1、2022-6-27PCT膠體金試紙制備及其原理程駿2016年6月3號2022-6-27 膠體金的概念 膠體金的特性 免疫膠體金技術介紹 PCT相關介紹 PCT膠體金試紙制備 其它2022-6-27一、膠體金的概念膠體金（colloidal gold）也稱金溶膠（gold solution）：是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構成，緊連在金核表面的是內層負離子（AuC12），外層雙層正離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態。2022-6-27二、膠體金的特性1 1、膠體性質、膠體性質 金顆粒直徑多在110

2、0nm，穩定、均勻、呈單一分散的狀態懸浮在溶液中；膠體金對電解質的敏感性，易使膠體金的穩定狀態被破壞，使單一分散的膠體金顆粒聚集成大顆粒，從溶液中沉淀下來。某些蛋白質等大分子物質具有保護膠體金、增強膠體金穩定性的作用。2022-6-272 2、呈色性、呈色性 微小顆粒膠體呈紅色，但不同大小的膠體呈色有一定的差別。最小的膠體金（25nm）是橙黃色的，中等大小的膠體金（1020nm）是酒紅色的，較大顆粒的膠體金（3080nm）則是紫紅色的2022-6-273 3、光吸收性、光吸收性 膠體金在可見光范圍內有一單一光吸收峰，這個光吸收峰的波長（max）在510550nm范圍內，隨膠體金顆粒大小而變化，

3、大顆粒膠體金的max偏向長波長，反之，小顆粒膠體金的max則偏于短波長。 膠體金的這一特性被用來檢測所配制的膠體金溶液是否符合生產所需。實驗生產需要的合格的膠體金溶液的最大吸收波長應在522528nm處，且檢測最大吸光度處吸光值與456nm處吸光度值的比值，應在1.6-1.8之間。膠體金粒徑（膠體金粒徑（nm）1%檸檬酸三鈉加入量（檸檬酸三鈉加入量（ml）膠體金特性膠體金特性呈色max162.00橙色51824.51.50橙紅522411.00紅色52571.50.70紫色5352022-6-27三、免疫膠體金技術介紹1 1、免疫膠體金技術簡介、免疫膠體金技術簡介 免疫膠體金技術(Immune

4、 colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術，英文縮寫為：GICT。 膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。 膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。 根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生

5、物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。2022-6-272 2、免疫膠體金原理、免疫膠體金原理 免疫金標記技術(Immunogold labelling techique) 主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。 膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成

6、牢固結合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。這種球形的粒子對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽綴合物等非共價結合，因而在基礎研究和臨床實驗中成為非常有用的工具。 2022-6-273、常用的免疫膠體金檢測技術常用的免疫膠體金檢測技術（1）免疫膠體金光鏡染色法（2）斑點免疫金滲濾法（3）膠體金免疫層析法 將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應

7、，再移動至固定的抗原或抗體的區域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。該法現已發展成為診斷試紙條，使用十分方便。2022-6-27四、PCT相關介紹1 1、PCTPCT簡介簡介PCT（降鈣素原，procalcitonin）是一種蛋白質，當嚴重細菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時它在血漿中的水平升高。自身免疫、過敏和病毒感染時PCT不會升高。局部有限的細菌感染、輕微的感染和慢性炎癥不會導致其升高。細菌內毒素在誘導過程中擔任了至關重要的作用。血清降鈣素(CT)的前肽物質分子量：14.5 kDa由116個氨基酸組成的糖蛋白質

8、無激素活性2022-6-272 2、PCTPCT的指征的指征 PCT是診斷和監測細菌炎性疾病感染的一個參數。 PCT的測定可以預示為：作為一個急性的參數來鑒別診斷細菌性和非細菌性感染和炎癥。 監測有感染危險的患者（如外科術后和器官移植后免疫抑制期，多處創傷后）以及需要重癥監護患者，用來探測細菌感染的全身影響或檢測膿毒性并發癥。2022-6-27正常情況CT CT 降鈣素降鈣素膿毒血癥及促炎癥細胞因子PCTPCT降鈣素原降鈣素原2022-6-27膿毒癥診斷的生物標志物An Informal Categorization of Biomarkers of Sepsis Marker Diagnos

