1、免疫親和純化以及免疫沉淀技術親和層析及沉淀的用途親和層析及沉淀被認為是分離純化酶及蛋白質的強有力的技術手段，這種方法可以較經濟有效地使用配基，能夠大規模、快速、特異性地分離、純化酶及蛋白質。 蛋白質的功能蛋白質（酶）存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子。蛋白質是生物功能的執行者，擔負著生物催化、物質運輸、運動、防御、調控及記憶、識別等多種生理功能。蛋白質分離純化蛋白質分離純化是用生物工程下游技術從混合物之中分離純化出所需要得到的目的蛋白質的方法。蛋白質分離純化技術是當代生物產業和生命科學研究當中的核心技術。該技術難度和成本均高；例如一個生物藥品的成本75%都花在下游蛋白質分離純化當中。

2、生物工程上游技術:是理論的研究, 技術的開發等, 如：基因工程、蛋白質結構和功能研究等。 生物工程下游技術：一般包括產物（一般為蛋白質）的預處理及分離純化；產品的成型加工和質量監控等一系列單元操作和過程中的主要技術,其中生化產物及發酵產物的分離純化是其核心內容。下游技術是生物工程重要組成部分,是生物高科技技術實現產業化的關鍵，如：酶工程 , 發酵工程等（提取干擾素、胰島素和酶等）。 蛋白質分離純化的意義從生物材料中分離制備蛋白質，研究其結構與功能，對于了解生命活動的規律，闡明生命現象的本質有重大意義。工業生產的需要：食品、發酵、紡織、制革等工業，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、

3、麥芽糖、糊精以及糖漿等。 醫療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。 基因工程的需要：DNA合成酶、RNA逆轉錄酶等。蛋白純化策略 分離蛋白質常用的純化方法有超速離心和梯度密度離心法、鹽析法、電泳、凝膠過濾（分子篩）、離子交換層析、親和層析以及高效液相色譜等方法 。親和沉析技術是純化各種生物大分子最有效的方法之一。 超速離心 是分離亞細胞及蛋白質大分子的有效手段，往往是進一步純化的第一次過篩。超速離心又分差速離心和梯度離心。用超速離心或梯度離心分離和純化抗原只是一種根據蛋白的比重特點分離的方法，除個別成分外，極難將某一抗原成分分離出來。目前僅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白等，以

4、及一些比重較輕的抗原蛋白如載脂蛋白A、B等。對于大量的中、小分子量蛋白質，多不適宜用超速及梯度密度離心作為純化手段。 鹽析沉淀法 是最古老而又經典的蛋白質純化分離技術。由于方法簡便、有效、不損害蛋白抗原活性等優點，至今仍被廣泛應用。 鹽析法原理鹽析沉淀法的原理 因為蛋白質是親水性大分子，所以在水溶液中有雙電層結構的水合膜，來保證分子的溶解度平衡并穩定存在。 當加入鹽時，鹽會電離成離子態，離子的電性破壞了蛋白質的雙電層的水合膜結構，從而使其沉降，析出。 加入濃酸和濃堿是不行的，苛性的環境將使蛋白質變性。 凝膠過濾和離子交換層析 凝膠過濾又稱凝膠柱層析、分子篩層析，利用微孔凝膠，將不同分子量的成分

5、分離。離子交換層析是利用一些帶離子基團的纖維素或凝膠，吸附帶相反電荷的蛋白質，將蛋白質按帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。這兩種層析如能共同應用或者反復應用其中的一種，皆可將某一蛋白質從一復雜的組分中純化出來。 凝膠過濾(分子篩層析)圖示1凝膠過濾(分子篩層析)圖示2 離子交換層析柱親和層析 是利用生物大分子的生物學特異性，即生物分子間所具有的專一性親和力而設計的層析技術。 例如抗原和抗體（免疫親和層析）、 酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體等之間有一種特殊的親和力，在一定條件下，它們能緊密地結合成復合物。如果將復合物的一方固定在不溶性載體或共價結合在一種惰性的微珠上，則可從溶

