1、 報告人：單吉浩SPE技術在畜禽產品殘留分析中的運用.食品與農產品：殘留分析要求高選擇性降低或消除基質干擾高靈敏度痕量物質可靠的結果：定量準確度和化合物確認重現性，穩定性和動態范圍樣品基質中低濃度目的物質的準確定量按照法規要求進展確認方法穩定性復雜樣品基質，減少樣品凈化操作.殘留分析:樣品前處置的重要性 是影響實驗成敗的決議性步驟 占樣品分析時間的比例最大(70-80%) 樣品預處置所用時間遠多于色譜分別的時間 占分析耗費總本錢的比重最大 耗費大量的溶劑及其它化學品 對分析結果的重現性及準確性影響最大的環節 影響實驗結果好壞的最重要要素(回收率,%RSD.樣品前處置的通用方法 高速離心取上清液

2、 過濾、超濾 選擇性沉淀 衍生反響 液-液萃取 固相提取(Solid Phase Extract, SPE).為什么要用SPE? 樣品濃縮 提高靈敏度 樣品凈化 提高靈敏度 延伸系統不延續開機時間 延伸色譜柱壽命 比液液萃取更快,節省溶劑 可自動化批量處置 重現性好 .不斷革新的SPE技術 1977 率先推出業界第一個硅膠基質固相提取技術的商品化產品：Sep-Pak 1996 推出第一個水浸潤性聚合物基質SPE吸附劑(OasisHLB) 快速通用性反相SPE方法學 1997 用于OasisHLB的先進的新型方法學，可以獲得更干凈的本底(2D 優化方法學) 1999 推出混合機理吸附劑(Oasi

3、sMCX 和MAX)，從而可以對堿性和酸性化合物進展高選擇性和高靈敏度的提取 Oasis96 孔提取板設計獲得R&D 100 大獎.不斷革新的SPE技術2002 Waters 最新革新SPE技術 初次使得洗脫體積低至25 L 無需揮發與重現配制，洗脫后直接進樣即可 是小體積樣品的理想提取工具 靈敏度可以提高25x 2004 推出用于保管強堿(如季銨鹽)和強酸(如磺酸鹽)的WCX和 WAX 吸附劑.SPE小柱的種類 根據吸附劑的劃分 正相 Silica /Alumina(A, B , N) / Florisil/ NH2/ CN反相 C18/tC18/C8/tC2/Porapak/RDX/NH2

4、/CN離子交換 SCX、MCX、PCX、WCX、MAX.傳統(C18)SPE吸附劑的問題對極性化合物保管缺乏 藥物農藥及代謝產物難以同時提取對堿性化合物回收缺乏強硅羥基相互作用 堿性樣品回收率低小柱跑干不吸附 操作過程需仔細控制回收率低，重現性差是其主問題。.理想的樣品處置方法除去干擾物 在很寬的極性范圍內，對酸性、堿性及中性化合物均有可重現的高回收率 很容易實現自動化，對大量樣品進展高通量處置 容易運用并且耐受性好 快速并且最終的本錢低.PEP (Polymer enhanced polymer) ：極性提高了的共聚物具有反相SPE的最正確性質pH：0-14，810m2/g親水性單體：親水

5、使填料具有水可浸潤性質 允許溶劑跑干而不會損失回收率和重現性“親脂 提供對分析物的反相保管才干.C18與PEP小柱相比： 溶劑跑干對回收率的影響(普魯卡因胺、 醋氨酚、 雷尼替 丁、 心得安、 多慮平).C18與PEP小柱相比： 溶劑跑干對回收率的影響.PEP可取代C18 的優勢吸附容量更大 是C18的3到10倍，常用規格1mL/30mgC18：100mg操作更簡便 小柱干涸不影響回收率方法更通用 適宜性質各異的各種物質的提取.PEP可取代C18 的優勢開發方法更容易 聚合物基質，無硅醇基影響對極性物質的提取回收率更高 藥物(農藥)及代謝產物同時提高.樣品前處置： 適于HPLC分析的通用SPE

