1、 第五章 園藝植物制片方法 植物制片是進(jìn)行園藝植物科學(xué)研究所需用的一種基本方法，比如進(jìn)行植物各個(gè)器官的解剖構(gòu)造觀察、花芽分化研究、授粉受精觀察、貯藏營(yíng)養(yǎng)觀測(cè)以及染色體觀察等都需要進(jìn)行制片。通過對(duì)切片結(jié)果的分析，可以比較不同試驗(yàn)處理的效果以及了解不同樹種和品種相應(yīng)的生物學(xué)特性等。植物制片技術(shù)是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的體系，內(nèi)容繁多。在本章內(nèi)容中，將介紹在園藝植物科學(xué)研究中常用的一些基本方法和原理。 1 第一節(jié) 徒手制片 一、徒手制片（切片）及特點(diǎn) 徒手制片一般指徒手用刀片把新鮮的植物材料切成薄片的制片方法。 此制片法主要優(yōu)點(diǎn)是：（1）能及時(shí)觀察研究植物生活組織的結(jié)構(gòu)和天然色彩；（2）方法及用具簡(jiǎn)單，不需切

2、片機(jī)等機(jī)械設(shè)備，短時(shí)間即可完成。主要缺點(diǎn)是（1）對(duì)于微小、柔軟、水分過多以及堅(jiān)硬的材料，難以用徒手切成薄片；（2）對(duì)于操作不熟練者，往往切成厚薄不勻或不完整的切片。2二、徒手制片的方法及注意事項(xiàng) 徒手制片最主要的工具就是刀片，常可用單面保安刀片。要獲得良好的切片，首先要保持刀口的鋒利。切片方法及步驟為： （1）準(zhǔn)備工作（盛好清水的培養(yǎng)皿、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、刀片等用具）。 （2）拿取材料進(jìn)行切片，材料可以是新鮮的材料，也可以是經(jīng)過固定的材料（切片時(shí)，將欲切材料斷面和刀片上滴上清水以保持材料濕潤(rùn)）。3 （3）以左手拇指、食指、中指捏住材料，拇指應(yīng)低于食指，以免切傷手指；材料高出指尖。 （4）

3、右手執(zhí)刀，將刀平放在食指上，刀口朝內(nèi)，刀面與材料斷面平行，然后以均勻快捷的動(dòng)作自左前方向右后方以臂力帶動(dòng)刀片水平切割移動(dòng)，不要用腕力。同時(shí)還要注意，切時(shí)動(dòng)作要迅速，材料一次切下，切忌停頓或拉鋸式切割。 4（5）連續(xù)切數(shù)片后，將切下的薄片輕輕移入盛水的培養(yǎng)皿中備用。然后挑選薄而透明的切片，放在載玻片上的水滴中，加上蓋玻片制成臨時(shí)制片進(jìn)行觀察。 在試驗(yàn)中，有時(shí)因各種情況所取材料無法馬上進(jìn)行制片。可以將其保存在固定液中，常用的固定液為F.A.A固定液，它不但是優(yōu)良的固定液也是優(yōu)良的保存液 ，其配方為：5ml福爾馬林（甲醛）：5ml冰醋酸：50-70%的乙醇90ml。5 用徒手切片的材料不宜過大，一般

4、以表面不超過5-8mm 為宜。對(duì)于過于柔軟或微小的材料（如葉片、細(xì)小的根尖等）需要借助一些夾持物方可進(jìn)行切片，如果臨時(shí)制片需保存一段時(shí)間，（1）將材料封在水中，每隔20-30分鐘再加一滴水，此法可保持?jǐn)?shù)小時(shí)；（2）用10%-30%的甘油水溶液代替清水封片，并將制片放在鋪有濕濾紙的大培養(yǎng)皿中保存，或用石蠟或指甲油封邊保存，可保存1-2周或更長(zhǎng)時(shí)間。6 第二節(jié) 壓片及涂片 涂片和壓片是進(jìn)行植物染色體觀察研究常用的制片方法。 涂片是將新鮮的材料或者是經(jīng)過固定的材料于載片上，托涂成均勻一層，經(jīng)染色后蓋上蓋玻片鏡檢。 壓片是將處理后的材料于載片上分散后加蓋片，用拇指或鑷子輕輕擠壓蓋片，使組織分散成一片，