6、液中專一地分離和提純另一方。與上述其他純化方法相比，親和層析能產生相當高的純化作用。另外，此法的優點是迅速，有時僅一步即可達到純化的目的。 免疫親和純化技術 親和純化(affinity purification)是基于目標分子與固定化配體的特異性相互作用(如：抗原-抗體)。親和技術可用來從混和物中分離特定分子。捕獲目標分子用于相互作用研究, 或從反應體系中去除某一成分。免疫親和純化原理免疫親和純化是一種分離各種生物大分子最有效的方法特點：1、高純化率，通常為常規純化的1,000-10,000倍以上。2、由于內在的背景限制，如目標抗原量非常稀少，需與其他方法結 合才能獲得均質性產物。3、快速純化

7、抗原，層析柱?？芍貜褪褂?。可按照不同規模進行，半 天內即可完成。4、不僅適用于純化抗原，也可用來分離經過初步純化的抗體，乃至 所有能與相應配體有效結合的生物分子。5、抗體與其相應抗原結合具有高度親和力和特異性，能大量分離天 然狀態或近似天然狀態的抗原。6、需要適當純化的抗體，不是所有的抗體都適用于免疫親和層析， 但一旦獲得一種性能良好的抗體，純化過程就簡單、快速、可靠 。 7、不能用于定量測定。 免疫親和純化技術發展歷史：最早是將抗體作為一種結合劑用于免疫親和純化，根據其自身交聯產生大量多聚體和不溶性基質原理收集抗原。隨后利用抗體與惰性微珠共價結合，雖然這是一種簡單的結合，但抗體的許多反應性因

8、缺乏定位作用或抗體的過量結合而喪失。通過研究發現，抗體與蛋白A和蛋白G微珠共價連接后更容易與抗原結合。將具有良好抗原結合特性且來源廣泛的各種單克隆抗體制成免疫親和層析柱，已成為一種最適用和有效的純化方法。親和層析技術最先是由Cuatrecasas等人建立（1968年）。 影響免疫親和層析純化效果的因素抗原初始相對濃度（即純度）：是決定最終產物純度極為重要的因素?？乖c抗體的親和力：是免疫親和純化層析過程中最麻煩的問題。高親和力抗體（10-8 mol/L)能在1 h以內達到有效的分離，而低親和力的抗體(10-6 mol/L）即使在高濃度時也不能結合溶液中的全部抗原。使用針對同一抗原多個表位的多克

9、隆抗體以增強親和力的方法固然可結合較多的抗原，但增加了洗脫的困難性。只有當所需的最終產物為變性蛋白時，才選用識別多個表位的抗體。免疫親和純化的關鍵：高親和力與容易洗脫的優化組合。常見錯誤是將低親和力和容易洗脫等同看待。1親和層析支持物的選擇:作為親和層析支持物須符合以下要求：非特異性吸附低；液體通過時流速要快；在各種pH和高濃度鹽溶液中穩定；必須有合適的、豐富的化學基團，能有效地與蛋白質或其它化合物結合；必須帶有豐富的微孔，以增加結合容量。符合以上5個條件的支持物有瓊脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用的是瓊脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。 2配體的選擇:所謂配體系指具有親和性

10、的雙方，作為免疫親和層析專指抗原與抗體。良好的配體必須具備以下3個條件。（1）抗原或抗體必須單一特異性：抗原或抗體的純化效果決定于固相中配體的純度。（2）抗原與抗體之間必須有強的親和力：這種親和力決定于抗原決定簇的性質和數量。對抗體來說還決定于抗體來源動物的種類和免疫時間，如馬抗血清親和力較低，免疫血清親和力較高；免疫時間短的親和力低。但是，親和力太強也不利，因為解離抗原抗體復合物所需要的條件就要強烈，從而可造成蛋白質的變性。例如用低pH（1.52.5）或高鹽（如6 mol/L鹽酸胍）可使部分抗原或抗體活性降低或喪失。（3）配體必須有一個適當的化學基團：這個基團不參與配體和大分子的特異結合，但