6、方法此通用方法適于多種樣品基質的絕大多數被測物。 當分析堿性化合物時，不要運用高有機含量的水溶液進展清洗，由于PEP吸附劑中不含硅醇基。 首先運用通用方法提取。假設需進一步降低干擾，可運用優化方法.樣品前處置： 適于HPLC分析的通用SPE方法.pH 與化合物反相保管.血清中的四環素.血清中四環素的提取結果比較 SPE 化合物 %回收率 %RSDPEP 二甲胺四環素 94.8 1.4 四環素 104 0.55C18 二甲胺四環素 52.8 2.82 四環素 68.4 2.44 6次實驗結果：加標程度：2.5g/mL .四環素類殘留分析 日本政府食品平安公告2003年月宣布有關來自中國的蝦中的四

7、環素類藥物監測Tetracycline in the shrimp from China假設為養殖蝦，政府要求必需監測四環素類藥物殘留(mandatory)假設為非養殖蝦，政府引薦監測殘留(voluntary)需HPLC、熒光檢測器法規更新：蔬菜和蜂蜜加工的食品必需監測殘留法規以前不要求檢測農藥殘留，但因在加工食品和蜂蜜中發現了許多農藥，故如今要求檢測.食用肉中的四環素 .牛奶中的四環素 .四環素食品分析的結果 化合物 牛肉 豬肉 牛奶 牛奶 0.5 g/ g 0.5 g/ g 25 g/L 50 g/L4 土霉素 96.2 (5.7) 103 (5.0) 70.7 (3.5) 67.7 (5

8、.8)四環素 91.4 (5.5) 99.8 (6.1) 73.7 (7.3) 68.5 (5.1)金霉素 80.6 (6.8) 83.4 (6.1) 76.7 (2.9) 67.3 (1.8結果以% 回收率表示,括號內數字為% RSD .反相離子交換雙重機理吸附劑 MCX：陽離子交換反相吸附劑 用于堿性物質提取MAX：陰離子交換反相吸附劑 用于酸性物質提取WCX：弱陽離子交換反相吸附劑 用于強堿性物質 (如季銨鹽類)提取WAX：弱陰離子交換反相吸附劑 用于強酸性物質提取 .適宜于堿性藥物提取的MCX 小柱 .雙機理吸附劑：堿性化合物的保管 .混合機理:陽離子交換與反相的保管 .MCX SPE

9、 通用方法 .常見獸藥殘留的 SPE 引薦方法稱號 規格克侖特羅 MCX/SCX/PCX 沙丁胺醇 MCX/SCX/PCX 磺胺 C18/PEP/ Alumina B氯霉素 C18/PEP/Silica氟喹諾酮 PEP/C18硝基咪唑類藥物 PEP/C18己烯雌酚 PEP/C18四環素 PEP/C18萊克多巴胺 Alumina A/ MCX .SPE在殘留分析方面的勝利實例 硝基咪唑類藥物： J AOAC International, 2003, 86(3), 505-509 四環素: J chromatography A, 2003,987,227-233 動物組織中鹽酸克倫特羅的SPE與G

10、C/MS 分析液相色譜通訊，37，13-14.SPE在殘留分析方面的勝利實例萊克多巴胺： Analytica chim, 2003,483(1-2) P-145 氯霉素： 動物源食品中氯霉素的液相色譜-質譜測定,分析測試學報，2002，21增刊，185-186 磺胺： 動物組織中磺胺類藥物殘留量檢測方法-HPLC法.磺胺藥物樣品前處置SPE法 HLB 雞組織中磺胺類藥物殘留量檢驗方法高效液相色譜紫外檢測法 廣州出入境檢驗檢疫局食品檢驗處 B(堿性氧化鋁小柱) 羊肉組織中七種磺胺殘留的測定 35期，2002年 動物源食品中磺胺類藥物殘留的檢測方法高效液相色譜法 農業部號文 C18 高效液相色譜法

