1、南昌大學教學檔案課程名稱： 生物工藝原理 學院： 生命科學與食品工程學院教師姓名： 熊濤 職稱： 教授 教學課時安排內容體系教學內容課時生物過程原理第一章 生物技術概論2第二章 菌種來源，生物活性物質的篩選和菌和保藏2第三章 新技術育種原理及其進展3第四章 基因工程原理3第五章 代謝調控4第六章 培養基2第七章 種子擴大培養2第八章 培養技術過與過程建模2第九章 發酵工藝監控2第十章 酶與細胞的固定化技術及其應用2第十一章 蛋白質組學及其在微生物研究中的應用4第十二章 動物細胞培養2第十三章 植物細胞培養2生物物質分離和純化原理第十四章 下游加工過程概論2第十五章 發酵液的預處理和固液分離方法

2、4第十六章 細胞破碎與非選擇性蛋白分離3第十七章 沉淀法2第十八章 膜分離過程4第十九章 溶劑萃取，兩水相萃取法4第二十章 離子交換法3第二十一章 吸附法與色層分離4第二十二章 電泳分離法4第二十三章 結晶與干燥2合計64課程教材：儲炬、李友榮主編，現代生物工藝學（上冊），華東理東大學出版社，2007主要參考書：1 陳代杰, 朱寶泉. 工業微生物菌種選育與發酵控制技術. 上海: 科學技術文獻出版社, 1995.2 美C.賈德森.金. 分離過程. 北京：化學工業出版社，19903 劉茉娥等. 新型分離技術基礎. 杭州：浙江大學出版社，19934 王學松. 膜分離技術及其應用. 北京：科學出版社，

3、19945 陸九芳等. 分離過程化學. 北京：清華大學出版社，19946 劉國詮. 生物工程下游技術.北京： 化學工業出版社, 2003. 7 Weather L R. Engineerin Processes for Bioseparation. London: Butterworth-Heineman, 1994第一部分 生物過程原理（共32學時）第一章 緒論教學基本要求：使學生掌握生物工藝學的定義，特點，生物技術概念的范疇，了解生物技術的發展及應用概況，了解生物技術在各個領域的應用及發展趨勢，激發學生學習生物工藝原理的興趣。教學內容：1.1 生物技術的定義 1919年匈牙利艾里基提出：“

4、凡是以生物機體為原料，無論其用何種生產方法進行產品生產的生物技術”都屬于生物技術； 20世紀70年代末，80年代初提出的定義傾向于：必須采用基因工程等一類具有現代生物技術內涵或以分子生物學為基礎的技術； 國際經濟合作與發展組織（IECDO）在1982年提出定義：應用自然科學和工程學的原理，依靠生物作用劑的作用，將物料進行加工以提供產品或用以為社會服務的技術； 在國際經濟合作與發展組織（IECDO）提出生物技術定義的特點：生物作用劑：指從活的或死的微生物、動物或植物的機體、組織、細胞、體液以致分泌物以及上組分中提取出來的生物催化劑酶或其他生物活性物質；提供的產品：可以是工業、農業、醫藥、食品等產

5、品；被作用的物料：可以是有關的生物機體或其中的有關器官，如細胞、體液以及極少量必須的無機物質；應用的自然科學：可以是生物學、化學、物理學等以及相關的分支學科，交叉學科；應用的工程學：可以是化學工程、機械工程、電氣工程、電子工程；1.2 生物技術的發展及應用概況生物技術的發展分為四個時期：經驗生物技術時期；近代生物技術的形成和發展時期；近代生物技術的全盛時期，現代生物技術的建立和發展時期；1.2.1 經驗生物技術時期 （人類出現到19世紀中期）生物技術的發展和利用可以追溯到1000多年（甚至4000多年）以前如酒類的釀造，豆糧輪作的方法等，主要產品有果酒、酸奶、啤酒、大豆釀醬油，多種植物配制劑麻

