1、1第十二章第十二章 基因組研究技術(shù)基因組研究技術(shù)基因組研究技術(shù)的核心內(nèi)容：從不同層次上對基因基因組研究技術(shù)的核心內(nèi)容：從不同層次上對基因組全部或某一區(qū)段遺傳信息的有序性排列方式以及組全部或某一區(qū)段遺傳信息的有序性排列方式以及它們對應(yīng)功能的揭示。它們對應(yīng)功能的揭示。2第一節(jié)第一節(jié) 基因組遺傳圖譜的構(gòu)建基因組遺傳圖譜的構(gòu)建遺傳作圖（遺傳作圖（genetic mapping ）：對某個未知真核生）：對某個未知真核生物基因組中的遺傳信息（或是控制某個性狀的基因）物基因組中的遺傳信息（或是控制某個性狀的基因）在染色體上的位置和分布狀況進(jìn)行初步確定。它是在染色體上的位置和分布狀況進(jìn)行初步確定。它是采用遺傳

2、學(xué)分析方法將基因或其他采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其他DNA序列標(biāo)定在序列標(biāo)定在染色體上使之成為一條條有標(biāo)識的染色體上使之成為一條條有標(biāo)識的“公路公路”。3 經(jīng)典遺傳圖譜經(jīng)典遺傳圖譜 人們把單倍體配子所有染色體上的全部基因稱為一人們把單倍體配子所有染色體上的全部基因稱為一個基因組。基因組內(nèi)每條染色體上的連鎖基因稱為一個個基因組?；蚪M內(nèi)每條染色體上的連鎖基因稱為一個連鎖群。繪制遺傳圖譜就是要進(jìn)行每條染連鎖群。繪制遺傳圖譜就是要進(jìn)行每條染 色體上基因座色體上基因座位的順序和距離的確定，即主要通過家系分析，對不同位的順序和距離的確定，即主要通過家系分析，對不同性狀之間、性狀與標(biāo)性狀之間、性狀與標(biāo) 記

3、之間、標(biāo)記與標(biāo)記之間的連鎖遺記之間、標(biāo)記與標(biāo)記之間的連鎖遺傳頻率進(jìn)行計(jì)算，最終繪制遺傳連鎖圖。傳頻率進(jìn)行計(jì)算，最終繪制遺傳連鎖圖。 人類遺傳圖譜包括女性一種配子的人類遺傳圖譜包括女性一種配子的23條染色體條染色體(記作記作23，X)和男性兩種配子的和男性兩種配子的23條染色體條染色體(23 ，X)、(23，Y)上的所有基因位點(diǎn)。上的所有基因位點(diǎn)。4 現(xiàn)代遺傳圖譜現(xiàn)代遺傳圖譜 70年代發(fā)展起來的年代發(fā)展起來的DNA重組技術(shù)、重組技術(shù)、DNA克隆技術(shù)和克隆技術(shù)和DNA探針技術(shù)探針技術(shù)無疑為拓展遺傳圖譜的構(gòu)建途徑創(chuàng)造了技術(shù)條件，也使人類基因無疑為拓展遺傳圖譜的構(gòu)建途徑創(chuàng)造了技術(shù)條件，也使人類基因定位

4、的方法從細(xì)胞及染色體水平過渡到分子水平。定位的方法從細(xì)胞及染色體水平過渡到分子水平。DNA水平的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界標(biāo)，水平的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)作為繪制現(xiàn)代遺傳圖譜的主要界標(biāo)，大大提高圖譜的大大提高圖譜的 精確度、準(zhǔn)確性。遺傳圖譜的繪制也因此進(jìn)入了精確度、準(zhǔn)確性。遺傳圖譜的繪制也因此進(jìn)入了一個嶄新的時代。一個嶄新的時代。 現(xiàn)代遺傳圖譜的概念是由現(xiàn)代遺傳圖譜的概念是由Botstein D等等(1980)首先提出的，在此基首先提出的，在此基礎(chǔ)上，限制性片段長礎(chǔ)上，限制性片段長 度多態(tài)性度多態(tài)性RFLP作為遺傳圖譜的第一代嶄新標(biāo)作為遺傳圖譜的第一代嶄新標(biāo)記得以問世記得以問世 。遺傳