11、測定肉類奶粉中四種磺胺藥物殘留量的方法研討 15期，1990年 動物源食品中磺胺二甲嘧啶殘留檢測方法高效液相色譜法 農業部號文；.典型勝利開發：動物組織中磺胺藥物的殘留檢測方法HPLC法NY 5029-2001 農業部“無公害畜產品例行監測公用方法艾杰爾科技磺胺公用柱.動物源食品中磺胺類藥物殘留檢測方法高效液相色譜法 簡介 農業部畜禽產質量量監視檢驗測試中心.主要內容一、適用范圍 二、原理 三、試劑和資料四、儀器設備 五、檢驗步驟 .1、適用范圍 本方法用于測定動物可食性組織中磺胺間甲氧嘧啶SMM、磺胺二甲基嘧啶SM2、磺胺甲噁唑SMZ、磺胺二甲氧嘧啶SDM、磺胺喹噁啉SQ單個或混合物的殘留量

12、。 .2原理 組織經乙腈提取后，其上清液參與正己烷進展液液分配，取下層溶液參與正丙醇減壓枯燥，殘留物用乙腈溶解，過Sep-Pak堿性氧化鋁柱, 洗脫，枯燥后定容，用高效液相色譜儀進展檢測。 .3、試劑和資料 除特別注明外，所用試劑均為分析純；水為超純水。 3.1 磺胺類藥物規范品SMM、SDM、SM2、SMZ和SQ，Sigma公司，含量不少于98.9%3.2 甲醇 色譜純3.3 乙腈 色譜純3.4 正已烷 3.5 正丙醇 3.6 無水硫酸鈉 .3、試劑和資料3.7 堿性氧化鋁SPE柱6毫升，500毫克3.8 磺胺類藥物規范貯藏液1mg/mL 分別精細稱取上述磺胺類藥物規范品各50mg，甲醇溶解

13、并轉移到50mL容量瓶，定容，搖勻。置-20以下冰箱中保管,有效期3個月。3.9 磺胺類藥物規范任務液 取磺胺類藥物規范貯藏液用流動相稀釋成濃度為0.05,0.1,0.2,0.5,1.0，2.0g/mL的規范任務液。置2-8冰箱中保管，有效期1周。.4、儀器設備 4.1 高效液相色譜儀配紫外檢測器4.2 離心機4.13 固相萃取安裝配考克閥4.4 分析天平 精度0.0001g 4.5 天平 精度0.01g4.6 旋轉蒸發儀4.7 振蕩器4.8 勻漿機4.9 渦動混合器4.10 分液漏斗 50mL4.11 梨形瓶 100mL4.12 離心管 50mL4.13 微孔濾膜 0.45m.5 檢驗步驟

14、5.1 試料的制備5.1.1 取絞碎后的供試樣品,作為供試試料。5.1.2 取絞碎后的空白樣品,作為空白試料陰性對照。5.1.3 取絞碎后的空白樣品5g,添加5g/mL的任務液0.1mL，作為空白添加試料陽性對照。.5 檢驗步驟5.2提取和純化5.2.1 組織樣品5.00g5g無水硫酸鈉+ 25mL乙腈均質振蕩10min以3000r/min的速度離心5min反復兩次并兩次的上清液參與正己烷30mL振蕩10min離心5min取下層液體于100 mL梨形瓶中。.5 檢驗步驟5.2.1續 加正丙醇5mL，50下減壓枯燥至干，殘留物用95%乙腈3ml溶解，過氧化鋁B柱。用5mL乙腈-水95+5過柱，不

15、搜集，再用10mL 乙腈-水70+30洗脫。 洗脫液中參與5mL正丙醇，50下減壓枯燥至干，殘留物用2.0mL流動相溶解，溶液用濾膜過濾，作為試樣溶液，供高效液相色譜分析。.5 檢驗步驟5.3 色譜條件5.3.1 色譜柱：C18柱，2504.6mmi.d.，粒徑5m，或相當者；5.3.2 流動相：乙腈-甲醇-水-乙酸(2+2+9+0.2)；5.3.3 流速：1mLmin；5.3.4 檢測波長：270nm；5.3.5 進樣量：20L。.5 檢驗步驟5.5 測定法 5.5.1 取試樣溶液和0.05g/mL的對照溶液，作單點校準，以峰面積計算。對照溶液及試樣溶液中磺胺類藥物的呼應值均應在儀器檢測的線