5、然后鏡檢。7 進(jìn)行染色體觀察時(shí)注意，若進(jìn)行染色體數(shù)目測(cè)定要求取樣個(gè)體數(shù)在5個(gè)以上，細(xì)胞總數(shù)在30個(gè)以上；若進(jìn)行染色體核型分析（組型分析)則要求取樣應(yīng)是來源于不同個(gè)體的5個(gè)細(xì)胞。 一、常規(guī)壓片法1.取材：于細(xì)胞分裂旺盛時(shí)期取樣。一般取根尖、莖尖。2.預(yù)處理：防止紡錘體的形成，使細(xì)胞分裂停止在中期階段；使染色體收縮變短，便于觀察統(tǒng)計(jì)。常用藥劑有秋水仙堿溶液、8-羥基喹啉、對(duì)二氯苯飽和水溶液、富民隆。預(yù)處理的時(shí)間一般為2-12小時(shí)。8 3. 固定：把細(xì)胞迅速殺死，使蛋白質(zhì)變性沉淀，盡量保持材料結(jié)構(gòu)的原有狀態(tài)，以備進(jìn)一步處理。 常用的固定液為卡諾固定液，即3：1的純酒精:冰醋酸溶液。固定時(shí)間一般為1-

6、24小時(shí)。 4.解離：根尖、莖尖等體細(xì)胞組織，需經(jīng)過某些處理，除去細(xì)胞之間的果膠層并使細(xì)胞軟化，這種細(xì)胞分離和軟化后的組織才便于壓片。最常用的是酸水解和酶處理兩種。9染色：常可用孚爾根染色法或醋酸洋紅等核染色劑進(jìn)行染色。壓片：將材料移至載玻片上，蓋上蓋玻片，用解剖針或用鉛筆的橡皮頭在蓋玻片上輕輕敲擊，使細(xì)胞分散，再用拇指輕擠壓蓋片使組織成為一薄層。鏡檢：將壓片置于顯微鏡下觀察，選擇染色體分散、清晰的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記數(shù)，并可照相繪圖，以便進(jìn)行核型分析。同時(shí)可用記號(hào)筆在載玻片和蓋玻片上分別做記號(hào)，以便再次觀察和照相。10封固：好的壓片，可采用冷凍干燥后，用光學(xué)樹膠封固保存。也可進(jìn)行脫水透明等步驟制成

7、永久切片。若臨時(shí)保存，可以用石蠟封邊，放于培養(yǎng)皿中于冰箱冷凍室內(nèi)短期保存。 二、去壁低滲法（涂片法）1.取材：同上述常規(guī)壓片法。2.預(yù)處理（前處理）：同上述常規(guī)壓片法。3.前低滲：將處理后的材料防災(zāi)0.075M KCl低滲液中，在20-25條件下處理30分鐘左右.1112具B染色體的黑麥基因組核型134去壁：倒去KCl溶液，加入2.5%混合酶液（纖維素酶與果膠酶各占2.5%），在溫度25-30下處理2-5小時(shí)左右。酶液與材料的比例適當(dāng)，酶液不能過少。5. 后低滲：倒去酶液，用蒸餾水沖洗2-3次，然后在蒸餾水中停留5-10分鐘左右后進(jìn)行后低滲。6. 固定：用甲醇:冰醋酸（3:1）固定液固定。7.

8、 涂片：將去壁固定的材料放在載玻片上，加一滴固定液，然后用鑷子將材料夾碎，去掉大塊殘?jiān)缓髲妮d玻片一側(cè)向材料輕輕吹氣，使組織分散成一薄層。148. 火焰干燥：將載片于酒精燈上微微加熱烤干。9染色：用40:1的Giemsa染液染色4-30分鐘或更長(zhǎng)，蒸餾水清洗，空氣干燥后可用樹膠封片。10. 鏡檢：于顯微鏡下觀察。 第三節(jié) 石蠟制片 石蠟切片是光學(xué)顯微鏡的制片技術(shù)中最常用的一種方法，屬于永久制片。一般的植物材料都可以用此法制片。但有制作時(shí)間較長(zhǎng)，操作過程復(fù)雜以及材料易發(fā)硬或發(fā)脆等缺點(diǎn)。 15 操作程序如下： 1. 材料的采集與分割：根據(jù)制片的目的和要求采集材料，材料要有代表性。材料采后應(yīng)盡快進(jìn)