5、圖譜的第二代標(biāo)記位點(diǎn)是大量的可變數(shù)量串聯(lián)。遺傳圖譜的第二代標(biāo)記位點(diǎn)是大量的可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)（重復(fù)（VNTR)，包括微、小衛(wèi)星，包括微、小衛(wèi)星(MS)或短串聯(lián)重復(fù)或短串聯(lián)重復(fù)(STR 或或SSLP)。第三代標(biāo)記是位點(diǎn)極其豐富的單核苷酸多態(tài)性第三代標(biāo)記是位點(diǎn)極其豐富的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。 5一、遺傳作圖標(biāo)記一、遺傳作圖標(biāo)記凡是位于染色體上易于檢測識別、在不同個體之凡是位于染色體上易于檢測識別、在不同個體之間存在變異而且可以穩(wěn)定遺傳的位點(diǎn)都可以作為間存在變異而且可以穩(wěn)定遺傳的位點(diǎn)都可以作為遺傳作圖的標(biāo)記。遺傳作圖的標(biāo)記。形態(tài)標(biāo)記形態(tài)標(biāo)記分子標(biāo)記分子標(biāo)記遺傳作圖標(biāo)記遺傳作圖標(biāo)記6 形態(tài)標(biāo)記形態(tài)標(biāo)

6、記在經(jīng)典遺傳學(xué)中，每個相對性狀都由一個不同的等位在經(jīng)典遺傳學(xué)中，每個相對性狀都由一個不同的等位基因（基因（allele）控制。但這些可見的表型性狀十分有限，）控制。但這些可見的表型性狀十分有限，當(dāng)多個基因影響同一個性狀時，精細(xì)的遺傳作圖分析當(dāng)多個基因影響同一個性狀時，精細(xì)的遺傳作圖分析則陷入困境。因此，要構(gòu)建高分辨率的遺傳圖，就必則陷入困境。因此，要構(gòu)建高分辨率的遺傳圖，就必須有數(shù)量極其豐富的遺傳標(biāo)記。須有數(shù)量極其豐富的遺傳標(biāo)記。每一段具有專一遺傳性狀和功能的每一段具有專一遺傳性狀和功能的 D NA被稱為基因。一對染被稱為基因。一對染色體中兩條染色單體上相同位置的色體中兩條染色單體上相同位置的

7、 D NA片段，就是一對片段，就是一對等位等位基因基因。每對等位基因的性狀有顯性和隱性之分。每對等位基因的性狀有顯性和隱性之分。擬等位基因擬等位基因(pseudoalleles)：表型效應(yīng)相似：表型效應(yīng)相似,功能密切相關(guān)功能密切相關(guān),在染在染色體上的位置又緊密連鎖的基因。它們象是等位基因色體上的位置又緊密連鎖的基因。它們象是等位基因,而實(shí)際不而實(shí)際不是等位基因。是等位基因。7 分子遺傳標(biāo)記（分子遺傳標(biāo)記（DNA標(biāo)記）標(biāo)記）凡是滿足遺傳標(biāo)記特征的一段凡是滿足遺傳標(biāo)記特征的一段DNA序列都可以被發(fā)展成為序列都可以被發(fā)展成為DNA標(biāo)記，標(biāo)記，DNA標(biāo)記所在的遺傳位點(diǎn)必須有不同等位基因，標(biāo)記所在的遺傳