11、可用來連接支持物，而且這種連接不應當影響配體與大分子結合的親和性。3抗原或抗體與支持物的結合將抗原或抗體結合到支持物上的方法目前有20多種，但可歸結為載體結合法、物理吸附法、交聯法和網絡法4類。 結合法的一般步驟是先活化支持物上的功能基團，然后將抗原或抗體連接到這些活化的基團上。用來發生交聯的化學反應必須足夠溫和，不致使抗原或抗體遭到破壞。交聯后，要徹底清洗支持物，以除去剩下的未交聯的物質。 最常用的支持物是Separose 4B，將此支持物與溴化氰在pH11時進行處理，則能使支持物活化。此時溴化氰與支持物上的羥式反應形成氨基甲酸酯基團。加入溴化氰的量取決于支持物的量。如果希望取代程度提高，則

12、加入溴化氰的量也要提高。交聯時首先要注意加入抗原或抗體的濃度。通常在交聯反應混合物中的交聯蛋白質濃度應是親和分離濃度的2030倍。這樣，溴化氰濃度也必須提高到 200 mg/ml凝膠。若希望最終產物含量較少，所加入的溴化氰也應減少。交聯時的pH也應注意，pH9.510時，活化的瓊脂糖珠很不穩定。降低pH，也就減少了能反應的配體濃度，交聯量就會減少。 親和層析中常用小分子抗原或其它化合物與支持物交聯，由于載體空間的位阻而影響了與抗原或其它親和物的結合，產生了所謂的無效吸附。另外，Sepharose 4B交聯時要求有一游離的氨基，如果該抗原有具氨基則難于交聯?；谶@兩個原因，通常在瓊脂糖與抗原之間

13、接上不同長度的“手臂”。必要時這些“手臂”末端可接上游離氨基，以與不帶氨基的配基偶聯。常用的帶“手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖（二亞胺）、羧基瓊脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰瓊脂糖（0-溴乙酰-N羧基琥珀酰胺）、重氮鹽衍生物瓊脂糖和疏基瓊脂糖等。這些帶“手臂”的瓊脂糖有商品供應，使用極為方便。 親和純化的多克隆抗體 單克隆抗體信號強度(抗體結合容量） 非常好 視抗體而異，但應該非常好特異性 非常好 非常好優點 洗脫峰形易分辨（已知）， 應用不受限制，特異性強 特異性強缺點 制備困難，應用受限 需要篩選合適的抗體 注：不推薦將未經純化的多克隆抗體或混合的單克隆抗體用于免疫親和純化。 免疫親和純化層析的基本操

14、作步驟：交聯結合洗脫1、將抗體與基質（微珠）共價交聯并制備抗體親和層析柱。2、將抗原結合到抗體-基質微珠上。3、抗原的洗脫。 親和層析條件的選擇：（1）支持物與抗原或抗體結合后，還可能有多余的活性基團， 為了封閉這些殘基團，必須用無關蛋白質或三乙醇胺過一次柱，以封閉活性基團。（2）去掉未結合及結合不牢固的蛋白質。 先用0.2 mol/L NaHCO2（含0.1 mol/L NaC1，pH 9.0）洗脫23個柱體積，再用解脫劑處理一次親和層析柱。（3）解脫劑有多種：常用的有0.2 mol/L pH 2.8 甘氨酸HC1甘氨酸緩沖液、7 mol/L脲、5 mol/L NaI、3 mol/L硫氰酸鉀