6、沸散等。經驗生物技術時期的技術為其后生物技術相關理論的建立創造了條件。1.2.2 近代生物技術建立時期 （19世紀中期至20世紀40年代）這一時期的誕生是與顯微鏡的誕生和微生物的發展以及微生物學的問世密切相關的。20世紀初，人們發現某些梭菌能夠引起丙酮、丁醇的發酵，隨之引發了一系列初級代謝產物的生產。這一時期是人類有意識地利用某些微生物進行生產的時期， 這一時期的發酵產物的特點：都屬于微生物形成的初級代謝產物，發酵以厭氧發酵居多，發酵產品主要為某些有機溶劑。這一時期進行大規模生產的發酵產品有乳酸、酒精、面包酵母、檸檬酸和蛋白酶等。1.2.3 近代生物技術全盛時期 （20世紀40年代至20世紀7

7、0年代末）1929年Flemming發現了青霉素，從此生產技術產品中增加一大類新的產品抗生素。第二次世界大戰促進許多科學家和工程師齊心協力，攻克許多難關，實現了青霉素的工業化生產。20世紀40年代，抗生素工業成為生物發酵工業技術的支柱產業。這一時期生物技術的發展主要成就有：青霉素的發現及其開發概況、酶反應過程和生物轉化的過程的開發概況等，為基因工程的建立和新的生物技術時期的來臨創造條件。區分初級代謝產物和次級代謝產物初級代謝產物：指微生物處于對數生長期所形成的產物，主要是與細胞生長有關的產物，如氨基酸、核酸、蛋白質、碳水化合物以及能量代謝有關的副產品，如乙醇、丙酮、丁醇等。次級代謝產物：次生代

8、謝物的產生與產生這種產物的微生物本身的生長和生命活動并不是密切相關的，它們一般產生于微生物生長的穩定期，他們的結構往往非常復雜。1.2.4 現代生物技術建立和發展時期 （20世紀70年代末開始）現代生物技術時期是以分子生物學的理論為先導，基因工程的技術開始能作為生物技術新產品的一種開發手段或關鍵技術后算起的。80年代以來，隨著重組DNA技術的發展，人們可以按人類社會的需要，定向培養出有用的菌株，這為發酵工程技術引入了遺傳工程的技術，使生物技術進入了一個新的階段。基因工程的應用首先集中于許多多肽或蛋白質的生化藥物中，如胰島素、干擾素等。這一時期生物技術的發展主要有：單克隆抗體的發展和應用；動、植

9、物細胞培養技術的應用；雜交技術在動植物生產中的應用；轉基因植物和動物的研究和開發，克隆動物的發展及取得的成就等方面。1.3 生物技術的發展趨勢1.3.1. 深入開展人類后基因組學的研究，逐步掌握人類生、老、病、死的自然規律有關后基因組學的研究概括講就是：首先要將完成圖的堿基對序列中所有的基因識別出來，其次要鑒別每一個基因的生物化學結構和性質，最后要搞清所有基因與人類生、老、病、死的關系。后基因組學的研究主要包括：結構基因組學、功能基因組學、蛋白質組學。1.3.2. 逐步深入的開展基因診斷和基因治療研究基因診斷是通過基因工程的手段對生物體的基因組DNA片段及其轉錄產物進行定性和定量分析；基因治療

10、是以正常基因通過病毒載體原位轉入病人體內以取代原來缺陷或病變的基因，也可以是使原來喪失表達能力或使原來喪失表達能力或使機體產生免疫基因已達到抗腫瘤、抗病毒的目的。1.3.3 加強各種生物技術新藥物的研究開發加強對重組激素、重組細胞因子、從足溶血栓物質、治療性抗體的研究開發。1.3.4. 人類干細胞培養或胚胎工程的發展人類干細胞可分為兩類：全能性干細胞和多能性干細胞；前者能發育成完整的個體，后者只能發育成人體某一臟器或組織，如肝臟、腎臟、心臟或骨胳、皮膚、肌肉等。人類胚胎干細胞來自早期胚胎，這些全能型干細胞后來發育成多能性干細胞。1.3.5 轉基因動物的發展，克隆動物的發展成就轉基因動物是通過基