8、位點(diǎn)必須有不同等位基因，特定個體相應(yīng)的基因型可以通過實(shí)驗(yàn)手段很容易檢測出來。特定個體相應(yīng)的基因型可以通過實(shí)驗(yàn)手段很容易檢測出來。由于由于DNA標(biāo)記類型豐富，數(shù)量眾多，因而已經(jīng)成為遺傳作圖標(biāo)記類型豐富，數(shù)量眾多，因而已經(jīng)成為遺傳作圖的主要工具。的主要工具。 分子遺傳標(biāo)記分子遺傳標(biāo)記是指利用分子生物學(xué)的方法來區(qū)分不同的個是指利用分子生物學(xué)的方法來區(qū)分不同的個體或群體體或群體,并且可以穩(wěn)定遺傳的物質(zhì)或性狀并且可以穩(wěn)定遺傳的物質(zhì)或性狀,是生物個體或群是生物個體或群體間遺傳差異的客觀表征。廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并體間遺傳差異的客觀表征。廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測的可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。

9、序列或蛋白質(zhì)。8 限制性片段長度多態(tài)性限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism , RFLP）定義：就是用定義：就是用限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶降解從生物中提取的降解從生物中提取的總總DNA，經(jīng)凝膠，經(jīng)凝膠電泳分離這些降解的小片段，再通過電泳分離這些降解的小片段，再通過southern印跡轉(zhuǎn)移到濾膜上，印跡轉(zhuǎn)移到濾膜上，然后用放射性標(biāo)記的探針與濾膜上的然后用放射性標(biāo)記的探針與濾膜上的DNA雜交，洗去多余的雜交雜交，洗去多余的雜交探針，永久性濾膜經(jīng)放射性自顯影就可發(fā)現(xiàn)與探針雜交的探針，永久性濾膜經(jīng)放射性自顯影就可發(fā)現(xiàn)與探針雜交的DNA限

10、限制性片段。不同的限制性內(nèi)切酶，不同來源的制性片段。不同的限制性內(nèi)切酶，不同來源的DNA及標(biāo)記的探針及標(biāo)記的探針就會有不同的結(jié)果組合，利用這些不同的組合就可以構(gòu)建就會有不同的結(jié)果組合，利用這些不同的組合就可以構(gòu)建RFLP分子標(biāo)記圖譜。簡單地說就是分子標(biāo)記圖譜。簡單地說就是DNA經(jīng)限制性酶切后產(chǎn)生的經(jīng)限制性酶切后產(chǎn)生的DNA片段組成狀態(tài)，涉及片段的多少和大小。對不同的物種來說，相片段組成狀態(tài)，涉及片段的多少和大小。對不同的物種來說，相當(dāng)于形成了由當(dāng)于形成了由DNA片段多態(tài)性組成的指紋。片段多態(tài)性組成的指紋。RFLP是第一種被用是第一種被用于作圖研究的于作圖研究的DNA標(biāo)記。標(biāo)記。9用用RFLP進(jìn)

11、行基因定位原理：進(jìn)行基因定位原理： EcoR I 例：例：GAATTC 切點(diǎn)減少切點(diǎn)減少 GAGTTC CTTAAG 切點(diǎn)增加切點(diǎn)增加 CTCAAG mRNA: GAA GAG 谷谷aa 谷谷aa優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：高效、可靠、可在一個反應(yīng)內(nèi)檢測大量的限制性片段；高效、可靠、可在一個反應(yīng)內(nèi)檢測大量的限制性片段；缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：需用同位素或非同位素標(biāo)記引物，較費(fèi)時、耗材而且單個需用同位素或非同位素標(biāo)記引物，較費(fèi)時、耗材而且單個探針位點(diǎn)少，鑒別效率不高。探針位點(diǎn)少，鑒別效率不高。10ABAB限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與放射性探針結(jié)合部位限制性內(nèi)切酶酶切后；電泳分離DNA片段；轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜；與放射性探針雜交，分析

