又名印度馬達卡（Indian medaka），黑點青鳉，原產于巴基斯坦、印度、緬甸和泰國沿海及淡水水域。在分類學上，海洋青鳉與日本青鳉同屬脊索動物門輻鰭魚綱顎針魚目怪頜鳉科青鳉屬。海洋青鳉魚作為近海海洋環境雌激素活體檢測模型具有以下優勢：1. 體型較小，耐受力較強，很容易在實驗室大規模飼養。2. 性別差異可通過魚鰭形態的不同而快速辨別，雌魚產卵量大，世代周期短，繁殖代數多。3. 對鹽度的適應范圍寬泛，可開發成有別于淡水斑馬魚模型的活體檢測模型，在各種鹽度的環境條件下進行推廣應用。魚類卵黃蛋白原特異性的產生于雌性動物肝臟中，正常條件下，雄魚或者幼魚體內很難檢測到表達，但在雌二醇及環境類雌激素暴

7、露下，雄性也會大量表達卵黃蛋白原。因而，雄魚卵黃蛋白原的誘導可以指示環境中雌激素污染（Sumpter, J.P. and Jobling, S. Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environ Health Perspect）。目前國內外已針對卵黃蛋白原開發出多種類雌激素檢測方法，但所選擇的魚類模型均為淡水魚類，包括鯉科和鱘科魚類（如專利公開號：CN101519650 和CN1763090）。通過查閱文獻（中國期刊網、中華人民共和國專利局專利檢索、Sci

8、enceDirect、 HYPERLINK /?DestApp=WOS t _blank ISI Web of Science、 HYPERLINK 0/cn/detail.asp?pid=3&sid=319 t _blank Springer Journal、NCBI，等），未見海洋模式魚類用于環境雌激素的檢測方面的專利報道。本研究選用廣鹽性海洋青鳉魚作為活體模型，建立了針對卵黃蛋白原的活體環境雌激素檢測技術，具有高度的創新性和實用性。發明(fmng)內容：本發明的目標(mbio)是提供(tgng)一種檢測海洋環境雌激素污染的檢測技術，并已運用于廈門內湖及周邊海域的環境雌激素污染檢測。本發明

9、本發明首次將新型海洋魚模式物種海洋青鳉魚（Oryzias melastigma）運用于海水環境雌激素污染檢測。方法上采用實時熒光定量PCR方法，檢測性成熟雄魚卵黃蛋白原（vitellogenin, VTG1）表達水平的變化情況，進而指示環境雌激素的污染。首先采用同源克隆法獲得卵黃蛋白原基因編碼序列片段，設計引物（序列為：F: 5-TTGGCAGAGATGCAGCAGCGGT-3；R: 5-GGAAATGCAGGACACCCCAGTAGCC-3采用SYBR實時定量PCR方法檢測VTG1的表達，并以18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA）為內參基因，建立了VTG1轉錄水平的檢測體系

10、，包括引物的設計，主要采用primer3.0和Oligo6.0設計引物，并對引物的特異性和擴增效率進行分析，最終優化獲得一對引物，序列如下：F: 5-AACGCTGTGCTGCGTAGCCTCAATT-3；R: 5-AGAAGAAGCCCCACTTTTCCTCGCA-3進一步優化PCR體系，最終確定為95 30秒預變性，95 5秒變性，60 20秒復性、延伸和收集熒光信號，40個循環。數據分析采用最大二階導數法分析，獲得Ct值，采用2Ct法進行相對定量分析。第二，對雄魚進行17-雌二醇 （100 ng/L）暴露和干凈海水暴露，提取肝臟RNA，檢測VTG1的表達量，分別作為陽性和陰性對照。第三，

11、采集水樣，進行三次平行暴露，分析VTG1的表達水平，與陽性和陰性對照組比較，從而分析水樣的環境雌激素污染程度。具體實施過程如下：樣品采集與預處理在所需檢測海域采集海水，采集表層下海水。采集的海水樣品過夜澄清，采用虹吸法獲得澄清海水，棄掉底部固體沉積物。暴露(bol)實驗選擇(xunz)3-4個月大的雄性海洋青鳉魚為暴露(bol)對象，設立陽性和陰性對照。采用MilliQ水人工配置35 鹽度的水樣為陰性對照用水，加入100 ng/L 17-雌二醇，為陽性對照用水。設置三個平行樣，每個平行樣包含3條隨機獲取的雄魚。采集樣品與對照同時暴露，暴露時間為8小時，暴露期間無需喂食和換水。魚暴露8小時后，撈

12、出小魚，用冰水浴處死魚，解剖，獲取肝臟組織，迅速收入-80 冰箱中保存。魚樣品處理采用Trizol法提取RNA，分光光度法鑒定RNA質量和檢測RNA 濃度，取1 g RNA，采用Takara公司反轉錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix（DRR036A）反轉錄成cDNA，20 l反應體系包含4 l 5 X PrimeScript RT Master Mix, 10-100 ng總RNA。程序為37 ，15 分鐘；85 ，5秒。反轉錄獲得第一鏈cDNA，用于下一步實驗。進行熒光定量PCR實驗。在實時熒光定量PCR儀LightCycler Roche480儀器上進行，采用Tak

13、ara公司熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM II (DRR081A)進行反應，20 l PCR體系組分如下表：試劑使用量（l）終濃度SYBR Premix Ex TaqTM II101X正向引物0.40.2 M反向引物0.40.2 McDNA模板1 100 ng無菌水8.2/程序兩步法，具體為 95 30秒預變性，95 5秒變性，60 20秒復性、延伸和收集熒光信號，40個循環。進行熔解曲線分析，確保只有目標產物擴增產生。采用最大二階導數法分析，獲得Ct值，采用2Ct法進行相對定量分析。以陰性對照組魚的卵黃蛋白原表達量為參比值，計算暴露于樣品的魚卵黃蛋白原相對于陰性對照組的表達量。陽性對照組用于確認體系的正常運行，并為樣品的環境雌激素污染程度提供定性認知。 本發明能有效運用于海水樣品的環境雌激素污染檢測，為日益嚴重的海洋環境雌激素污染提供監測和預警技術。實例(shl)：采集廈門周邊海域及內鹽水湖筼筜湖海水樣品，進行污染檢測(jin c)。所采海水樣品，包括筼筜湖、白城和輪渡碼頭(m tou)。各采集水樣的基本參數如下表所示。地點采樣深度（米）溫度（）PH值鹽度（）筼筜湖1206.020.2白城2206.024.4輪渡碼頭220622.3附圖1. 18S基因和VTG1基因定量PCR產物熔解曲線圖。附圖2. 環境樣品誘導海洋青鳉魚VTG1基因表達