11、因工程手段獲得在基因中整合了外源基因的動物。克隆動物是指通過無性繁殖的手段復制而誕生的動物，其外形和生理性狀均與其供體細胞相同的動物。1.3.6 加速對人類功能基因的研究開發由于功能基因對人類的健康以及藥物研究開發的關系密切，因此各國科學家相互爭先把已知的功能基因進行相當深入的研究以獲得發明專利權。1.3.7 基因農作物為農作物方面的發展前景轉基因農作的重點發展方向是：抗蟲害的轉基因農作物；尋找新的抗病毒基因并將其轉入一些重要農作物中；抗干旱、抗鹽堿、抗重金屬、抗水澇、抗寒凍等的轉基因農作物；1.3.8 加強與環境保護學科的合作研究主要集中在對環境污染的生物治理。 1.3.9 積極開展海洋生物

12、技術的研究1.3.10 大力發展與生物技術相關的工程技術學科的研究第二章 菌種來源教學基本要求：使學生掌握典型微生物新種分離篩選過程，微生物選擇性分離的原理和發展，并了解常見的工業微生物及其用途。教學內容：2.1 微生物的特點 微生物的資源非常豐富，廣泛分布于土壤，水和空氣中，尤其土壤中最多。 有的微生物從自然界中分離出來就能被利用，有的需要對分離到的微生菌種進行人工誘變，得到突變株才能被利用。 微生物的特點是：種類多，分布廣；生長迅速，繁殖速度快；代謝能力強；適應性強，容易培養。2.2 常見的工業微生物2.2.1 細菌工業常用細菌有：枯草芽孢桿菌，醋酸桿菌，棒狀桿菌，端桿菌等； 用途：用于生

13、產淀粉酶，乳酸，氨基酸和肌苷等。2.2.2 酵母菌工業常用酵母菌有：啤酒酵母，假絲酵母，類酵母等。用途：釀酒，制造面包，生產脂肪酶以及生產可食用，藥用和飼料用酵母菌蛋白等。2.2.3 霉菌 工業常用霉菌有：藻狀菌綱的根霉，毛霉，犁頭霉，子囊霉綱的紅曲霉，半知菌類的曲霉，青霉等。 用途：多種酶制劑，抗生素，有機酸及輜體激素等。2.2.4 放線菌 工業常用放線菌有：鏈霉菌屬，小單孢菌屬和諾長菌屬等。 用途：產生抗生素，微生物中發現的抗生素，有60%來自放線菌。2.2.5 擔子菌 通常所說的菇類微生物。 用途：多糖，橡膠物質和抗癌藥物的開發。2.2.6 藻類 自然界分布極廣的一類自養微生物。 人類保

14、健食品和飼料，（螺旋藻）環境治理，產生能源。2. 3 典型的微生物新種分離篩選過程分離微生物新種的具體過程大體可分為采樣、增殖、純化和性能測定等步驟，如下圖所示。2.4 微生物選擇性分離的原理和發展在過去的半個世紀里曾篩選出許多產生新的有用的刺激代謝產物的菌種，這些菌種多半是利用經驗式的篩選方法獲得的。大多數的抗生素均由放線菌綱產生。下面介紹以放線菌為主的分離方法原理的發展。選擇性分離方法大致分為五個步驟：含微生物材料的選擇；材料的預處理；所需菌種的分離；菌種的培養；菌種的選擇和純化。以上任何一個階段都可以引入選擇壓力。2.4.1 微生物材料的選擇在選擇菌種來源時，存在以下一些標準： 對于天然

15、材料，如土壤的選擇，來源越是廣泛的樣品，含有目的微生物的可能性就越大，越有可能獲得新的菌種；可尋找已適應相當苛刻的環境壓力的微生物類群；在酸性土壤圈的放線菌類群與緊接下層的中性圈的放線菌類群有很大的不同；自然環境的菌群可因為人類活動而改變；更新的生態環境有待于進一步開發。2.4.2 材料的預處理為了提高菌種的分離效果，人們設計了各種處理材料的方法，有物理方法、化學方法和生物方法。物理方法：加熱，過路，離心，沉淀池中攪拌。化學方法：加幾丁質或碳酸鈣提高PH。誘餌法：花粉，蛇皮，人的頭發，涂石蠟的棒。2.4.3 所需菌種的分離所需菌種的分離效率取決于分離培養基的養分、pH和加入的選擇性抑制劑。一般