12、陽性條帶11 簡單序列長度多態(tài)性簡單序列長度多態(tài)性 ( simple sequence length polymorphism , SSLP）產(chǎn)生于重復(fù)順序的可變排列，同一位點(diǎn)重復(fù)順序的重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生于重復(fù)順序的可變排列，同一位點(diǎn)重復(fù)順序的重復(fù)次數(shù)不同表現(xiàn)出序列的長度變化。不同表現(xiàn)出序列的長度變化。小衛(wèi)星序列：小衛(wèi)星序列：重復(fù)單位的長度為數(shù)十個核苷酸。重復(fù)單位的長度為數(shù)十個核苷酸。微衛(wèi)星序列：微衛(wèi)星序列：重復(fù)單位的長度為重復(fù)單位的長度為16個核苷酸，有個核苷酸，有10 50個重復(fù)個重復(fù)單位串聯(lián)組成。分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具單位串聯(lián)組成。分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具

13、有較高的多態(tài)性。目前微衛(wèi)星有較高的多態(tài)性。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了萬余個位點(diǎn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了萬余個位點(diǎn)。12TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG微衛(wèi)星微衛(wèi)星DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果（示例）：擴(kuò)增結(jié)果（示例）：500bp400bp300bp240bp 該結(jié)果顯示在所檢查的人群中，該位點(diǎn)多態(tài)性有該結(jié)果顯示在所檢查的人群中，該位點(diǎn)多態(tài)性有4種。種。13SSR標(biāo)記的主要特點(diǎn)標(biāo)記的主要特點(diǎn):（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個基因組；）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個基因組；（2）具有較多的等位性變異；）具有較多的

14、等位性變異；（3）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，）由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。 14 單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphism , SNP）1. 定義定義 單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指在基因組水平上由單主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)

15、性。序列多態(tài)性。不同個體間，基因組不同個體間，基因組DNA某部位的單核苷酸的變異。某部位的單核苷酸的變異。1996年，年，Lander報(bào)道了用報(bào)道了用SNP制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標(biāo)記。制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標(biāo)記。152. SNP在人類基因組中出現(xiàn)的頻率在人類基因組中出現(xiàn)的頻率 SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每在人類基因組中廣泛存在，平均每5001000個堿個堿基對中就有基對中就有1個，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)個，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)1700萬個甚至更多。萬個甚至更多。 There is one SNP in every 1000 bases leads to an estimate that an

16、y two individuals differ by up to three million SNPs. 在基因組在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的列上?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(cSNP)比較少，因?yàn)樵诒容^少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的外顯子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。的研究更

17、受關(guān)注。163. SNP檢測方法檢測方法 根據(jù)根據(jù)DNA列陣的微測序法；列陣的微測序法；動態(tài)等位基因特異的雜交；動態(tài)等位基因特異的雜交；寡聚核苷酸特異的連接；寡聚核苷酸特異的連接； DNA芯片以及芯片以及TaqMan系統(tǒng)等。系統(tǒng)等。但不管哪一種方法，首先必須進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，但不管哪一種方法，首先必須進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，然后才能進(jìn)行其它檢測。然后才能進(jìn)行其它檢測。174. SNP用作遺傳標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)用作遺傳標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計(jì)出來。因頻率都可估計(jì)出來。它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。它在基

18、因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)相比，與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)相比，SNP是高度穩(wěn)定的，尤其是高度穩(wěn)定的，尤其是處于編碼區(qū)的是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對人而前者的高突變率容易引起對人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。群的遺傳分析出現(xiàn)困難。部分位于基因內(nèi)部的部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)可能會直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機(jī)制構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)。的候選改變位點(diǎn)。易于進(jìn)行自動化分析，縮短了研究時間。易于進(jìn)行自動化分析，縮短了研究時間。18日本學(xué)者發(fā)

