1、水稻 OsPDIL1-1 基因的功能初步分析韓小花，陳紅，江玲，王益華，郭洪年*（南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，南京市，210095）51015202530354045摘要：蛋白質二硫鍵異構酶（Protein Disulfide Isomerase，PDI）在衣藻及動物中研究較為詳細，除人源典型結構 PDI 和人源胰腺 PDI 外，Rb60、ERp57 和 ERp72 在植物體中都有相似結構的蛋白。本研究通過圖位克隆的方法在水稻中分離了一個水稻中控制淀粉合成的基因Protein Disulfide Isomerase Like 1-1 (OsPDIL1-1)。轉基因互補結果進一

2、步證實了圖位克隆的結果。RT-PCR 和 western 雜交結果顯示 PDIL1-1 在水稻根、莖、葉、葉鞘、穗和不同發育時期的胚乳均有表達，在發育 12 天的胚乳中表達量最高，而突變體中則沒有檢測到 PDIL1-1的表達。體外實驗證實 PDIL1-1 蛋白具有還原酶活性及分子伴侶活性。熒光定量 RT-PCR檢測發現內質網脅迫相關基因的表達均被顯著上調，同時 PCD 標志基因 HSR203J 在 T3612中被誘導表達。因此 PDIL1-1 的缺失導致胚乳細胞發生嚴重的內質網脅迫，并極有可能啟動PCD，最終影響淀粉的合成。關鍵詞：水稻；粉質；內質網脅迫；蛋白質二硫鍵異構酶；功能分析中圖分類號

3、：S511Preliminary research on the function of OsPDIL1-1 inrice(Oryza sativa L.)HAN Xiaohua, CHEN Hong, JIANG Ling, WANG Yihua, GUO Hongnian(Nanjing Agricultural University, National Laboratry of Crop Genetics and GermplasmEnhancement, Nanjing City, 210095)Abstract: Protein disulfide isomerase (PDI) s

4、tudy in more clear in Chlamydomonas and animals,Rb60, ERp57 and ERp72 in plants have a similar structure proteins except the typical structure ofanthropogenic PDI and the anthropogenic pancreas PDI. This study separated a control rice starchsynthesis genes Protein Disulfide Isomerase Like 1-1 (OsPDI

5、L1-1) in rice by using the method ofmap-based cloning. Semi-quantitative RT-PCR and western blot showed PDIL1-1 in rice roots,stems, leaves, leaf sheath, panicle and different developmental stages of endosperm, and theexpression amount of the highest in the developing endosperm of 12 days , while th

6、e mutants arenot detected the PDIL1-1 expression. In vitro experiments have established that PDIL1-1 proteinwith reductase activity and molecular chaperone activity. Quantitative RT-PCR test found that theexpression of related genes were endoplasmic reticulum stress rise significantly, at the same t

7、imePCD marker gene HSR203J in T3612 were induced to express. Therefore PDIL1-1 the lack ofendosperm cells leads to serious endoplasmic reticulum stress, and more than likely start PCD,ultimately affect the synthesis of starch.Key words: Rice; Floury; ER stress; Protein disulfide isomerase；Gene funct

8、ion analysis0 引言蛋白質二硫鍵異構酶（Protein Disulfide Isomerase，PDI）屬于硫氧還蛋白（TRX）超基因家族中的一個多基因家族，TRX 超基因家族還包括谷氧還蛋白、硫氧還蛋白、鐵氧還蛋白和過氧化物蛋白。TRX 超基因家族成員的特征是至少包含一個 CXXC 結構域。蛋白質二硫鍵異構酶家族廣泛存在于動物、植物和微生物中，種類很多，但是在進化上 PDI 蛋白是非常保守的。Houston 等利用生物信息學方法，根據 TRX 結構域詳細而系統地從擬南芥、水稻和玉作者簡介：韓小花，（1983-），女，博士研究生，主要研究方向水稻功能性基因組研究通信聯系人：郭洪年