16、憑經驗而不是絕對的選擇。培養基養分：幾丁質（用來分離土壤或水中的放線菌），淀粉羅素（和幾丁質相類同），M3群脂(阻滯鏈霉素的生長，容易分離到其他霉菌)。PH值： (1) 6.77.5之間（大多數放線菌，嗜中型） (2) 4.55.0（嗜酸性） (3) 6.16.8（嗜堿性)選擇抑制劑：抗細菌抗生素，抗真菌抗生素；分離培養基中加入抗生素。2.4.4 菌種的培養溫度，時間兩方面主要變量為時間。放線菌平板通常在25-30； 嗜熱菌通常在45-55； 嗜冷菌通常在4-10； 在此三者中可加入時間變量。分離嗜溫菌如鏈霉菌和小單胞菌一般培養714天；嗜熱菌如高溫放線菌只需12天。有時培養時間短會漏掉一些新

17、的和不尋常的菌種，因此有人在30和40將培養時間延長1個月，結果分離出一些不尋常的種屬。2. 5 重要工業微生物的分離篩選具有潛在工業應用價值的微生物的第一個階段是分離，分離是指獲得純的或混合的培養物。接著篩選出那些能產生所需產物或具有某種生化反應的菌種。在篩選所需菌種時宜考慮：（1）菌的營養特性；（2）菌的生長溫度，應選擇溫度高于40的菌種；(3)菌對所采用的設備和生產過程的適應性；（4）菌的穩定性；（5）菌的產物的率；（6）容易從培養液中回收產物。理想的分離步驟是從土壤環境開始的，土壤中富于各種分離的菌。設計的分離步驟應有利于具有工業重要特征的菌的生長。2. 5.1 施加選擇壓力的分離方法

18、 富集液體培養只能增加混合菌群中所需菌株數量的一種技術。方法的原理是：給混合菌群提供一些有利于所需菌種生長或不利于其他菌型生長的條件。供給特殊基質或加入某些抑制劑。液體培養（分批富集，連續富集） 固體培養基的使用常用于分離某些酶產生菌，其選擇培養基中常含有所需的基質，以便促進酶產生菌的生長。2. 5.2 隨機分離方法有些微生物的產物對產生菌的篩選沒有任何選擇性優勢，可以用采用隨機分離法獲得所需菌種。隨機分離法發展了一些快速篩選方法和歸納出高產培養基成分的選擇性準則如下：1 制備一系列培養基，其中有各種類型的養分成為生長限制因素；2 使用一聚合或復合形式的生長限制養分；3 避免使用容易同化的碳；

19、4 確定含有所需的輔因子， 加入緩沖液以減少pH變化。 例如：抗生素產生菌的篩選；藥理活性化合物的篩選；生長因子產生菌的篩選；多糖產生菌的篩選。第三章 新技術育種原理及其進展教學基本要求：使學生掌握幾種常用的工業微生物育種方法。教學內容：3.1 重要工業微生物的分離篩選具有潛在工業應用價值的微生物的第一個階段是分離，分離是指獲得純的或混合的培養物。接著篩選出那些能產生所需產物或具有某種生化反應的菌種。3.1.1理想工業微生物應具備的條件（1）遺傳性狀穩定；（2）生長速度快，不易被噬菌體等污染；（3）目標產物的產量盡可能接近理論轉化率； （4）目標產物最好能分泌到胞外，以降低產物抑制并利 于產物