19、現(xiàn)糖尿病基因的個人日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)糖尿病基因的個人SNP差別差別日本研究人員最近經(jīng)日本研究人員最近經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿過研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病有關(guān)的基因并不是病有關(guān)的基因并不是千篇一律，它們之間千篇一律，它們之間存在著個人差別，即存在著個人差別，即“單核苷酸多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性”（SNP）。）。 19預(yù)計(jì)今后預(yù)計(jì)今后SNP將在下列領(lǐng)域發(fā)揮重要作用：將在下列領(lǐng)域發(fā)揮重要作用：(1)進(jìn)行簡單和復(fù)雜疾病的遺傳連鎖分析進(jìn)行簡單和復(fù)雜疾病的遺傳連鎖分析(linkage analysis)及關(guān)聯(lián)及關(guān)聯(lián)分析分析(association analysis),用于疾病易感基因定位；而且其定位用于疾病易感基因定位；而且其

20、定位的精度將比微衛(wèi)星標(biāo)記精細(xì)得多，可直接用于指導(dǎo)易感基因克的精度將比微衛(wèi)星標(biāo)記精細(xì)得多，可直接用于指導(dǎo)易感基因克隆。隆。(2)在在“”(pharmacogenomics)研究中，可通過檢研究中，可通過檢測測SNP的遺傳多態(tài)性標(biāo)記揭示人群中不同個體對不同藥物的敏的遺傳多態(tài)性標(biāo)記揭示人群中不同個體對不同藥物的敏感性差異的根本原因。感性差異的根本原因。(3)也可用于法醫(yī)研究的罪犯身份的鑒別、親子鑒定等，此外在也可用于法醫(yī)研究的罪犯身份的鑒別、親子鑒定等，此外在器官移植中供體和受體間的配對選擇及物種進(jìn)化的研究中都將器官移植中供體和受體間的配對選擇及物種進(jìn)化的研究中都將具有重要意義。具有重要意義。20二

21、、遺傳作圖的方法二、遺傳作圖的方法、遺傳作圖的遺傳學(xué)原理、遺傳作圖的遺傳學(xué)原理 遺傳圖繪制主要依據(jù)的是經(jīng)典的孟德爾遺傳學(xué)的連鎖和交換遺傳圖繪制主要依據(jù)的是經(jīng)典的孟德爾遺傳學(xué)的連鎖和交換定律。減數(shù)分裂時，同源染色體彼此靠攏，同源區(qū)段并排形成雙定律。減數(shù)分裂時，同源染色體彼此靠攏，同源區(qū)段并排形成雙聯(lián)體。在雙聯(lián)體中，并列的染色體臂在等價的位置聯(lián)體。在雙聯(lián)體中，并列的染色體臂在等價的位置DNA交換或交換或DNA重組。因交換的頻率與在染色體上所間隔的距離成正比，重重組。因交換的頻率與在染色體上所間隔的距離成正比，重組率則可成為衡量基因之間相對距離的尺度。通過重組率可判斷組率則可成為衡量基因之間相對距離

22、的尺度。通過重組率可判斷基因在染色體上的相對位置，從而繪制遺傳圖。基因在染色體上的相對位置，從而繪制遺傳圖。、不同模式生物的連鎖分析、不同模式生物的連鎖分析 對于不同的模式生物可采用有性雜交實(shí)驗(yàn)連鎖分析以及系譜對于不同的模式生物可采用有性雜交實(shí)驗(yàn)連鎖分析以及系譜分析作圖進(jìn)行遺傳作圖。對于細(xì)菌來說由于不發(fā)生減數(shù)分裂，可分析作圖進(jìn)行遺傳作圖。對于細(xì)菌來說由于不發(fā)生減數(shù)分裂，可通過使通過使DNA片段從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞的頻率來測定遺傳片段從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞的頻率來測定遺傳距離，如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合轉(zhuǎn)移。距離，如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合轉(zhuǎn)移。21第二節(jié)基因組物理圖譜的構(gòu)建第二節(jié)基因組物理圖譜的構(gòu)建