9、（1970-），男，教授，主要研究方向：水稻分子遺傳學. -1-米中分別鑒定出 22、19 和 22 個 PDIL 蛋白，并對其結構域進行進化分類研究。該研究結果鑒定出來的 PDI 家族蛋白最為全面1。Houston 采用 Kanai 等對哺乳動物 PDI 的分類方法，根據 TRX 活性結構域的數目及排列，將在擬南芥、水稻和玉米中鑒定出來的 PDI 分為 classes1，classes 2 和 classes 5 三組2。而 Kanai 等提到的 classes 3 和 classes 4 在植物中沒有同源基505560因。Houston 研究中新提到的 class

10、es 5 則是植物中特有的 PDI 成員，除擬南芥 AtPDIL5-2 有預測的 KKXX 膜錨定基序外，其它 classes 5 成員均有軟件預測的跨膜結構域。到目前為止已經克隆到的擬南芥 PDI（3 個）及水稻 PDI（2 個）均采用 Houston 命名法。擬南芥中，AtPDIL1-1 又稱為 PDI5，PDI5 可以和半胱氨酸酶結合并啟動外珠被的 PCD，PDI5 功能的缺失導致擬南芥莢果內部分種子不能正常發育3。Lu 等用免疫熒光、免疫膠體金實驗技術以及純化葉綠體和 western blot 等實驗證明 At3g54960（AtPDIL1-3）位于葉綠體內淀粉顆粒周圍的基質4。而水稻

11、 PDIL1-1 在 2002 和 2010 年被報道與種子中谷蛋白合成有關，而且和谷蛋白相互作用，PDIL1-1 的缺失可以導致谷蛋白前體和醇溶蛋白通過分子間二硫鍵發生相互作用，從而沉積在一種新的內質網來源的蛋白體內5, 6。本研究通過圖位克隆的方法分離了一個水稻中控制淀粉合成的基因 OsPDIL1-1，研究表明 OsPDIL1-1 的突變導致胚乳細胞發生內質網脅迫并影響種子灌漿時淀粉的合成。1 材料與方法1.1 植物材料突變體來源于實驗室日本晴組培突變體，命名為：T3612651.2轉基因互補載體構建以日本晴胚乳 cDNA 為模板，擴增 PDIL1-1 的 CDS 序列（引物序列見附表），

12、并通過引入 BamHI 和 XbalI 酶切位點將其插入 pPZP2Ha3 載體以及通過引入 KpnI 和 BamHI 酶切位點將其插入 pCUbi1390 載體中，采用含 50 g/mL 潮霉素的固體培養基進行陽性克隆的篩選，將篩選到的陽性克隆質粒用于轉化 T3612 突變體愈傷。701.3亞細胞定位載體構建設計帶有 BamHI 和 XbalI 酶切位點的引物（引物序列見附表）擴增日本晴 PDIL1-1 的全長 CDS，經測序正確后連到 pA7-GFP 載體上，從而將 GFP 融合到 PDI 蛋白 C 端，該質粒用于原生質體 PEG 轉化。1 .4Bradford 法測定蛋白含量Wester

13、n 雜交時各組織蛋白含量的測定使用 Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（Bio-Rad）進7580行，測定具體步驟如下：將 BSA 蛋白標準樣品室溫完全溶解，使終濃度為 1 mg/mL；將 1mg/mL 標準品用超純水稀釋至 100 L，濃度分別為 100、250、500、750 和 5000 g/mL ；將待測樣品按情況用超純水稀釋至 100 L；各標準品和待測樣品分別加入 5 mL 染液，室溫放置 5 min（不超出 1 h）；用 Eppendof 公司 BioPhotometer plus 核酸蛋白測定儀測定 595 nm吸光值，并制作標準曲線，再根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度；1

14、.5 PDI 分子伴侶活性檢測檸檬酸合成酶（Citrate synthase，CS）溶解在 40 mM 的 Hepes 緩沖液中，加入 PDI 蛋白使終濃度為 150 nmol/L，檸檬酸合成酶的終濃度為 150 nmol/L。43恒溫保持 1 h，每隔10 min 測一次 OD360，同時測量空白對照對檸檬酸合成酶的影響。851.6PDI 還原酶活性檢測天然的胰島素有 A 和 B 兩條鏈組成，當天然的胰島素被還原時，AB 鏈分開，B 鏈會形-2-成沉淀而使得溶液變渾濁。PDI 的還原酶活性可以加速胰島素雙鏈的還原，通過檢測胰島素B 鏈的渾濁度來檢測胰島素二硫鍵的還原狀態。不同濃度的 PDI

