1、第十章一、熱滅菌的原理和方法 1干熱滅菌的原理和方法干熱滅菌的主要作用： 干熱對微生物有氧化、使細胞蛋白質變性和電解質濃縮等從而使微生物細胞中毒死亡。 其中導致微生物死亡的主要作用是氧化。在干熱處理中，只要有足夠高的溫度和足夠長的時間，所有微生物都可被殺滅。 一般采用的干熱滅菌的條件: 160 、120 min。一、熱滅菌的原理和方法 干熱滅菌的效果不如濕熱滅菌： 微生物對干熱的耐受力要比對濕熱的耐受力強得多。這可用溫度系數Q10來表征。 Q10是指：溫度升高10時微生物的死亡速度常數與原來溫度時的死亡速度常數的比值。一、熱滅菌的原理和方法 表中列出了一些微生物菌種的Q10。從表中的內容可知，

2、干熱滅菌時嗜熱脂肪芽孢桿菌的Q10僅為2.86，而在濕熱滅菌時的Q10卻高達14.28。某些微生物的Q10微生物名稱干熱滅菌濕熱滅菌嗜熱脂肪芽孢桿菌2.8614.28枯草桿菌黑色亞種2.728.71凝結芽孢桿菌2.60大腸桿菌營養體50.44 干熱滅菌的適用范圍： 適用于工業上要求的滅菌后仍能保持干燥狀態的物料的滅菌。實驗室規模的玻璃器皿等器具常采用干熱滅菌。 干熱滅菌的溫度和時間的關系可參考下表。一、熱滅菌的原理和方法 滅菌溫度（0C)滅菌時間17060160120150150140180121過夜干熱滅菌的溫度和時間2濕熱滅菌的原理和方法濕熱滅菌的原理： 借助于蒸汽釋放的熱能使微生物細胞中

3、的蛋白質、酶和核酸分子內部的化學鍵，特別是氫鍵遭到破壞而引起不可逆的變性導致微生物死亡。 下表列出了卵蛋白中水分的含量與其凝固溫度的關系。蛋白質水分含量和凝固溫度卵蛋白水分含量（%）凝固溫度（0C)50562576159651490165濕熱滅菌中水分的作用：1.由于水分子的存在，使蛋白質更易因受熱而凝固變性。2.在高溫下水還能直接與復雜的生化成分反應，破壞必需的細胞成分或者產生有毒的副產物。一、熱滅菌的原理和方法 濕熱滅菌中水分的作用：3.在滅菌過程中水有助于殺死微生物的第二條途徑是通過增加熱導系數。猶如人能將其手快速地穿過800的蠟燭火焰而不會感到灼熱或疼痛，而穿過100的茶壺噴出的蒸汽流

4、時，手指會受傷。方法： 利用蒸汽進行濕熱滅菌時，可通過調節蒸汽的壓強來調節滅菌溫度。但應注意的是，有時壓力計指示的壓力并不總是表示相應的溫度。因此，在采用濕熱滅菌時，應注意以下兩個因素： (1)壓力計的選用 壓力計選用包括選定壓力計的型式及決定壓力計的量程兩個方面。彈簧管壓力計是測量蒸汽壓力而被廣泛使用的壓力計。在被測壓力比較平穩的情況下，規定被測壓力的最大值是選用壓力計滿刻度的34。如被測壓力是脈動的，則規定被測壓力的最大值是選用的壓力計滿刻度的2/3。 被測壓力的低限，在以上兩種情況下都不應該低于所選壓力滿刻度的13，以保證讀數誤差不致太大。選用滿刻度或太小的壓力計，都不能得到準確的讀數。

5、 (2)壓力容器中殘留空氣的排放 壓力容器中有空氣存在時，空氣與蒸汽混合，蒸汽分壓與空氣分壓之和為容器的總壓力。蒸汽分壓低于無空氣殘留時的蒸汽壓力時，則蒸汽冷凝溫度降低，不能起到完全滅菌的作用。殘留空氣愈多，溫度則愈低。 判斷壓力容器中的空氣是否排除干凈的判斷方法： 可根據排氣口排出氣體的溫度來判斷。若排氣溫度已達到100，則表明空氣已排除干凈。 容器上的壓力計和溫度計的安裝位置須能正確指示容器內的壓力和溫度。壓力計應安裝在遠離蒸汽進口的上方，溫度計則安裝在近空氣出口處。一、熱滅菌的原理和方法 3培養基及有關設備的滅菌方法 培養基滅菌過程中，除了微生物被殺死外，還伴隨著培養基成分的破壞。在蒸汽