9、行分割固定。為使固定液能迅速的滲透材料，要進(jìn)行材料分割。分割塊宜小不宜大，一般不超過1cm3，分割后立即殺死固定。2. 殺死與固定：利用藥劑迅速把細(xì)胞殺死，以保持材料本來的狀態(tài)和結(jié)構(gòu)。常用的固定液有F.A.A固定液、卡諾固定液等，前者還可作保存液。 163.脫水：除去組織中的水分，便于透明、浸蠟、包埋等步驟的進(jìn)行。常用的脫水劑為酒精。脫水采用等級(jí)脫水（系列脫水），即從較低濃度酒精開始，逐漸替換到高濃度酒精。4.透明：將脫水劑從材料中除去，使材料透明，增加折光系數(shù)；便于下步的浸蠟和包埋等程序。透明劑是一種既能與脫水劑混合，又能與包埋劑混合的藥劑。常用的透明劑為二甲苯和氯仿，適用原則也是逐級(jí)進(jìn)行，

10、可減少材料收縮。 175.浸蠟：逐漸除去透明劑,并為包埋劑所代替。常用的包埋劑是石蠟。浸蠟過程是使石蠟慢慢溶于浸有材料的透明劑中，溶解在透明劑中的石蠟漸漸深入到材料的細(xì)胞中去，最后使透明劑完全被石蠟取代，以便切片。6.包埋：將浸蠟后的材料包埋在石蠟中。此步驟要迅速，且不要使石蠟塊中有氣泡。注意將樣品編號(hào)封于蠟塊上，以免樣品混淆，以備切片。187.修塊和切片：將已包埋好的蠟塊切成小塊，每一小塊包含一塊材料。然后按照所需的切面，進(jìn)行修整。把蠟塊粘接在載蠟器上，用切片機(jī)將蠟塊切成連續(xù)的蠟帶。8.粘片：將切下來的切片粘在潔凈的載玻片上。粘片時(shí)先在載玻片上滴上一小滴粘片劑，加幾滴蒸餾水，然后用鑷子小心把

11、切片放在水上，在35-40下，用撥針將切片伸直、展平，傾斜載片，使水流去并烘干。9.脫蠟、染色、脫水透明和封片：粘片后要經(jīng)過脫蠟、染色、再次脫水透明，然后封片永久保存。192021 脫蠟、染色和脫水透明的過程仍采用等級(jí)法逐漸進(jìn)行。最后加拿大樹膠封片，然后貼標(biāo)簽鏡檢及保存。 以上是石蠟制片的一般步驟；為了獲得良好的制片效果，需要制片者的大量實(shí)踐并在實(shí)踐中不斷摸索、積累經(jīng)驗(yàn)方可。22亮葉忍冬葉片解剖構(gòu)造23韭菜根橫切面24女貞莖橫切面（皮孔）25南瓜莖橫切面局部26第四節(jié) 電鏡制片 電子顯微鏡（簡(jiǎn)稱電鏡）大體上分兩類，一是掃描電鏡，二是透射電鏡。掃描電鏡能直接觀察到樣品表面的三維立體結(jié)構(gòu)，如植物的

12、花、葉、果實(shí)的表面結(jié)構(gòu)等；投射電鏡可觀察到植物組織的超微結(jié)構(gòu)，如葉綠體的膜結(jié)構(gòu)韌皮部疏導(dǎo)組織結(jié)構(gòu)等等。它們的制片方法有很大不同。27一、掃描電鏡常規(guī)制片方法（一）取材 基本要求是 ：動(dòng)作應(yīng)迅速、部位要準(zhǔn)確 ；刀片要鋒利；尺寸不宜過大 ；采取易分散的材料，要注意防塵、樣品分散；數(shù)量必需取夠。 （二） 清洗 共清洗3次。 清洗掉樣品表面雜質(zhì)等附著物； 除掉沒有和樣品成分發(fā)生反應(yīng)的固定劑。常用的清洗液有蒸餾水、生理鹽水、各種緩沖液以及含酶的清洗液，可依具體情況選擇 。28（三）固定 目的是 盡量完善的穩(wěn)定和保存樣品細(xì)胞內(nèi)的各種成分和結(jié)構(gòu)，使其接近生活時(shí)的狀態(tài)。 常用的方法是戊二醛四氧化鋨雙固定法。先