9、is Prognosis Monitoring Procalcitonin Interleukin 6 White cell count Endotoxin C-reactive protein HLA-DR Protein C IL-10 HMG-1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 無論是對膿毒癥的診斷、預后評估及治療監測，PCT都體現出最優異的性能2022-6-273 3、PCTPCT在臨床中的意義在臨床中的意義PCT反應疾病的嚴重程度隨著疾病的進展水平持續升高在感染疾病嚴重程度的發展過程中，PCT隨著嚴重程度的不

10、同（局部感染、膿毒血癥、嚴重膿毒血癥、膿毒性休克），呈現由低到高的濃度變化。2022-6-27五、PCT膠體金試紙制備1 1、膠體金制備原理（、膠體金制備原理（氯金酸法） 氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。HAuCl4 還原劑Au原子2022-6-27試劑和濃度試劑和濃度還原劑還原劑形成膠體金的大小形成膠體金的大小1%氯金酸水溶液白磷的二乙醚溶液5nm顆粒，紅色溶膠1%氯金酸水溶液抗壞血酸水溶液12nm顆粒，紅色溶膠1%氯金酸水溶液檸檬酸三鈉水溶液15150nm顆粒，紅色溶膠不同還原劑產生的膠體

11、金這里主要談談制備2040nm金顆粒，因為這種大小的金粒最適于快速診斷測試使用。2022-6-27配置樣品墊處理液配置金標墊處理液配置膠體金粘膜配置劃膜液樣品墊處理切割噴金內包大卡組裝金標墊處理標記抗體劃膜外包入庫現場抽檢取樣送檢2022-6-272 2、配液前的準備工作以及注意事項、配液前的準備工作以及注意事項（1）由于氯金酸對金屬的強腐蝕性，因此，一切接觸氯金酸的物體都應該為非金屬材質。包括：稱量匙，以及配置膠體金時，磁力攪拌器上的溫度傳感器，以及ph計上的溫度傳感器。（2）所使用的玻璃器皿必須是清洗干凈，并且經過重鉻酸鉀和硫酸浸泡過的。浸泡前用超純水清洗干凈，用毛刷刷干凈，干燥后用重鉻酸

12、鉀和硫酸溶液浸泡24 小時以上，用清水沖洗3-4次，干燥待用。此種方法可以不需要硅化處理。如若玻璃器皿不干凈（有其他金屬離子存在或者灰塵）都將會影響金顆粒的形成，以及大小不均勻或者渾濁。2022-6-27（3）由于氯金酸的對光敏感性，因此配制膠體金的整個過程都需要避光，或者弱光，避免使用日光燈等照明設施。氯金酸長時間儲存在光下容易變成黑色，影響結果的觀察。（4）氯金酸吸濕性極強，因此綜合考慮，為了減少稱量誤差等因素，稱量時，天平室將抽濕機打開，使空氣濕度降至30左右，同時采取減量法稱量。一般情況下，拆開后盡量一次配置完。（5）配制好的1的氯金酸溶液儲存在4冰箱里，黑色塑料袋封住避光。2022-

13、6-273 3、PCTPCT膠體金試紙樣品墊處理液配置膠體金試紙樣品墊處理液配置Borax4.44gCasein0.233gPvP-102.33g膽酸1.167gS-164.66gEDTA0.7g先用30% k2CO3 溶液將PH調節到9.0然后定容至233.3ml4保存，有效期兩年注：Borax硼酸，Casein酪蛋白，PvP-10聚乙烯吡咯烷酮，S-16惰性蛋白，EDTA乙二胺四乙酸先將水加熱至60 左右，依次加入S-16，攪拌溶解，冷卻至室溫，加入Borax 、PvP-10和膽酸，因為Casein和EDTA不是很穩定，需要最后加入。在未加入k2CO3碳酸鉀調節PH前會有一些沉淀不溶解，P