20、分離； （5）盡可能減少產物類似物的產量，以提高目標產物的產量及利于產物分離； （6）培養基成分簡單、來源廣、價格低廉； （7）對溫度、pH、離子強度、剪切力等環境因素不敏感； （8）對溶氧的要求低，便于培養及降低能耗。 3.2 菌種選育目前菌種選育常采用自然選育和誘變育種等方法，隨著微生物學、生化遺傳學的發展出現了轉化、轉導、接合、原生質體融合、代謝調控和基因工程較為定向的方法。經典育種：自然選育和誘變育種。菌種選育常采用。定向育種：轉化，轉導，接合，原生質體融合，代謝調控，基因工程。3.2.1自然選育生產中，不經過人工處理，利用菌種的自然突變而進行菌種篩選的過程叫自然選育。一般認為引起自然

21、突變的原因有兩個：多因素低劑量的誘變效應和互變異構效應。自然突變有兩種情況： 菌種衰退，對生產無利的突變，對生產有利的突變的。自然選育優缺點： 優點：是簡單易行；缺點：效率低、進展慢。3.2.2 誘變育種3.2.2.1 誘變育種的基本原理誘變育種的理論基礎是基因突變。突變是指由于染色體和基因本身的變化而產生的遺傳性狀的變異。誘發突變是指用各種物理、化學因素人工誘發的基因突變。其中誘發突變的變異幅度大大高于自然突變。誘變因素的種類很多，有物理的、化學的和生物的三大類。3.2.2.2 誘變育種的一般步驟誘變育種的整個流程包括：誘變和篩選兩個部分。誘發所形成的突變與菌種本身的遺傳背景、誘變劑種類及劑

22、量的選擇和合理使用方法均有密切的關系。3.2.2.3 誘變育種工作中應該注意的幾個問題 選擇好出發菌種 復合誘變因素的使用 劑量的選擇 出發菌株的篩選 高產菌株的獲得需要篩選條件的配合3.3 原生質體融合3.3.1 原生質體融合技術原生質體融合是通過人工方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體發生融合，并產生重組子的過程。該技術始于1976年,最早是在動物細胞實驗中發展起來的，后來，在酵母菌、霉菌、高等植物、以及細菌和放線菌中也得到了應用。3.3.2 原生質體融合技術步驟：3.4 基因工程技術（第四章中詳細介紹）3.4.1 基因工程育種技術定義基因工程是用人為的方法將所需的某一供體生物的遺傳物

23、質DNA分子提取出來，在離體條件下切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后導入某一受體細胞中，讓外來的遺傳物質在其中進行正常的復制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術。3.4.2 主要步驟3.5 菌種的篩選方法3.5.1 一次性篩選法定義：對出發菌株完全致死的環境中，一次性篩選出少量抗性變異株。（1）抗噬菌體菌株篩選：噬菌體數大于菌體細胞數，平板分離。誘變選育，平板分離：敏感菌株經誘變因素處理，然后將處理過的孢子液分離在含有高濃度的噬菌體的平板培養基上，經處理后的存活的孢子中，如存在抗性變異菌株就能在此平板上生長。誘變育種、液體培養、平板分離：誘變因素處理后接入種子培養基，待菌絲

24、長濃后加入高濃度的噬菌體再繼續培養幾天；再加入噬菌體反復感染，使敏感菌被噬菌體所裂解，最后取出菌絲進行平板分離，從中篩選抗性菌株。 2）耐高溫菌株篩選：節約冷卻水，減少染菌。 方法：一定高溫處理一段時間，再分離。敏感菌株被大量殺死，殘存的細胞則對高溫有較好的耐受性。3）耐高濃度酒精酵母菌的篩選，用于濃醪發酵。 方法：加入高濃度酒精。4）耐高滲透壓酵母菌株篩選，用于甘油發酵。方法：添加蔗糖。3.5.2 其他篩選方法3.5.2.1 條件抗性突變型的篩選3.5.2.2 抗藥性突變株的篩選1）梯度平板法2）紙片擴散法 第四章 基因工程原理教學基本要求：使學生掌握基因工程原理及操作過程，并深入了解運用基