6、加壓加熱情況下，氨基酸和維生素等都易被破壞。在工業生產中必需選擇既能達到滅菌目的，又能使培養基的破壞量減少到最小的條件。 根據微生物對數殘留定律(滅菌過程中，在一定溫度下殘留微生物的數量隨時間增加而以對數速率減少)，滅菌過程中培養基受熱破壞呈化學反應的一級動力學反應。生產實踐證明，滅菌溫度較高而時間較短的滅菌效果要比滅菌溫度較低而時間較長的好。 (1)實罐滅菌(分批滅菌) 先將輸料管路內的污水放盡并沖洗干凈，再特配制好的培養基用泵打到發酵耀、種子耀或補料罐內(較小體積的配料可直接在罐內配制)，然后開動攪拌器進行滅菌。其操作過程大致可分為：培養基預熱 滅菌時培養基需先加熱到80-90，然后再導入

7、蒸氣升溫到120-180。 預熱的目的： 一是若直接導入蒸汽，由于培養基與蒸汽的溫差過大會產生大量的冷凝水使培養基稀釋。 二是若直接導入蒸汽容易造成泡抹急劇上升而引起物料外溢。培養基預熱 預熱的方法：先將各排氣閥打開，將蒸汽引入夾套或蛇管進行預熱，待罐溫升到8090，將排氣閥逐漸關小。培養基滅菌 將蒸汽從進氣口、排料口、取樣口直接導入罐內(如有沖視鏡管則也同時導入蒸氣)，使罐溫上升到120130，罐壓維持在105Pa(表壓)左右，并保溫30min。 滅菌時應注意：各路蒸氣進口的進氣要暢通，防止短路逆流，罐內液體翻動要劇烈，以使罐內物料達到均一的滅菌溫度； 排氣量不宜過大，以節約蒸氣用量；滅菌將

8、要結束時，應立即引入無菌空氣以保持罐壓，然后開夾套或蛇管冷卻水冷卻，以避免罐壓迅速下降產生負壓而抽吸外界空氣；在引入無菌空氣前，罐內壓力必須低于過濾器壓力，否則培養基(或物料)將倒流入過濾器內，滅菌時總蒸氣壓力不低于33.5 105 Pa(表壓)，使用壓力不低于2 105Pa(表壓)。 (9)連續滅菌 培養基通過連續滅菌以比分批滅菌高的溫度和較短的時間，進行快速連續加熱滅菌，并快速冷卻，再立即輸入預先經過空罐滅菌后的發酸罐中。培養基預熱 將料液預熱到60-75，避免連續滅菌 時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產生水氣撞擊聲。 連續滅菌 連續滅菌是在連消塔中完成的。連消塔的主要作用是使高溫蒸氣與料液

9、迅速接觸混合，并使料液溫度很快升高到滅菌溫度。 連續滅菌的溫度一般以126132為宜。由于輸送培養基的連消泵的出口壓力一般為6105Pa，所以總蒸汽壓力要求達到4.55.0105Pa以上。只有當兩者壓力接近，培養基流速才能均勻穩定，否則流速非快即慢，影響滅菌質量。 維持滅菌溫度 由于連消塔加熱時間較短，光靠這短時間的滅菌是不夠的。因此，利用維持罐使料液在滅菌溫度下保持67min，以達到滅菌的目的。維持罐的罐壓一般維持在 4105Pa左右。冷卻 生產上一般采用冷水噴淋冷卻，即用冷水在排管外從上向下噴淋，使管內料液逐漸冷卻。一般料液冷卻到40-50后，輸送到預先空消過的罐內。在冷水噴淋前，冷卻管內

10、應充滿填料。 連續滅菌的特點： 連續滅菌的溫度較高，時間較短，培養基受到的破壞較少，故質量較好。 連續滅菌時由于培養基滅菌不在發酵罐內進行，所以發酵罐的利用率較高，此外，連續滅菌時蒸汽負荷均衡一致。 但連續滅菌的不足之處是所需設備較多，操作較麻煩，染菌的機會也相應增多。 (4)發酵附屬設備及管路的滅菌 發酵附屬設備：總空氣過濾器、管道、計量罐、補料罐等。 一般糖水罐滅菌時罐壓為1105Pa、時間為30min。滅菌時要使糖水翻騰良好，溫度不宜過高，否則糖料易炭化。 油罐(消沫劑)的罐壓為1518105Pa、時間為60 min。(4)發酵附屬設備及管路的滅菌 總空氣過濾器滅菌時，先關閉總進氣和出氣