14、H升高后會溶解，不需要奇怪。2022-6-274 4、PCTPCT膠體金試紙金標墊處理液配置膠體金試紙金標墊處理液配置Na2HPO48.83gBSA6.25gTriton-x1001.25gPVA6.25g先用1M的HCL調節PH至7.4然后加純水定容至1250ml4保存，有效期兩年注：BSA牛血清白蛋白，Triton-x100聚乙二醇辛基苯基醚，PVA聚乙烯醇先將水加熱至60 左右，加入Na2HPO4和PVAPVA，冷卻至室溫，最后加入BSA和Triton-x100，攪拌溶解。 2022-6-275 5、PCTPCT膠體金試紙樣品墊和金標墊處理膠體金試紙樣品墊和金標墊處理 樣品墊和金標墊的處

15、理方式一樣，都是將切割好的樣品墊（玻纖膜-有些脆，需小心）和金標墊（聚酯膜）浸泡在處理液中1小時，使其徹底濕潤。（半小時需用鑷子翻一次面） 然后將浸泡好的膜放入烘干機內37 烘干20小時（此時要記錄浸泡的膜的張數，處理液的剩余量，干燥室內的溫度和濕度），烘干后取出膜放入裝有干燥劑的鋁箔袋內備用，整個過程要在烘干箱內完成。2022-6-276 6、配置膠體金、配置膠體金準備的試劑準備的試劑：1% 氯金酸，1%檸檬酸三鈉（現配現用），超純水步驟：步驟：1、取100ml超純水于磁力攪拌器上加熱至80-90；2、加入2ml氯金酸溶液繼續加熱至沸騰（保持沸騰10s）（注意：當氯金酸溶液加入后不可以再用金

16、屬溫度傳感器，以防止損壞傳感器，污染溶液）；3、快速加入（取1%檸檬酸三鈉溶液3ml，超純水定容到10ml）上述燒瓶中，同時攪拌迅速，使其充分接觸反應，繼續加熱，直至溶液沸騰，將加熱溫度降至105-110 （待確認）保持沸騰反應10min；4、停止加熱，將燒瓶移至避光處，自然冷卻至室溫。（注意：整個過程都是避光的）2022-6-275、檢測1：待膠體金溶液冷卻至室溫，肉眼觀察膠體金溶液的顏色是不是酒紅色，是否澄清，無漂浮物或者沉淀。 檢測2：用分光光度計檢測吸光度：檢測最大吸光度值是否在525nm附近，方法是可以用光譜掃描法找到最大吸光度值波長，也可以用多波長測量法檢測525nm及其附近波長的

17、吸光度，比較大小。最大吸光度值在525nm+3nm處為合格. 檢測3：檢測最大吸光度處吸光值與456nm處吸光度值的比值，是否在1.6-1.8之間。2022-6-27影響膠體金穩定的因素：影響膠體金穩定的因素：1、操作環境和所用容器的清潔度2、配制溶液所用的水（均需使用雙蒸水或三蒸去離子水配制，燒制膠體金最好用去離子水）3、還原劑的使用量4、不同的燒制方法5、膠體金的制備量6、還原劑的加入方式7、加熱容器的大小8、加熱的時間2022-6-277 7、標記膠體金、標記膠體金1.取檢驗合格的膠體金溶液100ml,用碳酸鉀（0.2mol）調節PH至7.2-7.4（大約400ul）（先用試紙測量，再用

18、酸度計測量）室溫攪拌15min；2.加入1mg PCT鼠抗人單抗（使抗體終濃度為10ug/ml）,室溫攪拌30min；3.加入2ml 10%BSA封閉抗體,室溫攪拌30min；4.裝入2罐離心管，812000rpm離心20min；5.棄上清液，留沉淀。2022-6-27蛋白通常帶有多種電荷，當蛋白帶正電時，能與膠體金所帶的負電荷相互作用；而蛋白中的疏水氨基酸能通過疏水作用將蛋白結合至金顆粒表面；有些蛋白則可通過半胱氨酸的巰基與金顆粒共軛連接。2022-6-27pH等于或稍偏于蛋白質等電點時，蛋白質呈電中性，此時蛋白質分子于膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，但蛋白質分子的表面張力卻最大，處于一種微