15、重組蛋白分別加入 1 mg 的豬胰島素的反應緩沖液（100 mmol 的 Na2HPO4，2 mM 的 EDTA，pH 7.0）。加入 2 mM 的 DTT 后，開始計時，每隔 3 min 測一次 OD650。90951001052 結果與分析2.1 轉基因互補檢測與鑒定為進一步確證 T3612 突變體粉質表型是否由于 PDIL1-1 的缺失導致，我們進行了轉基因互補實驗。以 pPZP2Ha3 載體為基礎構建了 PDIL1-1 全長 CDS 的轉基因互補載體，并轉化突變體 T3612。結果 T1 種子恢復透明表型（如圖 1A）。為證明轉基因植株 PDIL1-1 全長CDS 序列是否被轉入，我們

16、將轉基因 T1 種子中表現透明的種子用于潮霉素發苗，結果均表現出潮霉素抗性。然后用引物 PDI-2F/PDI-2R 對 T1 植株基因組 DNA 進行 PCR 擴增，結果四個互補家系中單株均能擴增出 1640 bp 大小的目的條帶，日本晴中的 PDIL1-1 由于含有內含子，擴增條帶比較大，為 3491 bp；T3612 由于 PDIL1-1 缺失未能擴出目的條帶（如圖 1B）。隨后用另一對引物 PDI-2F/DEL-1R 對轉基因 T1 植株基因組 DNA 進行 PCR 擴增，結果四個互補家系中的單株均能擴增出 1037 bp 大小的條帶，和 T3612 擴增條帶一樣，這說明 4142 bp

17、的缺失序列背景在轉基因植株中依然存在，而對照日本晴未發生缺失，所以能夠擴增出 5 kb大小的條帶。用來源于水稻的 PDIL1-1 抗體血清進行 Western blot 檢測（蛋白來源于各家系透明種子總蛋白)，結果顯示轉基因互補家系中均有 PDIL1-1 蛋白的表達，其大小和日本晴一致，而對照 T3612 則沒有雜交條帶。以上這些結果說明 35S 啟動子可以驅動 PDIL1-1 在T3612 中表達，并且恢復種子的透明表型。圖 1T1 種子轉基因互補鑒定(A) 轉基因互補家系 A582-6, A582-9, A582-10 和 A582-11 的 T1 種子；(B) T1 種子轉基因 PCR

18、檢測；(C) T1110種子轉基因 western blot 檢測Fig. 1Phenotypes of the T1 progeny kernels of complemented lines(A) T1 kernels of four independent complemented lines A582-6, A582-9, A582-10 and A582-11; (B) PCR on T1genomic DNA of complemented lines. Lane1, Nipponbare; Lane 2, T3612; (C) PDIL1-1 protein was presen

19、t in thevitreous T1 seeds. Lane 1-4 represent four independent complementation lines A582-6, A582-9, A582-10 and115A582-11.-3-2.2 PDIL1-1 基因的表達半定量 RT-PCR（圖 2A）和 western blot（圖 2B）檢測發現，PDIL1-1 呈組成型表達，在根、莖、葉、葉鞘和穗中均有表達，而且穗和莖稈中表達量最高，葉片最少。由于 T3612突變表型是在種子當中，所以我們對發育不同時期的胚乳中 PDIL1-1 的表達情況進行檢測，120結果發現 PDIL1

20、-1 在種子發育 12 天到 15 天時表達量達到最高（圖 2C、D）。而種子發育12 天到 15 天的階段也是淀粉快速積累的時間，因此這也暗含著 PDIL1-1 對淀粉合成的重要性。半定量 RT-PCR 和 western blot 所檢測的 T3612 組織樣品中均未檢測到 PDIL1-1，這也再次證明 T3612 是一個 PDIL1-1 缺失型突變體。125圖 2 PDIL1-1 在不同組織的表達分析(A)RT-PCR 檢測 PDIL1-1 在不同組織的表達。Actin1 為內參基因。Rt, 根; St, 莖; Lv, 葉; Sh, 葉鞘; Pa, 穗。(B)PDIL1-1 蛋白在不同組