11、閥門，開啟放氣閥門，使總空氣過濾器內的壓力降到零(表壓)。 總空氣過濾器滅菌的蒸汽壓力為36105Pa左右，蒸汽自上端輸入，上下放氣口放氣，總過濾器內壓控制為152.0105Pa(表壓)，滅菌時間2h。滅菌完畢，自上端輸入空氣，自上而下吹干過濾介質。 常用的化學藥劑包括： 甲醛、戊二醛、環氧乙烷、漂白粉、過氧乙酸、乙醇和新潔爾滅等。 其用途和使用方法見表11-11。 射線滅菌即利用紫外線、高能量的電磁波或粒子幅射滅菌。紫外線的滅菌功能： 低壓水銀電弧發射的紫外線，對微生物有殺滅作用。其波長在2100-3132范圍內有效，而最常用的有效波長為2537。 紫外線對芽飽和營養細胞都能起作用，但其穿透

12、力極低，只能用于表面滅菌，它對真菌孢子的殺滅能力不大。 紫外線滅菌的適用范圍： 在發酵生產和實驗室規模，紫外線主要用來進行一定空間內空氣的滅菌(如無菌室等），而用于大量空氣的滅菌，技術上有許多困難，因此在工業生產中用紫外線對殺滅大量流動空氣中的細菌意義不大。 紫外燈的使用壽命：商品紫外燈輸出波長2637的紫外線達95，長期使用后能量逐漸衰減，殺菌效果亦即降低，因此需定期更換。l 介質過濾除菌主要是用于空氣除菌以得到發酵工業所需的無菌空氣。l 空氣(即大氣)是一種氣態混合物，除氧氣、氮氣、二氧化碳、惰性氣體和水蒸氣外，尚有懸浮在空氣中的灰塵。l 灰塵主要是由構成地殼的無機物質微粒、煙灰、植物的花

13、粉、以及種類繁多的細菌和其他微生物組成。l 灰塵的含量和粒子的大小很大程度上因地區、氣候的不同而異。一船城市多于農村或山區，夏天多于冬天，特別是氣候溫和溫潤的地區，空氣中的細菌往往較多。 1介質除菌的機理 雜菌在空氣中很少單獨游離存在，常以一定形式與其他物質結合在一起，大部分雜菌附著在煙灰、微滴等粒子上。介質過濾或靜電除塵法除菌就是把這些粒子與附著在粒子上的雜菌，以及空氣中單獨游離存在的雜菌除去。介質除菌過程涉及到下述五種除菌機理。 (1)沉降作用 微粒具有一定的重力，當微粒的重力超過空氣作用于它的浮力時(不計氣流速度的影響)，即產生一種沉降速度。低速度的氣流通過介質時，微粒沉降在介質表面。實

14、際上，由于氣流速度大于微粒沉降速度，因而沉降效果不明顯。所以在介質除菌過程中，沉降是去除微生物和塵埃的次要因子。 (2)截留作用 截留是空氣中的微生物或塵埃表面與過濾介質表面簡單接觸，微生物和塵埃吸著在介質表面。除菌介質，如纖維等的直徑愈細，填充密度愈大，截留效果愈好。截留作用在介質過濾中也不是除菌的主要機理。 (3)慣性碰撞 氣流中的微塵具有一定的慣性力，當氣流遇到過濾介質而改變方向時，微塵仍作直線運動以致與過濾介質碰撞而被阻攔在過濾介質表面。當氣體流速達到一定值時，慣性碰按是介質過濾除塵的主要因子。四、介質過濾除菌的原理和方法(5)靜電吸附 許多微生物及其孢子都帶有電荷，約有75的孢子帶有

15、160負電子單位，15的孢子帶有514正電子單位，其余10的孢子為中性。介質過濾中帶電荷的粒子可被帶相反電荷的介質吸引除去。2空氣過濾除菌的工藝過程 工業發酵過程中為得到無菌空氣。 主要目的： 一是，提高壓縮前空氣的質量(潔凈度)。 二是，去除壓縮空氣中所帶的油和水。 三是，再加熱到3035，最后通過總過濾器和分過濾器(有的不用分過濾器)除菌，從而獲得潔凈度、壓力、溫度和流量都符合工藝要求的無菌空氣。(1)提高壓縮前空氣的質量 主要措施是提高空氣吸氣口的位置和加強吸入空氣的壓縮前過濾。提高空氣吸氣口的高度可以減少吸入空氣的微生物含量。一般空氣吸入口以離地面510m為較好。裝上前過濾器可減少往復