19、弱的水化狀態，輕易吸附于金顆粒表明在低于蛋白質的等電點時，蛋白質帶正電荷，膠體金帶負電荷，兩者極易靜電結合形成大的聚合物pH高于蛋白質等電點時，蛋白質帶負電荷，與金顆粒的負電荷相互排斥而不能互相結合膠體金溶液PH與蛋白質結合金顆粒的關系2022-6-278 8、標記膠體金復溶標記膠體金復溶取1.5ml金標復溶液溶解沉淀，使終濃度濃縮50倍（100ml膠體金溶液），加入固體蔗糖0.1g（根據實際的殘留沉淀量來定，m=殘留沉淀V*0.2）,使終濃度達20%。溶解混勻（總體積2ml,4保存）。膠體金復溶液配置膠體金復溶液配置100mlTris0.243gBSA1.0g蔗糖20g海藻糖5gNaN3 0

20、.10.05g調節PH至8.0，定容至100ml4 保存，有效期7天注： NaN3是劇毒化學品，取用需謹慎小心。2022-6-279 9、噴金、噴金1、清洗噴金泵，清洗結束，排空清洗液，調整噴筆位置，若溶液量較多時可以循環溶液，放慢循環速度，使其中不殘留氣泡，否則影響局部噴量，使批內差增大，甚至不合格。2、若溶液量較少時采取倒吸的方式，倒吸時使速度慢，防止氣泡進入，影響噴量。3、根據金標墊的切割寬度為6mm,所以每條噴量寬度應不大于6mm，根據1.7ul/cm的噴量，保證均勻性，同時調整噴條中線的距離，方便切割。（金標墊大規格84*300mm，可以噴金七條）4、噴金結束要將噴條干燥15-17h

21、,密封保存。同時清洗泵和噴筆，使泵中留有清洗液，便于浸泡。2022-6-271010、粘膜、粘膜將25mm寬的NC膜粘在PVC底板上，注意粘膜時，粘膜位置是否對齊。NC膜是否干凈，無毛刺，無霉變2022-6-271111、配置劃膜工作液、配置劃膜工作液1、3%海藻糖溶液的配制：用已配好的PBS溶液做溶劑，配制3%海藻糖溶液（現配現用）。例：5mlPBS做溶劑，加入0.1499g海藻糖配置成3%海藻糖溶液，用玻璃棒攪拌2、劃膜工作液的配制：a:檢測線-T線（鼠抗人單抗配制 1ml 0.7mg/ml）例： b:質控線-C線（羊抗鼠多抗配制 1ml 0.9mg/ml）例：2022-6-271212、

22、劃膜、劃膜1、清洗劃膜泵，清空清洗液，循環或者倒吸劃膜液，使不要有氣泡；2、按照劃膜機標準操作規程，以“252”泵速（對應速度1ul/cm），將質控線液和檢測線液均勻地劃在膜上，檢測線劃在距膜頂端15mm0.1mm處，質控線劃在距膜頂端9mm0.1mm處，質控線與檢測線相距6mm0.1mm。（NC膜靠近吸水紙一端為頂端）3、劃膜后37度干燥17-20h，干燥后鋁箔袋封存。注意點：劃膜時注意兩劃膜線的距離是不是6mm，劃膜是否有不均勻或者段線的地方。劃膜量控制為1ul/cm。裝袋要在干燥箱中進行。2022-6-271313、切割和組裝、切割和組裝1、各組分用切割機切割成以下大小： 金標墊：6mm