16、性范圍之內，試樣溶液測定過程中應參插注入對照溶液，以便準確定量。5.5.2 試劑空白實驗除不加試料外，采用完全一樣的測定步驟進展平行操作。5.5.3 結果計算和表述按下式計算供試組織中磺胺類藥物的殘留量： Xi=(CSVA)/(ASm).5 檢驗步驟5.6 結果斷定5.6.1 線性范圍 在0.02g/mL1.0g/mL范圍調查線性，計算回歸方程，其相關系數0.995。5.6.2準確度本方法在100g/kg添加濃度程度上的回收率范圍為50%110%。5.6.3 允許相對偏向允許相對偏向26%。.SPE在鹽酸克侖特羅瘦肉精殘留檢測中的運用樣品前處置：SPE法參見：中華人民共和國農業部行業規范：飼料

17、中鹽酸克侖特羅的測定參見：中華人民共和國國家規范：動物組織中鹽酸克侖特羅的測定.SPE在鹽酸克侖特羅瘦肉精殘留檢測中的運用中華人民共和國農業行業規范NY /T 468 2005 動物組織中鹽酸克倫特羅的測定氣相色譜-質譜法NY/XQ 421-2003“動物尿液中鹽酸克倫特羅瘦肉精殘留的檢測 氣相色譜-質譜GC-MS方法 起草單位：農業部畜禽產質量量監視檢驗測試中心.動物組織中鹽酸克倫特羅的測定氣相色譜-質譜法 原理對樣品在堿化的條件下用乙酸乙酯提取，合并提取液后，利用鹽酸克倫特羅易溶于酸性溶液的特點，用稀鹽酸反萃取，萃取的樣液pH調至5.2后用SCX固相萃取小柱凈化，分別的藥物殘留經過雙三甲基

18、硅烷三氟乙酰胺BSTFA衍生后用帶有質量選擇檢測器的氣相色譜儀測定。.動物組織中鹽酸克倫特羅的測定氣相色譜-質譜法 提取 (50.05)g動物肝組織參與15mL乙酸乙酯參與3mL10.0%碳酸鈉溶液均質離心2min上層有機溶劑在殘渣中再次提取后并合參與5mL0.10mol/L的鹽酸離心2min反復萃取合并下層溶液2.5mol/L氫氧化鈉溶液調理pH至5.2。 .動物組織中鹽酸克倫特羅的測定氣相色譜-質譜法凈化 SCX小柱5mL 甲醇5 mL水5 mL 30 mmol/L鹽酸活化萃取液上樣5 mL水5 mL甲醇淋洗柱子抽干SCX小柱5 mL 4 %氨化甲醇溶液洗脫。衍生化 在50水浴氮氣吹干10

19、0L 甲苯100L BSTFA80衍生lh冷卻參與0.3mL甲苯氣相色譜-質譜分析。.動物組織中鹽酸克倫特羅的測定氣相色譜-質譜法GC/MS測定參數設定色譜柱：HP-5MS 5%苯基甲基聚硅氧烷，30m0.25mm內徑，0.25m膜厚；進樣口：220；進樣方式：不分流；進樣體積：1L；柱溫：70堅持0.6min, 以25/min升溫至200堅持6min，以25/min升溫至280堅持5min；載氣：氦氣，流速：0.9mL/min恒流；GC/MS 傳輸線溫度：280；溶劑延遲：8min；EM電壓：高于調諧電壓200V；離子源(EI)溫度：200；四極桿溫度：160；選擇離子監測:(m/z)86，

20、212，262，277 .動物尿液中鹽酸克倫特羅的測定氣相色譜-質譜法凈化 依次用甲醇5mL、水5mL和30mmol/L鹽酸5mL潤洗固相萃取小柱，將上述備用液過柱，依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，真空抽干，用4%氨化甲醇5mL洗脫SCX小柱，搜集洗脫液于具塞玻璃試管中，50下氮氣吹干。在樣液過柱和洗脫過程中流速控制在1mL/min左右。.殘留分析SPE前處置運用小結 以常規方法為起點 如需求，根據樣品性質與基質進展方法優化 對于堿性或酸性組分采用雙機理吸附劑 .SPE小柱的典型運用實例 磺胺：Sep-Pak Al2O3(B), 12cc/2g, WAT054260 動物源食品中磺胺類藥物殘留