21、織的表達。矩形框表示 PDIL1-1 蛋白缺失。(C) RT-PCR 檢測 PDIL1-1 在發育不同時期胚乳中的表達。(D)PDIL1-1 蛋白在發育不同時期胚乳中的表達情況。矩形框表示 PDIL1-1 蛋白缺失。130Fig. 2Expression of PDIL1-1 in different organs(A) Expression of PDIL1-1 in different organs was examined by RT-PCR. Actin1 was used as the internal control.Rt, root; St, stems; Lv, leaves;

22、 Sh, sheath; Pa, panicle; (B) Immune blot analysis using anti-PDIL1-1 antibodies.The box highlight the lack of PDIL1-1 protein in the mutant; (C) Expression of PDIL1-1 in the developingendosperm of the wild type (Nipponbare) from DAF 6 to 21 was examined by RT-PCR.; (D) Immune blot analysis135in the

23、 developing endosperm from DAF 6 to 21. The box highlight the lack of PDIL1-1 protein in the mutant.2.3PDIL1-1 的亞細胞定位Signal3.0 軟件( :/ cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析 PDIL1-1 具有明顯的內質網定位信號以及內質網滯留信號 KDEL 基序。因此我們用 PA7-GFP 載體構建了 PDIL1-1-GFP 融140145合載體，并在水稻原生質體中進行亞細胞定位。加有幾丁質酶內質網定位信號肽的 GFP 被正確定位于內質網，當焦距處于原

24、生質體細胞皮層位置時可以觀察看到典型的網格狀內質網，而當焦距處于細胞中心時，網格狀則消失（圖 3B, C）。但是 PDIL1-1-GFP 融合蛋白不論如何調節焦距，都沒有出現網格狀熒光（圖 3A），其表現出的熒光和空載體 PA7-GFP 一致，所以 PDIL1-1-GFP 融合蛋白并沒有定位于預測的內質網。但是酶切以及測序結果均表明 PDIL1-1 已經連入 PA7-GFP 載體，而且序列正確。最近 Satoh-Cruz 將 PDIL1-1-GFP 融合-4-蛋白在水稻轉基因植株中表達，結果顯示其定位于內質網5。圖 3PDIL1-1-GFP 融合蛋白在水稻原生質體瞬時表達(A) PDIL1-1

25、-GFP 融合蛋白定位結果;(B) chit-GFP 定位結果，chit 為幾丁質酶內質網定位信號肽;150Fig. 3(C) 為 B 圖中細胞的在不同焦距拍攝的結果。Transient expression of the PDIL1-1-GFP fusion protein in rice protoplasts(A) The result of PDIL1-1-GFP fusion protein localization; (B) The result of chit-GFP protein localization.chit is the chitinase signal peptid

26、e sequence;(C) is the same cell in B, but different focal length.1552.4PDIL1-1 的還原酶活性分析通過檢測胰島素 B 鏈的混濁度來反映胰島素被還原的程度。不同濃度的 GST-PDIL1-1重組蛋白分別加入含有 1mg 的豬胰島素蛋白反應緩沖液中，以不同濃度的空載體 pGEX 為對照。整個反應在 30水浴鍋中進行。結果表明 GST-PDIL1-1 重組蛋白具有還原酶活性，并且還原酶活性與濃度成正比（圖 4）。1602.5PDIL1-1 的分子伴侶活性分析我們用檸檬酸合酶做底物來分析 GST-PDIL1-1 重組蛋白的分子

27、伴侶活性，以空載體和PBS 作為對照。結果顯示 43熱變性 60 min 以后，與空載體 pGEX 和 PBS 相比，GST-PDIL1-1重組蛋白可以將檸檬酸合酶的混濁度降低 64.9%（圖 5）。這說明 GST-PDIL1-1 重組蛋白有165效地抑制了檸檬酸合酶的熱變性，證明其在體外同樣具有分子伴侶活性。-5-170圖 4用胰島素分析 GST-PDIL1-1 的還原酶活性Fig. 4Assay of reductase activity by measuring the reduction of insulin disulfides175圖 5GST-PDIL1-1 可以抑制檸檬酸合酶熱