25、因工程技術育種的方法。教學內容：4.1 重要的工具酶 基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的 切割、連接、聚合、修飾、反轉錄等 有關的各種酶系統。4.1.1限制性核酸內切酶是一類由細菌產生的能專一識別雙鏈DNA中的特定堿基序列、并水解該點磷酸二酯鍵 的核酸內切酶，簡稱限制酶或切割酶。根據限制酶的作用特性，一般分為三類：（3個亞基）、（單條肽鏈）和（多亞基蛋白）型，其中常用的是型限制酶。限制酶（型）識別及切割位點特異識別及切割48個bp長度且具有回文序列的DNA片斷，主要產生3種缺口： 5粘性末端，3粘性末端，平端或鈍端。回文序列：是指該部位的核苷酸序列呈180O旋轉對稱;其特點是在

26、該段的堿基序列的互補鏈之間正讀反讀都相同（并非在同一條鏈上正讀反讀）。例如5'GGTACC3' 粘性末端：是指經內切酶特異切割后產生的5末端突出或3末端突出的堿基序列相互具有互補性。4.1.1.1同裂酶又稱異源同工酶。指來源不同，但具有相同的識別序列。在切割DNA時，其切割點可以是相同的，產生平頭末端，稱為同識同切；切割點也可以是不同的，產生3或5粘性末端，稱為同識異切。4.1.1.2 同尾酶 指來源不同，但識別與切割順序有一定的相關性的一類酶。它們作用后產生相同的粘性末端。 4.1.2 DNA聚合酶最常用的DNA聚合酶有以下4種：DNA聚合酶；DNA聚合酶大片段Klenow片

27、段；Taq DNA聚合酶；T4 噬菌體DNA聚合酶。（一） DNA聚合酶E.Coli DNA聚合酶（DNA pol ） 是一個具有3 種酶活性的多功能性酶。包括：53DNA 聚合酶活性；53核酸外切酶活性；35核酸外切酶活性。DNA pol 應用： 催化DNA缺口平移反應，制備高比活性DNA探針；第二條cDNA鏈的合成； 對DNA3突出末端進行標記； DNA序列分析。 （二）Klenow片段（DNA pol.大片斷） （三） Taq DNA pol（耐熱DNA聚合酶）作用特點1）Taq DNA pol催化DNA合成的最適溫度范圍70- 75，2）95以上高溫，半小時不失活， 3）最適合用于聚合

28、酶鏈反應（PCR）。4.1.3逆轉錄酶特點： 由兩條肽鏈組成，其中一條同時具有53DNA聚合酶活性和53RNA外切酶活性。逆轉錄酶是一個多功能性酶，至少具有以下3種酶活性：以單鏈RNA 為模板， 催化合成cDNA單鏈具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA雜交鏈中的RNA以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。4.1.4 DNA連接酶DNA連接酶可以催化帶有粘性末端或平頭末端的雙鏈DNA中一條鏈的3OH與另一條鏈的5PO3H2形成磷酸二酯鍵而相連，從而構成一條完整的DNA長鏈。最常用的DNA連接酶是T4連接酶，是在T4噬菌體感染的大腸桿菌中發現的了分離的。T4連接酶不僅適用于DNA之間的粘

29、性末端連接，也可以適用于平末端的連接。催化反應時需要Mg2+和ATP。4.1.5堿性磷酸酶堿性磷酸酶(BAP) 能夠催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基團。4.2基因克隆常用的載體載體是將外源DNA(目的DNA)片斷引入宿主細胞的運載工具，其化學本質為DNA 。4.2.1載體必須具備的基本條件1） 有自身的復制子，能獨立復制2）具備多個限制酶的識別位點(多克隆位點)3） 具有遺傳表型或篩選標記4） 有足夠的容量以容納外源DNA片段。5） 表達型載體還應具備與宿主細胞相適應的啟動子、前導序列、增強子等調控元件。6） 載體DNA中均有一段非必需區，將外源基因插入該非必需區，而載體本身不受影響。