21、物檢測方法HPLC 金霉素：Sep-Pak C18或者tC18 金霉素殘留的HPLC測定 伊維菌素：Sep-Pak C18或者tC18 伊維菌素殘留的HPLC測定法 .SPE小柱的典型運用實例 恩諾沙星，環丙沙星：Sep-Pak tC18(含碳量16%) 動物性食品中恩諾沙星和環丙沙星殘留物檢測方法HPLC 噁喹酸，氟甲喹：Sep-Pak tC18(含碳量16%) 動物性食品中噁喹酸和氟甲喹殘留物檢測方法HPLC.國家科技攻關方案課題畜禽產質量量平安關鍵控制技術系列規范研討 (課題編號： 2002BA906A75 ) 農業部畜禽產質量量監視檢驗測試中心 .國家科技攻關方案子課題三種獸藥運用規范

22、驗證和四種獸藥殘留檢測方法研討 (子課題編號： 2002BA906A37-01 ) 農業部畜禽產質量量監視檢驗測試中心 2005年11月10日 .20種獸藥殘留檢測方法的技術要點22.1 豬組織中已烯雌酚、已烷雌酚、已二烯雌酚殘留檢測方法研討氣相色譜-質譜法 在堿化的條件下用乙酸乙酯提取豬組織樣品中己烯雌酚、已二烯雌酚和已烷雌酚殘留，然后經過碳酸鈉溶液和硅膠柱對洗脫物質進展凈化處置。凈化后的樣品平均分兩份進展吹干后衍生，BSTFA衍生后進展氣相色譜質譜分析。 檢測限:0.25 g/kg -0.5g/kg；回收率:60.9%85.6% 批內變異系數15%，批間變異系數20% .22.1 豬組織中

23、已烯雌酚、已烷雌酚、已二烯雌酚殘留檢測方法研討氣相色譜-質譜法已二烯雌酚規范溶液經衍生化后選擇離子方式下的總離子流圖豬肝添加樣品總離子流圖(已二烯雌酚添加濃度為4g/kg).2.2 豬組織中雌二醇殘留檢測方法研討液相色譜-質譜法 試樣勻漿后,參與氘代雌二醇內標,經正己烷脫脂,經HLB柱、硅膠柱、氨基柱凈化后，于液質聯用儀上進展測定。同位素內標定量。 檢測限:1 g/kg；回收率:97.1%106.1% 批內變異系數15%，批間變異系數20% .2.2 豬組織中雌二醇殘留檢測方法研討液相色譜-質譜法豬肝添加雌二醇色譜圖(從上至下添加濃度依次為 0g/kg, 5g/kg, 2g/kg, 1g/kg

24、) .2.3 豬尿液中丙酸睪酮殘留檢測方法液相色譜-質譜法 豬尿樣品經固相萃取小柱凈化后，供液相色譜-質譜儀測定。 丙酸睪酮檢測限: 1.0 g/kg 丙酸睪酮回收率: 62.2%73.5% 批內變異系數15%，批間變異系數20% 丙酸睪酮規范溶液質譜圖 空白豬尿中添加50g/L的丙酸睪酮規范溶液后的SIR色譜圖 .2.5豬組織及豬尿中克倫特羅、沙丁胺醇殘留檢測方法氣相色譜-質譜法 試樣用高氯酸溶液勻漿、超聲加熱提取，用異丙醇+乙酸乙酯(40+60)萃取，有機相濃縮，經弱陽離子交換柱進展分別，用乙醇+濃氨水(98+2)溶液洗脫，洗脫液濃縮，經N,O雙三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)衍生后于氣