23、一、限制性作圖一、限制性作圖在基因組上標(biāo)定限制性酶切位點(diǎn)的相對位置。主要適合對在基因組上標(biāo)定限制性酶切位點(diǎn)的相對位置。主要適合對小基因組的原核生物和大片段進(jìn)行限制性位點(diǎn)分析。小基因組的原核生物和大片段進(jìn)行限制性位點(diǎn)分析。22二、二、DNA大片段重疊克隆的基因組作圖大片段重疊克隆的基因組作圖重疊克隆的基因組作圖重疊克隆的基因組作圖是先構(gòu)建基因組的大片段基因文庫，然后是先構(gòu)建基因組的大片段基因文庫，然后根據(jù)克隆片段之間的重疊順序構(gòu)建重疊群，從而繪制物理連鎖圖。根據(jù)克隆片段之間的重疊順序構(gòu)建重疊群，從而繪制物理連鎖圖。覆蓋基因組某一區(qū)域的若干具有一定重疊的覆蓋基因組某一區(qū)域的若干具有一定重疊的DNA

24、區(qū)段所組成的片區(qū)段所組成的片段群，稱為段群，稱為重疊群重疊群。描述代表完整染色體片段的大片段重疊克隆的排列順序的圖譜稱描述代表完整染色體片段的大片段重疊克隆的排列順序的圖譜稱為為重疊群圖譜重疊群圖譜。23三、熒光標(biāo)記原位雜交作圖三、熒光標(biāo)記原位雜交作圖熒光標(biāo)記原位雜交是通過熒光標(biāo)記的探針與染色體雜交，從而確熒光標(biāo)記原位雜交是通過熒光標(biāo)記的探針與染色體雜交，從而確定分子標(biāo)記在染色體上的實(shí)際物理位置。在細(xì)胞分裂中期染色體定分子標(biāo)記在染色體上的實(shí)際物理位置。在細(xì)胞分裂中期染色體處于高度濃縮狀態(tài)，有可分辨的染色體帶型及明顯的著絲粒位置，處于高度濃縮狀態(tài)，有可分辨的染色體帶型及明顯的著絲粒位置，通過測定

25、原位雜交所顯示的熒光信號所處的位置與染色體短臂末通過測定原位雜交所顯示的熒光信號所處的位置與染色體短臂末端的相對距離，經(jīng)過比例換算可將分子標(biāo)記標(biāo)定在連鎖圖上。端的相對距離，經(jīng)過比例換算可將分子標(biāo)記標(biāo)定在連鎖圖上。簡單地說，就是利用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與抗原標(biāo)記簡單地說，就是利用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與抗原標(biāo)記的探針分子特異性的結(jié)合來檢測的探針分子特異性的結(jié)合來檢測DNA序列在染色體上的位置。序列在染色體上的位置。24原位雜交技術(shù)的基本步驟：原位雜交技術(shù)的基本步驟： 制備探針；制備探針； 染色體制片；染色體制片； 染色體處理與變性；染色體處理與變性； 染色體與探針雜交；染色體與探針

26、雜交； 顯微檢測。顯微檢測。25熒光標(biāo)記探針熒光標(biāo)記探針檢測精子檢測精子染色體專一位點(diǎn)探針染色體專一位點(diǎn)探針26四、序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖四、序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖通過序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖通過PCR或分子雜交將序列標(biāo)簽小或分子雜交將序列標(biāo)簽小段段DNA序列在基因組序列在基因組DNA中進(jìn)行定位?？捎糜跇?gòu)建最中進(jìn)行定位?？捎糜跇?gòu)建最為詳細(xì)的大基因組物理圖。為詳細(xì)的大基因組物理圖。序列標(biāo)簽位點(diǎn)是一小段長度在序列標(biāo)簽位點(diǎn)是一小段長度在100-500bp的單拷貝的單拷貝DNA序列，序列，當(dāng)當(dāng)DNA大片段含有同一大片段含有同一STS序列時，說明這兩個片段彼此重疊，序列時，說明這兩個片段彼此重疊，根據(jù)重疊關(guān)

