1、口腔疾病分子生物學1第一節 分子遺傳學基礎2一、生命的主要遺傳物質-DNA（一）對遺傳物質的認識什么是遺傳物質？蛋白質 20種氨基酸DNA 四種堿基轉化實驗的結果說明34（二）核酸的組成、分布及基本化學結構 核酸是一種高分子化合物，它的基本單體是核苷酸。每一個核苷酸由三部分組成，一個磷分子，一個糖分子，一個堿基。根據核苷酸的組成，核酸分為脫氧核糖核酸和核糖核酸。5DNA與RNA的區別糖堿基結構DNARNA脫氧核糖核糖腺嘌呤 胞嘧啶腺嘌呤 胞嘧啶鳥嘌呤 胸腺嘧啶鳥嘌呤 尿嘧啶雙鏈單鏈6（三）DNA結構的推衍Chargaff: T+C=A+G A=T G=CX線衍射： DNA在兩條鏈組成，相互平行

2、789二、DNA復制（一）DNA復制中的幾個概念1.復制子（replicon） DNA復制是與細胞的分裂相聯系的，主要表現在DNA復制的起始就意味著將要進行下一次分裂。在DNA完成之前，下一次細胞分裂就不會開始。 一個單獨的DNA復制單位稱為復制子。10每一個復制子都含有一個復制起點序列，又稱復制原點，也常含有一個末端序列，復制的過程在此終止。復制是在起始階段控制的，一旦開始復制，就會繼續進行下去，直到復制完成。11DNA多聚酶種類DNA多聚酶是DNA復制的主要合成酶。合成DNA 還需要下列因素：DNA的前體材料，四種脫氧核苷三磷酸Mg+的存在一小段DNA或RNA分子的3-OH一個DNA模板D

3、NA多聚酶的另一個重要特征是具有3 5方向的內切酶功能。12（二）DNA復制的方式1.半保留復制2.半不連續復制13半保留復制14DNA復制的特點新合成的子代DNA與親代DNA完全一樣，保證了遺傳的穩定性。15半不連接復制引導鏈：5 3方向的DNA合成滯后鏈：3 5方向，岡崎片段1617三、基因表達（一）RNA的類型發卡環：-AUUCGGAUAAGCCU-種類信使RNA（mRNA)核蛋白體RNA（rRNA)轉運RNA（tRNA)18(二)RNA的生物合成轉錄轉錄:在RNA多聚酶作用下，以DNA為 模板合成RNA的過程。1.轉錄的模板和方向：有意義鏈：模板鏈（3 5DNA鏈）反義鏈：非模板鏈19

4、2.RNA多聚酶與啟動子 啟動子：能特異性地與RNA多聚酶 結合，引發RNA合成。 從DNA上特定起始序列（啟動子）開始，至終止信號結束203.轉錄的起始與延伸214.內含子和外顯子的概念原核生物：基因是連續的DNA片段真核生物：基因由若干個不連續的DNA片段組成的。內含子：插入序列，它是位于基因的內部，能夠被轉錄的一段DNA。但在轉錄后，與之相應的那部分轉錄產物在拼接中被去掉了。外顯子：基因中與成熟的mRNA相對應的DNA片段，它不僅包括蛋白質編碼的部分，而且包括5和3末端不翻譯的前導序列和尾隨序列。22釉原蛋白基因表達示意圖2324（三）蛋白質的生物合成翻譯251.遺傳密碼遺傳密碼的性質所

5、有的密碼都是由三個連續的核苷酸組成，相鄰的兩個密碼之間沒有間隔的核苷酸存在3個終止密碼子UAA,UGA,UAG，起始密碼子：AUG密碼子具有兼并性通用性262.蛋白質的生物合成翻譯蛋白質的合成過程 .氨基酸活化 氨基酸結合至tRNA，即氨基酸活化，由氨酰-tRNA 合成酶催化。 氨基酸與tRNA結合后，由tRNA根據遺傳密碼子將氨基酸按順序排列合成蛋白質。 27.蛋白質合成的起始 蛋白質合成在核糖體上進行，核糖體由tRNA和核糖體蛋白質構成。 在細菌中，蛋白質合成的第一個氨基酸是甲酰化甲硫氨酸（fMet)。它與相應的tRNA結合成甲酰甲硫tRNA，只有它才能識別起始密碼并進入核糖體的特定部位，