15、（或鈉）、1 mol/L乙酸、6 mol/L鹽酸胍、0.2 mol/L KC1等。作為抗原抗體解脫劑，最多用的是3 mol/L硫氰酸鉀（或鈉）及0.1 甘氨酸緩沖液?？贵w親和層析柱的制備：抗體與固相基質的連接：1、最常用的基質為蛋白A和蛋白G微珠， 可與抗體的Fc功能區特異結合。2、將抗體直接與一種活性微珠（表達活 性的反應基團）連接。 抗體與微珠的結合方法試劑 優點 缺點 與抗體結合的基團蛋白A 抗體定向確切， 粒柱還能與其他無關 二甲基庚二酸酯 -NH2 容易結合 的抗體結合，昂貴 蛋白G 抗體定向確切， 粒柱還能與其他無關 二甲基庚二酸酯 -NH2 容易結合 的抗體結合，昂貴 活性微珠

16、價廉，不結合 抗體無定向性，且常 羰基二咪唑 -NH2 其他無關抗體 因過量結合而損傷 溴化氰 -NH2 羥基丁二酰亞胺 -NH2 碘乙?；?-NH2 氯化tresyl -NH2,-SH從免疫親和層析柱上洗脫抗原：理想的洗脫峰形為一清晰的尖峰，用單一的緩沖液處理后可使抗原完全釋放。探索最佳的洗脫條件是一項積累經驗的工作。有三種方法： 1、用較強烈的條件處理; 2、加入模擬結合位點的飽和量小分子化合物; 3、使用一種能引起構象改變而使抗原釋出的 試劑。 洗滌液和洗脫液的選擇免疫沉淀技術是利用抗體與相應抗原的高親和力特性作為檢出和結合溶液中靶分子的方法，通過將抗原聚集在惰性微珠上，可以簡單快速的將

17、抗原純化1000-10000倍。 免疫沉淀 (Immunoprecipitation)免疫沉淀的應用： 1、目標抗原的純化。 2、確定蛋白質相對分子質量。 3、測定蛋白質抗原半壽期。 4、蛋白質翻譯后修飾的測定。 5、研究蛋白質與蛋白質之間的相互作用。 6、蛋白質內在或相關酶活性的測定。 7、裂解物特定抗原的清除。免疫沉淀的特點：1、確定抗原的存在、質量、大小、轉換、修飾及相關性；2、多個步驟共需1/2-1天；3、半定量到定量；4、敏感性取決于抗原的相對質量及抗體的親和力；5、需要高親和力的抗體。 免疫沉淀的主要影響因素：1、抗原原液的豐度2、抗體對抗原的親和力 合適抗體的選擇 多克隆抗體 單

18、克隆抗體 混合單克隆抗體反應強度 極好 極差到極好 極好特異性 良好 極好 極好，存在交叉反應優點 穩定，多價反應 特異，供應不受限制 兼備缺點 本底不易清除 需對抗原有高親和力 供應不普遍免疫沉淀步驟：一、抗原溶液的制備二、裂解物非特異性本底的預處理三、免疫復合物的形成與純化 一、抗原溶液的制備1、裂解細胞： 細胞裂解過程中有多種蛋白酶釋放，會導致蛋白質的降解從而影響免疫沉淀，解決方法有兩種：低溫操作或加入蛋白酶抑制劑。 2、裂解液的選擇：裂解條件應盡量溫和，以保護抗體結合位點及避免蛋白的溶解，但裂解條件又應足夠劇烈，以保證抗原的定量釋放。對于去污劑的使用，非離子型優于離子型，低濃度優于高濃度，單離子優于混合型。免疫沉淀最常用的去污劑是NP40和RIPA，它們能釋放大部分可溶性的胞漿蛋白和核蛋白，而且不損傷染色體DNA。最好不要釋放DNA，因其影響溶液的粘著性。 3、裂解原則：在釋放盡可能多抗原、引起盡可能少蛋白變性的前提下，將可溶性抗原從基質顆粒中分離出來，并且要避免和消除大分子DNA進入溶液。 4、裂解方法：組織培養細胞的裂解：最普遍的問題是抗原不能完全從細胞中釋放。一般不推薦凍融法，因反復凍融會使蛋白質過量降解，原因不明。機械性剪切（使用超聲波發生器、Dounce勻漿器、波特器和攪拌器等）特別