13、用1-3%的戊二醛/緩沖液固定數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)，再用1%鋨酸/緩沖液在4下固定30-60min。 （四）脫水和置換 采用系列乙醇或丙酮逐級(jí)脫水，一般為： 30%50%70%80%95%100%，每步15-20min。 （五）干燥 是制片關(guān)鍵一步。目的是去除樣品中的游離水或已取代游離水的脫水劑，使樣品中不含有液態(tài)物質(zhì) 。臨界點(diǎn)干燥法是目前公認(rèn)的較好方法。 29（六）粘樣 將干燥好的樣品用導(dǎo)電膠將樣品粘在樣品臺(tái)上，并做好標(biāo)記。常用的有銀粉導(dǎo)電膠、石墨粉導(dǎo)電膠、雙面膠帶、普通膠水等。（七）鍍膜（噴涂） 是把粘貼到樣品臺(tái)上的樣品和樣品臺(tái)表面同時(shí)噴涂上一層金屬膜，使樣品具有良好的導(dǎo)電性，以便下一步觀察。一

14、般噴涂10-20nm厚的金屬膜，常用的金屬有金、銅、鋁、金-鈀。30（八）觀察 噴好的樣品就可以用掃描電鏡進(jìn)行觀察了（一般20kv）。如果一時(shí)不能觀察，需把樣品放入干燥器中保存，以防受潮或被污染。OK！31掃描電子顯微鏡32蘋果花粉粒33蜀葵花粉粒34一串紅花粉粒35二、透射電鏡制片基本方法（超薄切片）（一）取樣 要求取樣要有代表性、迅速、準(zhǔn)確、及時(shí)、體積小、低溫、防損傷。一般要求體積0.5-1.0mm2。（二）固定 目的是要在分子水平上真實(shí)的保存細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的每一細(xì)節(jié)。常用的方法是化學(xué)固定法，目前大部分植物材料采用的固定方法是戊二醛鋨酸雙固定法，即先用戊二醛作預(yù)固定，然后用鋨酸作后固定。對(duì)于

15、一般植物葉、幼莖、幼根可用3%的戊二醛固定2小時(shí)，用1-2%四氧化鋨固定2-3小時(shí)。 36（三）脫水 常用的脫水方法是逐級(jí)脫水，即采用的脫水劑濃度梯度為30%50%70%80%90%95%100%（100% 濃度中換3次），常用的脫水劑為乙醇或丙酮。每一級(jí)脫水劑中停留時(shí)間為10-20min，脫水劑用量一般為樣品體積的10倍以上。（四）滲透與包埋 將脫完水的組織先后經(jīng)過脫水劑和環(huán)氧樹脂滲透液（是常用的包埋劑，目前常用的型號(hào)為Epon812），比例分別為3：11：11：3，每步30-60min。將滲透好的樣品塊放到適當(dāng)模具中，灌上包埋液包埋，經(jīng)過加溫聚合形成一種固體基質(zhì)（也叫包埋塊），已備切片。3

16、7（六）超薄切片 標(biāo)準(zhǔn)的超薄切片應(yīng)該是厚度適中、均勻、平整、無刀痕、無顫紋和皺褶。基本步驟為：準(zhǔn)備切片刀和銅網(wǎng)修整包埋塊切片撈片。 銅網(wǎng)準(zhǔn)備：超薄切片要放在載網(wǎng)上才能進(jìn)行染色等操作，并最終放到電鏡中觀察。載網(wǎng)是用無磁性金屬材料做成的，厚50微米，直徑一般為3mm，一般用銅材料，所以又叫銅網(wǎng)。銅網(wǎng)要經(jīng)過清洗，方可使用。目前清洗方法主要有：超聲波清洗法、酸堿清洗法。 支持膜的準(zhǔn)備：銅網(wǎng)的網(wǎng)孔很小，但對(duì)于放置超薄切片及其他樣品來說，網(wǎng)孔還嫌大，不足以平坦地支持切片，所以要在銅網(wǎng)上覆一層透明的膜支持膜。 38 切片刀準(zhǔn)備：超薄切片刀有兩種，一是金剛刀，二是玻璃刀。前者價(jià)格昂貴、質(zhì)地堅(jiān)硬、經(jīng)久耐用；后者制作方便、價(jià)格低廉、但刀刃較脆、不耐用、不能切硬質(zhì)材料。制刀用玻璃為硬質(zhì)玻璃，含硅量72-75%以上。 切片：是用超薄切片機(jī)切出50nm后左右的超薄切片，以供觀察。 展片與撈片：切下的超薄切片漂浮在刀槽液面上，需要將它撈至于銅網(wǎng)上，才能染色和電鏡觀察。由于切片很薄，在切片過程中易皺褶，使樣品結(jié)構(gòu)重疊，因此在撈片前需進(jìn)行展片。撈片后，用濾紙吸去多余水分，然后將載網(wǎng)放入樣品盒，至于干燥器中保存，待染色。 39（七）切片染色（電子染色） 要進(jìn)行電子染色后才利于電