16、式空氣壓縮機活塞和氣缸的磨損，減輕介質過濾除菌的負荷。 冷卻后的空氣其相對濕度提高到100，由于溫度處于露點以下，其中的油、水即凝結為油滴和水滴。進而用空氣貯藏罐來沉降大的油滴、水滴和穩定壓力，用旋風分離器分離5um以上的液滴，用絲網除沫器分離5um以下的液滴。 (3)無菌空氣的獲得 分離油、水以后的空氣的相對濕度仍為100，當濕度稍微下降時(例如冬天或過濾器阻力下降很大時)就會析出水來，使過濾介質受潮。因此，還必須使用加熱器來提高空氣溫度，降低空氣的相對濕度(要求在60以下)，以免析出水來。這樣的空氣(3035)再經過總過濾器和分過濾器除菌后即能得到符合工藝要求的無菌空氣。 染菌原因常因工廠

17、不同而有所不同，但設備滲漏、空氣有菌、種子帶菌、滅菌不徹底和技術管理不善等則是造成各廠染菌的普遍原因。值得注意的是，原因不明的染菌率愈高，從某種程度上說明該廠的分析水平較低，有待于進一步提高。下面介紹一些常見的染菌原因和防治措施。 種子染菌的判斷： 根據長期的生產經驗，在種子培養過程中，06h內種子染菌是較少見的，絕大多數染菌在10h以后。種子污染芽孢菌，推測可能是由于滅菌不徹底所致，故不應作為種子帶菌統計。 但種子污染酵母菌、霉菌則可能是種子帶菌的緣故。 種子染菌的判斷方法： 為了弄清染菌是否為種子帶菌所致，在接種后要將接種瓶中剩余的少量種子液繼續進行培養，以觀察判定是否為種子帶菌。 發酵設

18、備及其附件一旦滲漏，就會造成染菌。 例如冷卻盤管、夾套穿孔滲漏，有菌的冷卻水便會通過漏孔進入發酵罐而招致染菌。閥門滲漏也會使帶菌的空氣或水進入發酵罐而造成染菌。二、設備及附件滲漏造成的染菌及其防治措施 設備漏隙，如肉眼所能見者，容易被發現也容易被治理。但對于肉眼看不見的微小漏隙，則必須通過加壓等各種試漏方法才能被發現。 由于各種設備和附件都可能發生這種微小的滲漏，加之目前還缺少快速準確的檢測手段，故很難發現。因此，常常發生這種情況，即雖已判定是設備或其附件滲漏而引起的染菌，但控往部找不到滲漏源，以致因同一處滲漏而造成連續多批染菌。 了解滲漏的原因，及時采取措施，不但可以防止發酵染菌，還可以延長

19、設備及其附件的使用壽命。 一般來說，造成發酵設備及附件滲漏的有下述四項原因。1化學腐蝕及其防止 所謂化學腐蝕是指金屬或合金與介質間直接的化學作用而引起的破壞。發酵設備及附件所接觸的介質主要為蒸汽、空氣、油、糖及含氮的水溶液。這些介質的化學性質穩定、與金屬或合金間的化學作用非常緩慢。調節發酵液的pH值需用酸和堿，前體如苯乙酸(青霉素發酵)、丙酸(紅霉素發酵)等，這些物質均能產生化學作用，即發生化學腐蝕。 但由于接觸時間較短，且這些物質的數量不多，因此，可以認為在抗生素發酵中，化學腐蝕并不是設備損壞的主要原因。但在有機酸發酵過程中，化學腐蝕是設備損壞的主要原因。二、設備及附件滲漏造成的染菌及其防治

20、措施二、設備及附件滲漏造成的染菌及其防治措施2電化學腐蝕及其防止 金屬腐蝕經常伴有電流發生。當電子從金屬的某一區域的電介質溶液移動而引起的破壞稱為電化學腐蝕，即由于電介質的存在，在金屬表面產生微電池作用，從而使較活潑的金屬放出電子而發生氧化反應的一種腐蝕。電化學腐蝕能不斷深入金屬內部，使設備腐蝕穿孔，電化學腐蝕的破壞性比化學腐蝕嚴重。在抗生素發酵過程中，需要連續輸入空氣，又連續產生二氧化碳，從而使發酵設備加速腐蝕。防止辦法： 電化學腐蝕常采用陰極保護法來防止，其基本原理是使要保護的金屬成為陰極，因為由于陰極是還原反應，從而使金屬得到保護。但對抗生素發酵設備的電化學腐蝕來說，幾乎還沒有保護的辦法