30、4.2.2載體的種類一般來說，載體是通過改造天然質粒、噬菌體和病毒構建而成。（一）克隆載體：用來克隆和擴增DNA片段的載體，具有3點共性： 能夠在受體細胞復制； 帶有藥物抗性基因，便于篩選； 可導入受體細胞。（二）表達載體：除具有克隆載體所具有的性質外，還帶有表達構件轉錄和翻譯所必須的DNA順序，以保證外源基因的表達。4.2.3 常用的載體4.2.3.1 質粒是存在于細菌染色體外的、能自主復制的雙鏈環狀DNA分子。作為克隆載體的質粒應具備以下特點：1）分子量相對較小，能穩定存在于細菌體內，有較高的拷貝數2）具有1個以上的遺傳標志，便于篩選3）具有多克隆位點廣泛應用的質粒：pBR322質粒、pU

31、C系列等pBR322質粒特點： 4363 bp含一個復制點含一個抗氨卞青霉素標記(ampR)一個抗四環素標記 (tetR) ampR和tetR基因內各有一些限制酶的酶切位點，供外源基因插入當外原基因插入抗藥基因位點時，AmpRAmp敏感(AmpS )、TetRTet敏感(TetS). pUC系列質粒特點：由pBR322和M13噬菌體構建而成的雙鏈質粒載體；1）2674bp；2）有ampr和與M13噬菌體相同的多克隆位點（MCS）；3）有一個來自大腸桿菌的LacZ操縱子的DNA片斷, 編碼半乳糖苷酶。4.3.2.2 噬菌體組成特點：雙鏈線狀DNA分子，全長50kb，含65個基因，在其分子兩端各含

32、有12個堿基的互補單鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點。 噬菌體結構噬菌體感染細菌后的溶菌性生長和溶源性生長： 溶菌性生長（lytic pathway） 溶源性生長(lysogenic pathway) 4.3重組DNA基本原理DNA重組基本過程分獲取目的基因和載體；接目的基因與載體的連接；轉重組DNA導入宿主細胞篩重組DNA的篩選與鑒定。4.3.1目的基因的獲取（分）目的基因來源： 1） 制備基因組DNA；2）制備cDNA；3）聚合酶鏈反應；4）人工合成基因。4.3.2目的基因與載體的連接（接）主要有以下3種連接方式：1)粘性末端連接 2）平頭末端連接 3）人工接頭法4.3.3重組DNA

33、導入宿主細胞（轉）依據重組載體不同可分為：1）轉化：以質粒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程；2）轉染：以病毒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程；3）轉導：以噬菌體作載體構建的重組體導入受體細胞的過程。4.3.4重組DNA的篩選與鑒定（篩）篩選含重組體的陽性菌落，一般有下列幾種方法：（一）平板篩選是指利用載體的遺傳性標記直接篩選的方法。 如，具有抗藥性標記的載體，轉化宿主細胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培養平板上生長；未轉化的則不能生長。有插入失活和藍白斑篩選兩種。（二）限制性內切酶圖譜鑒利用限制性核酸內切酶分析法可以進一步篩選鑒定重組子，而且能夠判斷外源DNA片段的插入方向以及大

34、小。（三）PCR篩選重組體 抽提少量重組DNAPCR擴增電泳鑒定序列分析。（四）菌落（噬菌斑）原位雜交技術4.4重組技術在醫學和制藥工業中的應用1）疾病基因的發現；2）生產蛋白質和多肽類活性物質；3）制備基因工程疫苗；4）改良物種特性；5）動物克隆。第五章 代謝調控教學基本要求：使學生了解微生物的代謝調節系統。教學內容：第一節 微生物的代謝調控了解微生物的代謝調節系統不僅有理論意義，更重要的是能有目的地改造微生物和為微生物提供最適合的環境條件，使微生物能最大限度地生產人類所需的代謝產品。5.1代謝調控部位（調節方式）微生物的代謝調節主要通過養分的吸收排泄、限制基質與酶的接近和控制代謝流等幾個部