28、變性Fig. 5GST-PDIL1-1 prevents denaturation of citrate synthase2.6 內質網脅迫相關基因熒光定量 RT-PCR 分析PDI 通過二硫鍵氧化還原可以幫助蛋白進行正確折疊，因此 PDI 的缺失會導致蛋白不能180185190夠被正確折疊，而不正確折疊蛋白在內質網的積累會導致內質網脅迫響應。因此我利用熒光定量 RT-PCR 的方法檢測了突變體胚乳細胞內質網脅迫響應基因的表達情況。結果發現膜結合的 bZIP 轉錄因子基因、Bip、Hsp70、Hsp90、CRT、CNX 以及輔助分子伴侶 NEF、ERdj3like、Stt3a 和 UDP-gl

29、ucose-transporter 和 ERAD 降解途徑基因 Derlins 的表達均上調（圖 6）。膜結合的 bZIP 轉錄因子可以感受內質網的脅迫，然后轉移進入細胞核內上調脅迫相關基因的表達。bZIP17、bZIP28 和 bZIP60 在 T3612 突變體胚乳細胞中均上調，尤其是 bZIP60的表達增加一倍。bZIP60 轉錄因子可以上調 PDI、Bip 和 Hsp70 的表達7。PDI 家族蛋白除了 PDIL2-3 外，其它蛋白增加均在一倍以內。這也說明 PDI 家族內基因對內質網脅迫的響應存在差異。其它分子伴侶的表達均增加一倍以上，尤其是 Bip-2、Hsp70-1、Hsp70-

30、2、CRT-2以及輔助分子伴侶 NEF 上調 5 倍以上，這說明各個分子伴侶在內質網脅迫發生時表達水平上存在差異。嚴重的內質網脅迫可導致 PCD 的發生。而且在 T3612 胚乳細胞中我們利用半定量 RT-PCR的方法檢測到了 PCD 相關的基因 HSR203J 被誘導表達（圖 7），而在野生型日本晴胚乳細-6-胞中該基因基本不表達。195圖 6內質網脅迫相關基因的表達分析Fig. 6Expression levels of the genes involved in ER stress200圖 7Bip-3 和 HSR203J 基因的半定量 RT-PCR 分析Fig. 7RT-PCR ana

31、lysis of expression of chaperone Bip-3 and cell death maker gene HSR203J in wild type andT36123 討論到目前為止，水稻中已經克隆到多個與種子粉質表型相關的基因，這包括 ISA1、205210215OsAGPS2b、OsPPDKB、Pho1 以及 SSIIIa 和 BEIIb。這些基因均和淀粉合成酶的催化過程相關，淀粉的代謝過程網絡圖已經建立。然而最近發現的一些影響淀粉合成的新基因卻無法定位到已有的代謝網絡當中，比如 Rab5a、Flo2、Bip1。因此我們需要發現更多新的淀粉相關基因，來建立一個多網絡

32、交叉的模型，這顯得尤為重要。本研究發現的突變體 T3612 是由于 PDIL1-1 缺失導致粉質胚乳表型。PDIL1-1 編碼一個蛋白質二硫鍵異構酶，也是一個分子伴侶，在內質網中通過氧化還原二硫鍵幫助新生蛋白質折疊形成正確構象。本研究克隆到的 PDIL1-1 經體外實驗證明其具有還原酶活性及分子伴侶活性（圖 4、圖 5）。Kleffmann 等發現擬南芥葉綠體中 8%的蛋白具有內質網定位信號肽8，造粉體與葉綠體都屬于質體，因此 T3612 中這些具有內質網定位信號肽的造粉體蛋白極有可能得不到正確折疊從而影響到造粉體內淀粉的合成。未折疊蛋白在內質網中的過量積累可以導致內質網脅迫，內質網脅迫發生時