25、質聯用儀上進展測定。外標法定量。 檢測限:1 g/kg；回收率:60.37%93.86% 批內變異系數15%，批間變異系數20% .2.5 豬組織及豬尿中克倫特羅、沙丁胺醇殘留檢測方法氣相色譜-質譜法豬肝加標樣色譜圖 (2g/kg).2.6 豬組織及豬尿中萊克多巴胺殘留檢測方法氣相色譜-質譜法 樣品經過高氯酸水解提取，用乙酸乙酯和異丙醇4：6再次提取后過SCX陽離子小柱凈化，用適宜的溶劑選擇洗脫后, 氮氣吹干，供高效液相色譜定量質譜檢測器測定。外標法定量。 檢測限:1 g/kg；回收率:66.47%86.21% 批內變異系數15%，批間變異系數20% .2.6 豬組織及豬尿中萊克多巴胺殘留檢測

26、方法氣相色譜-質譜法300 g/L規范溶液質譜圖 肉添加10g/kg質譜圖.2.7 豬組織中氯霉素殘留檢測方法液相色譜-質譜法 樣品經過乙腈-水1+1溶液、乙酸乙酯反復提取，用正己烷除去樣品中的脂肪等雜質，C18固相萃取柱進一步凈化，N2氣吹干后供高效液相色譜定量質譜檢測器測定。外標法定量。 檢測限:0.1 g/kg；回收率:67.4%87.0% 批內變異系數15%，批間變異系數20% 1 g/L規范溶液圖肉添加1 g/kg圖.2.7 豬組織中氯霉素殘留檢測方法液相色譜-質譜法.2.8 豬組織中粘桿菌素殘留檢測方法液相色譜法 待測動物組織中殘留的粘桿菌素經三氯乙酸-甲醇溶液提取，C18固相萃取

27、柱凈化后，與熒光衍生化試劑反響，用高效液相色譜熒光檢測器進展檢測，外標法定量。 檢測限:75 g/kg；定量限:150 g/kg, 回收率:80.1%108.5% 批內變異系數15%，批間變異系數20% a：空白樣品圖 b：添加0.05g/g粘桿菌素樣品圖.2.9 豬組織中磺胺類藥物殘留檢測方法液相色譜法 組織樣品經乙腈提取后，在上清液中參與正己烷進展液液分配，取下層溶液參與正丙醇減壓枯燥，殘留物用乙酸乙酯溶解，過氨基鍵合小柱, 以乙酸乙醇溶液洗脫，氮氣吹干后用流動相溶解，定容后用高效液相色譜儀進展檢測。 檢測限:35 g/kg；回收率:65.1%92.1% 批內變異系數15%，批間變異系數2

28、0% .2.9 豬組織中磺胺類藥物殘留檢測方法液相色譜法磺胺類藥物規范品色譜圖豬肝添加磺胺類藥物色譜圖.2.10 豬組織中乙酰甲喹殘留檢測方法液相色譜法 動物組織勻漿用雙蒸水、三氯乙酸提取，經C18固相小柱凈化，80%甲醇洗脫，搜集洗脫液，作為試樣溶液供高效液相色譜配紫外檢測器分析，外標法定量 檢測限:50 g/kg 回收率:60.1%83.1% 批內變異系數15%，批間變異系數20% 空白豬肉組織試樣色譜圖 豬肉試樣中添加乙酰甲喹色譜圖 .2.11 動物組織豬、雞中硝基咪唑類藥物多殘留檢測方法液相色譜-質譜法 待測動物組織中殘留的硝基咪唑類藥物用乙酸乙酯提取，液/液萃取分別,固相萃取柱凈化后

29、，經過高效液相色譜/質譜聯用的大氣壓化學電離正離子檢測APCI+方式,進展選擇離子 (SIR)檢測，外標法定量，實現了三種硝基咪唑類化合物的多殘留確證。 檢測限:0.5-1.0 g/kg；回收率:55.31%88.66% 批內變異系數15%，批間變異系數20% 豬肝加標樣選擇離子檢測色譜圖. (a) 洛硝噠唑(M/Z= 201, 2.0g/kg); (b) 甲硝唑M/Z =172, 1.0g/kg; (c) 地美硝唑M/Z= 142, 1.0g/kg .2.12 動物羊、豬組織中伊維菌素類藥物多殘留檢測方法液相色譜法 待測動物組織中殘留的伊維菌素類藥物經乙腈提取，堿性氧化鋁固相萃取柱凈化后，與熒光衍生化