6、從而啟動蛋白質的合成 AUG甲酰化甲硫氨酸（fMet)28.肽鏈的形成和延伸、合成的終止 終止碼UAA、UGA、UAG蛋白質合成的終止終止密碼子29303132333.新生多肽的加工 . fMet水解 . 磷酸化、糖基化、甲基化修飾 . 信號肽 蛋白質向細胞外分泌34四、基因表達DNA RNA蛋白質豐富的生命現象35五、基因表達的調節最初從一個受精卵，在個體發育過程中分化形成各種細胞組織和類型，最終形成一個完整的生物體。機體的每一個細胞都有一套完全相同的基因共同表達的基因維持細胞基本結構、功能特異性表達的基因紅細胞產生血紅蛋白B淋巴細胞產生抗體成牙本質細胞分泌牙本質蛋白3637基因表達調控的原

7、因動力細胞內細胞間或細胞與外界環境間關系的變化。38基因表達調節的方式啟動子強啟動子與RNA多聚酶有較強的結合能力，轉錄水平較高弱啟動子則反之。39基因表達調節的方式調節蛋白的作用 負向調節 正向調節40負向調節（一）乳糖操縱子學說大腸桿菌的乳酸代謝由三種酶完成-半乳糖苷酶半乳糖苷滲透酶半乳糖苷乙酰化酶操縱子（operon）幾個結構基因（Z）調節基因(i)操縱基因（o）啟動子（p）41（1）在無乳糖情況下，調節基因編碼的阻遏蛋白可以和操縱基因特異性結合，使RNA多聚酶不能結合半乳糖苷酶基因啟動子上而無法轉錄，結構基因就被轉錄。（2）當作為誘導物的乳糖存在時，乳糖能與阻遏蛋白特意地結合而改變阻遏

8、蛋白的構象，使阻遏蛋白不能與操縱基因結合，因而，解除了對結構基因表達的抑制，于是-半乳糖苷酶、半乳糖苷滲透酶、半乳糖苷乙酰化酶等基因被轉錄，進而翻譯。42結構基因的調控有正調控和負調控兩類沒有調節蛋白時操縱子內的結構基因是開啟的，而調節蛋白出現后結構基因被關閉。這樣的調控稱為負調控，如乳糖操縱子。沒有調節蛋白時結構基因是關閉的，而出現調節蛋白后結構基因的轉錄開啟，稱為正調控，如阿拉伯糖操縱子。43（二）Britten-Davidson模型該模型主要假定基因表達得分調節是通過控制系統來調節的。新的補充和修改一個特定的激活蛋白可以控制含有相應接受位點的許多結構基因的表達，即可以控制一組基因的表達。

9、一個結構基因擁有不同的幾個接受位點，每個接受位點受一個特異性的激活因子識別，這樣它可以作為不同組的成員而在不同的情況下表達基因表達的調節可以通過感應位點控制不同的集成基因而達到。444546正向調節47原核生物基因表達的調節主要在轉錄水平48真核基因生物調節多層次復雜性49第二節 分子生物學研究的主要方法50一、分子克隆的材料與方法分子克隆：意為“無性克隆”是DNA分子的無性繁殖技術。51（一）限制性內切酶是一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA 水解酶。三種限速酶型、型、型型限制性內切酶具有以下幾個特征特定的識別序列，46個堿基對在識別序列內固定位置切割，切割后5 端磷酸基因， 3