33、細胞會上調-7-內質網分子伴侶、輔助分子伴侶的表達以提高內質網折疊能力。分子伴侶 Bip 在輔助分子伴侶 ERdj3like 和 NEF 幫助下完成對未折疊蛋白的結合與釋放，防止這些蛋白不正確折疊以及在內質網的聚集9。另外 Stt3a 可以糖基化蛋白，這可以幫助未折疊蛋白被 CNX/CRT 折疊裝置識別。而 UDP-glucose-transporter 可以轉運 UDPG 進入內質網為蛋白糖基化提供原料10。220225230235240245250255我們研究發現 T3612 胚乳細胞中分子伴侶基因的表達被顯著上調，比如 Bip、CRT、CNX、Hsp70 和 Hsp90，還有輔助分子伴

34、侶 NEF、ERdj3like、Stt3a 和 UDP-glucose-transporter 以及內質網降解途徑基因 Derlins 均被上調表達。這些基因的大量表達說明內質網中未折疊蛋白增多。PDIL1-1 是通過二硫鍵的氧化還原異構化對其底物蛋白進行折疊以及對錯誤折疊蛋白來進行校正，而 Bip、CRT、CNX 并非通過二硫鍵行使功能，因此這些基因的上調表達從基因功能上來講無法彌補 PDIL1-1 的缺失。所以那些依靠二硫鍵進行折疊的蛋白通常會在內質網積累，比如 PDIL1-1 的缺失導致 57kD 谷蛋白前體和富硫醇溶蛋白通過分子間二硫鍵結合，導致未被轉運出內質網，而在內質網積累。因此雖

35、然 Bip、CRT、CNX 上調但是內質網脅迫并沒有被緩解。而且 RT-PCR 結果發現 PCD 相關基因 HSR203J 在突變體胚乳細胞中被誘導表達。動物細胞中已經證實內質網脅迫得不到緩解最終將使細胞啟動 PCD。因此我們認為PDIL1-1 功能缺失致使細胞內初生蛋白得不到正確折疊，從而導致內質網脅迫，最終啟動PCD，影響淀粉的合成。有關于內質網脅迫和粉質胚乳之間的內在聯系，在玉米中早有研究。Hunter 等利用基因芯片對 9 個玉米粉質胚乳突變體 o1、o2、o5、o9、o11、Mc、DeB30 和 fl2 的研究發現，Bip、PDI、Hsp70、Hsp90 以及 CRT 等分子伴侶基因

36、的表達均顯著上調11。另外 Takaiwa 實驗室研究發現在內質網過量表達 Bip 或者抑制 Bip 的表達，均導致這些分子伴侶表達上調，而且種子呈現粉質表型7。因此綜上所述，內質網脅迫與粉質胚乳存在著一定的聯系，而內質網脅迫又是如何影響淀粉的生物合成還需進一步的實驗驗證。4 結論本研究通過轉基因互補實驗進一步證實了精細定位的結果。PDIL1-1 編碼一個蛋白質二硫鍵異構酶，體外實驗證實重組的 PDIL1-1 蛋白具有還原酶活性及分子伴侶活性。掃描電鏡觀察顯示突變體 T3612 中的淀粉顆粒變圓、變小而且淀粉合成相關酶活性檢測發現 Pho1 以及 PUL 活性下降顯著，而 SSI 活性顯著上升

37、。通過熒光定量 RT-PCR，我們發現內質網脅迫相關基因的表達均被顯著上調，而且 PCD 的標志基因 HSR203J 在 T3612 中被誘導表達。因此這一系列的實驗結果表明 PDIL1-1 的缺失導致內質網脅迫的發生，內質網脅迫啟動PCD，從而影響胚乳細胞內淀粉的正常合成，使得淀粉顆粒充實度不夠，從而導致種子呈現粉質表型。致謝本研究得到以下基金支持，江蘇省科技支撐計劃(BE2012303); 教育部高校博士點基金(20100097110033)。參考文獻 (References)1 HOUSTON N L, FAN C, XIANG J Q, SCHULZE J M, et al. Phyl

38、ogenetic analyses identify 10 classes of theprotein disulfide isomerase family in plants, including single-domain protein disulfide isomerase-related proteins.Plant Physiol, 2005, 137(2): 762-778.-8-2 KANAI S, TOH H, HAYANO T. KIKUCHI M. Molecular evolution of the domain structures of proteindisulfi

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