27、系可以逐段繪制根據(jù)重疊關(guān)系可以逐段繪制DNA的物理圖。的物理圖。27第三節(jié)基因組測序（略）第三節(jié)基因組測序（略）第四節(jié)基因組功能分析第四節(jié)基因組功能分析28一、鑒定基因組序列中的基因一、鑒定基因組序列中的基因、通過序列分析查找基因、通過序列分析查找基因 尋找基因的開放閱讀框（尋找基因的開放閱讀框（open reading frame ）;該方法對簡單的細(xì)菌基因組很有效。該方法對簡單的細(xì)菌基因組很有效。 通過網(wǎng)上序列比對，尋找基因的同源性。通過網(wǎng)上序列比對，尋找基因的同源性。292 2、基因確定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、基因確定的實(shí)驗(yàn)技術(shù) 分子雜交檢驗(yàn)?zāi)骋黄问欠窈斜磉_(dá)序列分子雜交檢驗(yàn)?zāi)骋黄问欠窈斜磉_(dá)序

28、列 cDNA測序有助于基因鑒定測序有助于基因鑒定 確定轉(zhuǎn)錄本末端確定轉(zhuǎn)錄本末端 異源雙鏈分析異源雙鏈分析 外顯子捕獲（外顯子捕獲（exon trapping）外顯子捕獲尋找外顯子時需要一個有兩個已知外顯子及插入其中的一個內(nèi)外顯子捕獲尋找外顯子時需要一個有兩個已知外顯子及插入其中的一個內(nèi)含子組成小基因含子組成小基因 載體，且第一個外顯子前面有真核啟動子。將所研究的基載體，且第一個外顯子前面有真核啟動子。將所研究的基因組因組DNA片段插入載體內(nèi)含子區(qū)域，然后導(dǎo)入合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，轉(zhuǎn)錄片段插入載體內(nèi)含子區(qū)域，然后導(dǎo)入合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的產(chǎn)生的RNA再進(jìn)行剪切。如果將大量基因組片段插入該載

29、體中構(gòu)建成外顯再進(jìn)行剪切。如果將大量基因組片段插入該載體中構(gòu)建成外顯子捕獲文庫，將文庫表達(dá)后利用上述引物進(jìn)行子捕獲文庫，將文庫表達(dá)后利用上述引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得大量片段擴(kuò)增獲得大量片段并測序，理論上可以確定出一個基因組上所有的外顯子序列。并測序，理論上可以確定出一個基因組上所有的外顯子序列。30二、基因功能的確定二、基因功能的確定1 1、利用生物信息學(xué)分析基因功能、利用生物信息學(xué)分析基因功能就是以同源檢索為基礎(chǔ)，通過把待鑒定的就是以同源檢索為基礎(chǔ)，通過把待鑒定的DNA序列或氨序列或氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中所有的已知序列進(jìn)行比較所獲得的相基酸序列與數(shù)據(jù)庫中所有的已知序列進(jìn)行比較所獲得的相似性來發(fā)現(xiàn)新基因和推測相應(yīng)的功能。似性來發(fā)現(xiàn)新基因和推測相應(yīng)的功能。31 基因失活（基因敲除）基因失活（基因敲除） 基因超量表達(dá)探索基因功能基因超量表達(dá)探索基因功能 基因編碼的蛋白質(zhì)功能的深入研究基因編碼的蛋白質(zhì)功能的深入研究2、用實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能、用實(shí)驗(yàn)分析確定基因功能反向遺傳學(xué)：反向遺傳學(xué)：獲得基因組序列之前研究基因功能是從表型開始，獲得基因組序列之前研究基因功能是從表型開始，確定控制表型相關(guān)確定控制表型相關(guān) 基因及其序列，但到獲得基因組序列之后則基因及其序列，但到獲得基因組序列之后則需要從未知功能的基因序列開始，確定它對應(yīng)的功能和相關(guān)