10、-端羥基基團切割后形成粘性或平齊末端5253（二）DNA連接酶催化DNA中相鄰3羥基和5 磷酸基團之間形成3 ，5 磷酸二酯鍵。T4 DNA 連接酶大腸桿菌連接酶54（三）質 粒概念細胞內獨立于染色體外的環狀DNA，能自我復制，在細胞分裂時可伴隨染色體分配至子細胞中。特點其上基因可借助宿主細胞的轉錄、翻譯系統得以表達分子200050000bp55TpGEM-TVector(3003bp)AmprlacZoriXmnI 1994ScaI 1875NaeI2695ApaIAatIISphIBstZINcoISacIIT7SpeINotIBstZIPstISaLINdeISacIBstXINsiIS

11、P6T 1 start14202631374655626273758294103112126 pGEM-T vector map56XhoISmaIXhoISmaIXhoISmaIpCIpCIA-PpGEM-T/A-P A-P fragmentSub-cloning construction of recombinant pCIA-P insertion of A-P DNA fragment into plasmid pCIXhoISmaIT4 LigaseA-P fragment57分子克隆中，構建質粒的特點Ori區質粒復制的起點Par區保證細胞分裂過程中，質粒能均勻分配至子細胞58多克隆

12、區人為構建，便于克隆操作。含有多個單一限制性內切酶酶切點。選擇因子含特定基因，如耐抗生素基因或-半乳糖苷酶基因（lacZ），使克隆后便于挑選。59有的質粒載體在其基因組中含有一個大腸桿菌的lacZ區段，此區段含有編碼-半乳糖苷酶基因lacZ。在誘導物IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的存在下， -半乳糖苷酶能作用X-gal（ 5-溴-4-氯-3吲哚- D-半乳糖苷）形成藍色化合物5-溴-4-氯靛藍。當這種質粒轉化無lacZ基因的大腸桿菌時，由于質粒，由于.60(四)噬菌體概念是侵染細菌、螺旋體、真菌等的病毒。結構溫和噬菌體和毒性噬菌體噬菌斑是分子生物學中重要的DNA載體目前廣泛使用的噬菌體有-噬菌

13、體，M13噬菌體，61野生的-噬菌體線狀雙鏈DNA分子在分子兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端當-噬菌體DNA被注入寄生菌細胞后，會迅速通過黏性末端的互補作用形成雙鏈環狀DNA。這種由黏性末端形成的雙鏈區段，稱為COS位點。-噬菌體DNA包含約61個基因，其中一半參與了噬菌體生命活動，這類基因稱為-噬菌體必要基因另一部分基因，當它們被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能，這類基因稱為非必要基因。62野生型-噬菌體本身不適合于作為載體，需要進行改造。改造后的-噬菌體載體具有在噬菌體非必要基因區制造多個單一的限制性內切酶區，以便外源性DNA片段的插入或取代。引進某些突變以改變噬菌斑的顏色或形

14、態，以便重組體的檢出，如-半乳糖苷酶基因區等。通過某些基因突變形成安全載體，以便利用生物學防護等。63（五）轉化、轉染、轉導轉化是指受體菌捕獲和表達質粒載體DNA分子的生命過程。細菌種屬及細胞壁結構的差異，轉化條件和過程均不一樣。感受態。即使同一菌屬中，各菌株達到感受態的的條件和時機也存在差別。氯化鈣處理大腸桿菌以提高細胞膜的通透性。轉染專指受體菌捕獲和表達噬菌體DNA分子的過程。64轉導是利用噬菌體顆粒為媒介，將外源DNA轉移至受體菌并得到表達的生命過程。6566二、分子克隆的主要步驟1.基因文庫的建立變鏈菌gtf基因染色體切成一定長度的DNA片段DNA連接酶整合至載體（質粒或噬菌體）載體轉

15、化至大腸桿菌每一個轉化的大腸桿菌含有一個重組質粒，因此就含數萬段重組質粒，因此就含有數萬段個、變鏈菌DNA。這數萬段隨機的變鏈菌DNA片段，應該包括該變鏈菌整個染色體。這個大腸桿菌集合體因為含有整個變鏈菌染色體而被稱為變鏈菌的基因文庫。672.目的基因的篩選核酸雜交免疫學檢測683.目的基因的分析DNA序列啟動子分析推測蛋白質一級結構推測蛋白質二級結構6970717273三、特異性核酸的檢測74（一）核酸分子雜交1.原理：在一定條件下（溫度、pH值等）DNA雙股螺旋可解開并分離在一定條件下，兩股游離的互補的核苷酸可自行配對形成雙股752.核酸分子雜交的技術過程（1）探針的制備（2）待測核酸的處