23、 300mm 樣品墊：19mm300mm 吸水墊：17mm300mm2、組裝大卡：金標墊1片，搭上NC膜3-4mm ； 樣品墊1片，搭上金標墊2mm； 吸水紙1片，搭上NC膜2mm。2022-6-271414、切條、切條1、組裝環境條件的控制在相對濕度30%以下，并所有組件拆封后暴露于空氣中時間不超過2小時。2、按照切條工序作業指導書使用切條機，將組裝好的降鈣素原（PCT）檢測試劑條切割成寬度為3.42mm0.1mm試條，切條過程中應于前、后及過程中每30分鐘對切條的寬度檢查一次。17mm19mm6mm10mm6mm9mm2022-6-271515、內包、內包1 1、檢測卡的裝配、檢測卡的裝配

24、（1）按照不同規格的要求，需要進行檢測卡裝配的試紙條先把切好的試紙條裝配到完好的PVC卡中，再用壓卡機進行壓卡，裝條時應注意檢查條有無劃痕污漬，寬度是否符合要求；（2）PVC卡外觀應清潔，平整，無變形，底面配套性好，壓卡應注意調節松緊度，避免將卡壓破或變形。2 2、裝袋、裝袋將壓好的檢測卡裝入鋁箔袋中，一個鋁箔袋中應有一個檢測卡，一包干燥劑，一個滴管，印上生產批號，生產日期和有效期。2022-6-271616、外包、外包將內包好的鋁箔袋裝入包裝盒中，封膜包裝。2022-6-271717、入庫、入庫2022-6-271818、生產中的一些質控點、生產中的一些質控點1、NC膜檢測：外觀顏色：潔白，

25、光澤，膜表面，邊緣 膜寬度：25+1mm 膜厚度：185+19um;235+40 跑水性能：4cm的時間有135s和90s，偏差為+-1s,國產120+-40s 蛋白承載量試驗： 與pvc板的對比度試驗：顏色2、定量產品抗體包被硝酸纖維素膜檢測： 外觀檢查：平整、潔凈、無破損 物理檢查：c、t線 性能檢查：質控品檢查 批內差：1.7ng/ml檢查2022-6-273、（現場抽檢項）膠體金溶液檢測：外觀，最大吸收峰值，吸光度比值（最大吸收值與456nm處吸光度比值）4、（現場抽檢項）標記膠體金溶液檢測：物理檢查，OD值5、（現場抽檢項）噴金條檢測 物理檢查：表面干燥，顏色紫紅色，均勻，金條之間無

26、融合現象，斷點有標記6、（現場抽檢項）劃膜條檢測 物理檢查：表面干燥，顏色均勻，T、C線間距穩定在6mm，斷點有標記7、（取樣送檢項）定量PCT大卡組裝檢測：外觀，膜條寬度，液體移行速度，最低檢測線，陰性特異性，陽性特異性，線性范圍，準確度，批內差8、（取樣送檢項）半成品檢測：不同規格的試劑制備完成后，以PCT質控品、PCT 陽性和陰性血清樣本進行檢測，觀察試劑的性能。9、（取樣送檢項）定量PCT成品檢測2022-6-271919、相關知識、相關知識1、膜的分類標準(m和s) m: 指的是膜孔徑 換算情況大致為：8m=135s；6m=180s 2、不同秒數的膜對反應的影響 通過速度越快和包被在

27、T線的物質反應時間也就越短，讀數快，那么靈敏度也就越低。反之，反應時間長，讀數慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反應時間越長，發生非特異性結合的可能性就越大，所以過長時間的反應不一定就能夠真正的提升靈敏度。 135s一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競爭法. NCNC（硝酸纖維）膜的選擇（硝酸纖維）膜的選擇2022-6-27膠體金免疫層析試紙模式膠體金免疫層析試紙模式1、雙抗體夾心模式：疫病抗原檢測判定檢測線 質控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色2022-6-272、競爭模式：小分子物質檢測判定檢測線 質控線陽性不顯色顯色陰性顯色顯色2022-6-273、SPA/蛋白G模式：疫病抗體檢測判定檢測線 質控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色2022-6-27膠體金調整正確的膠體金調整正確的pHpH值值 膠體金與蛋白質的結合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質等電點(PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結合，因此，標記之前須將膠體金溶液的pH值調至