21、。 3腐蝕及其防止 金屬、合金或非金屬材料與介質長期連續不斷地摩擦而引起的破壞稱為腐蝕。腐蝕沒有化學和電化學反應發生，純粹是機械磨損。 產生腐蝕的原因： 工業發酵培養基中常含有黃豆餅粉、花生粉或其他種籽餅粉等固體成分，在發酵過程中因攪拌而與罐壁、盤管、攪拌軸、擋板等長期連續摩擦，使罐體、盤管磨蝕而穿孔泄漏。各種籽實在榨油和籽餅加工過程中，可能摻雜泥沙、金屬等異物，從而使磨蝕加快。 二、設備及附件滲漏造成的染菌及其防治措施腐蝕的原因： 培養基中的其他成分如玉米漿等，也常混有固體異物，這些都是造成磨損的原因。造成磨蝕的另一個不可忽視的原因是蒸汽和壓縮空氣對設備的沖擊。 3腐蝕及其防止 腐蝕的防止方

22、法： 一是，對發酵用的培養基中的固體成分研磨到相當的細度。如美國施貴寶公司將培養基中的黃豆餅粉研磨到200目以下。 二是，設備定期檢修時，應檢查一下設備中受蒸汽、空氣和其他流體沖擊的部位是否被磨蝕，如被磨蝕應及時采取措施。4設備加工不良遭成滲漏及其防止 由于設備制作加工者對工業發酵工藝要求不了解，所以設備加工不良或有缺陷而引起穿孔滲漏，也是常見的染菌原因之一。 屬于制作加工不良的滲漏多發生在彎頭和焊縫處。因此工廠在正式投入使用前，應進行適當的調研和試驗，以保證所用設備或附件能適應工藝要求。二、設備及附件滲漏造成的染菌及其防治措施4設備加工不良遭成滲漏及其防止 設備及附件滲漏而導致染菌的機率很高

23、，因此，有必要對發酵用的設備及附件進行規范化的維修。各種設備及附件的檢查內容、時間間隔、維修質量標準等列于表11-1711-25(抗生素發酵)。 三是，設備制作或安裝不合理而使滅菌時蒸汽短路。由培養基滅菌不徹底而產生的染菌大多表現在發酵前期，且污染的雜菌大多為耐高溫的芽孢菌。 根據上述幾種造成培養基滅菌不徹底而導致染菌的原因，采取相應的措施，能夠防止。 如滅菌時的蒸氣壓力、蒸氣量和滅菌時間一定要保證；滅菌時從常溫升到滅菌溫度的升溫時間不宜太快(一般為45min左右)，以防止大量泡沫的產生，因為染菌大多是由于通蒸氣滅菌時泡沫上升到發酵罐罐頂不易消失造成的。 為防止滅菌時泡沫的產生，最好將含有大量

24、糖及氮的培養基分開滅菌，尤其是在當原材科易受潮、結塊、甚至發霉變質的季節，將糖氮分開滅菌會減少泡沫的產生。 投料方式有時也會影響泡沫的形成。進氣和排氣控制不當，容易產生泡沫，故要緩慢開啟進氣和排氣閥門以防止泡沫上升。再則，合理地創作加工和安裝設備及有關的附件，使滅菌時蒸汽能夠通到各個部位而不留有“死角”。 空氣系統導致染菌是抗生素發酵染菌的主要原因之一。 因空氣不潔造成的染菌，可波及許多發酵罐批，對生產危害甚大。 空氣除菌系統環節較多，彼此相互制約，倘若一個環節失調，就會使滅菌失敗，這是空氣系統容易染菌的主要原因。 空氣帶菌主要包括： (1)油摻入空氣和列管式冷卻器穿孔；可采用無潤滑油活塞式空氣壓縮機和定期檢查列管式冷卻器來解決。 (2)空氣過濾器過濾介質松動、過濾介質老化、操作不當使過濾介質受潮、滅菌時被冷凝水潤濕等。可通過嚴格按操作規程操作，定期更換過濾介質和檢修過濾器來解決。 良好的發酵設備和嚴格的滅菌操作是防止染菌的先決條件。但是，單純重視技術操作而忽視技術管理，就不能取得令人滿意的防止發酵染菌的效果。 在發酵工業中普遍存在噬茵體危害，尤其在谷氨酸、酶制劑、抗生素、有機溶劑、微生物殺蟲劑和干酪、酸乳的生產中，噬菌體的污染造成嚴重的經濟損失。 此外，幾乎一些重要的發酵工業都曾先后發現噬菌體的危害。 防治措施包括以下內容。