16、理（3）核酸雜交的類型點雜交Southern Blot76（1）斑點雜交目標序列的存在目標序列的量77（2）Southern Blot電泳、轉移、雜交確定分子量78（二）聚合酶鏈反應PCR1.PCR 原理792.用于PCR的DNA多聚酶803.PCR中的其他因素814.PCR應用82DNA電泳可分離不同分子量的DNA8384 Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder 對臨床菌株的第二次PCR 擴增產物電泳圖譜分析 Lane 17: 臨床菌株S. sobrinus; Lane 814:臨床菌株 S.mutans.(Kb)2.01.00.250.

17、10.750.5MW85與齲病相關微生物的定量檢測方法細菌形態生化反應免疫反應分子生物學方法 -分子探針雜交 -RFLP -PCR唾液在與齲病相關微生物檢測中的應用86在人類口腔中檢出率很高茸毛鏈球菌可能比變形鏈球菌與齲損活躍性之間的關系更密切變形鏈球菌和茸毛鏈球菌唾液在與齲病相關微生物檢測中的應用87套式PCR快速檢測人類唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌.譚海平，邊專，樊明文，陳智，范兵. 中華口腔醫學雜志，2003，38：223-226唾液在與齲病相關微生物檢測中的應用88套式PCR(Nested PCR )5 3 TemplateOuter primer2Outer primer1The f

18、irst PCR5 3 Inter primer2Inter primer 1Next templateThe second PCR 5 3 The second PCR product89本套式PCR的引物是分別根據變形鏈球菌gtfB基因和茸毛鏈球菌gtfI基因設計的內、外兩套引物（outer primer,inter primer）gtfB gene of S.mutansOuter primer thp4Outer primer thp3The first PCR Inter primer thp8Inter primer thp7Outer primer thp6gtfI gene o

19、f S.sobrinusOuter primer thp5The first PCRInter primer thp10Inter primer thp9The second PCRThe second PCR90抽提細菌染色體DNA(Igarashi et al.1996) -細菌 -唾液PCR反應過程 第一次PCR反應 預變性: 94 4min 變性: 94 1min 退火: 51 1min 30cycles 延伸 : 72 2min 最后延伸: 72 5min 第二次PCR反應91 a b c d e f g hLadder 1 2 3 4 5 6 7 8 選擇外引物行第一次PCR后擴增

20、產物電泳圖譜分析以變鏈菌組 (Mutans Streptococci)染色體 DNA為模板 Lane 1: S.cricetus AHT; 2.S. rattus BHT; 3.S.mutans Ingbritt; 4. S.sobrinus OMZ176; 5.S.mutans LM-7; 6. S.mutans OMZ175; 7. S.sobrinus 6715; 8. S.downei Mfe28. MW (Kb)2.0 1.0 0.25 0.1 0.75 0.592a b c d e f g h Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 選擇內引物行第二次PCR后擴增產物電泳圖譜

21、分析 Lane 1: S.cricetus AHT; 2.S. rattus BHT; 3.S.mutans Ingbritt; 4. S.sobrinus OMZ176; 5.S.mutans LM-7: 6. S.mutans OMZ175; 7. S.sobrinus 6715; 8. S.downei Mfe28. Marker: DL2,000 Ladder MW (Kb)2.0 0.75 0.51.0 0.25 0.193 Ladder 1 2 3 4 5 6 第一次PCR的靈敏度 變形鏈球菌S.mutans Ingbritt 的數量 Lane1: 108 CFU; Lane 2: 107 CFU; Lane3: 106CFU; Lane 4:105 CFUMW (Kb)