35、位實現的，在這方面真核生物與原核生物略有區別，主要表現在前者有各種各樣的細胞器。其中以調節代謝流的方式最為重要，它包括兩個方面，一是“粗調”，即調節酶的合成量，二是“細調”，即調節現成酶分子的催化活力，兩者往往密切配合和協調，以達到最佳調節效果。5.2酶合成的調節酶合成的調節是通過調節酶合成的量來控制微生物代謝速度的調節機制。這類調節在基因轉錄水平上進行，對代謝活動的調節是間接的、也是緩慢的。酶合成的調節主要有兩種類型：酶的誘導和酶的阻遏。5.2.1誘導按照酶的合成與環境影響的不同關系，可以將酶分為兩大類，一類稱為組成酶(Structural enzymes)，它們的合成與環境無關，隨菌體形成

36、而合成，是細胞固有的酶，在菌體內的含量相對穩定。如糖酵解途徑(EMP)有關的酶。另一類酶稱為誘導酶(Inducible enzyme)或適應性酶，只有在環境中存在誘導劑(Inducer)時，它們才開始合成，一旦環境中沒有了誘導劑，合成就終止。誘導酶：在對數生長期的大腸桿菌(E.coli)培養基中加入乳糖，就會產生與乳糖代謝有關的ß -半乳糖苷酶和半乳糖苷透過酶等。這時，細胞生長速度和總的蛋白質合成速度幾乎沒有改變，這種環境物質促使微生物細胞中合成酶蛋白的現象稱為酶的誘導。5.2.2酶合成的阻遏在某代謝途徑中，當末端產物過量時，微生物的調節體系就會阻止代謝途徑中包括關鍵酶在內的一系列酶

37、的合成，從而徹底地控制代謝，減少末端產物生成，這種現象稱為酶合成的阻遏。合成可被阻遏的酶稱為阻遏酶(repressible enzyme)。阻遏的生理學功能是節約生物體內有限的養分和能量。酶合成的阻遏主要有末端代謝產物阻遏和分解代謝產物阻遏兩種類型末端代謝產物阻遏：由于某代謝途徑末端產物的過量積累而引起酶合成的(反饋)阻遏稱為末端代謝產物阻遏。通常發生在合成代謝中，特別是在氨基酸、核苷酸和維生素的合成途徑中十分常見。生物合成末端產物阻遏的特點是同時阻止合成途徑中所有酶的合成。末端代謝產物阻遏的機制也可以用操縱子學說解釋。分解代謝物阻遏：當細胞內同時存在兩種可利用底物(碳源或氮源)時，利用快的底

38、物會阻遏與利用慢的底物有關的酶合成。現在知道，這種阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的結果，而是由這種底物分解過程中產生的中間代謝物引起的，所以稱為分解代謝物阻遏。5.2.3乳糖操縱子大腸桿菌的乳糖操縱子含Z、Y及A三個結構基因，分別編碼-半乳糖苷酶、透酶、乙酰基轉移酶，此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調節基因。基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結合，使操縱子受阻遏而處于轉錄失活狀態。在啟動序列P上游還有一個分解（代謝）物基因激活蛋白CAP結合位點，由P序列、O序列和CAP結合位點共同構成LAC操縱子的調控區，三個酶的編碼基因即由同一調控區調節，實現基因產物的協調表達。阻遏蛋白的負

39、性調節 ： cAMP的正性調節：當沒有葡萄糖及cAMP濃度較高時，cAMP與CAP結合，形成cAMP-CAP復合物，結合在乳糖啟動序列附近的CAP位點，可刺激RNA轉錄活性，使之轉錄頻率大大提高；當葡萄糖存在時，cAMP濃度降低，cAMP與CAP結合受阻，因此乳糖操縱子表達下降。5.3酶活性的調節通過改變酶分子的活性來調節代謝速度的調節方式稱為酶活性的調節。與酶合成調節方式相比，這種調節方式更直接，并且見效快。是發生在蛋白質水平上的調節。調節酶:某些酶的活性受到底物或產物或其結構類似物的影響，這些酶稱為調節酶。酶活性調節機理：調節酶通常是變構酶，一般具有多個亞基，包括催化亞基和調節亞基。變構酶

40、激活過程的效應物稱為激活劑(activator)，而抑制過程的效應物稱為抑制劑(inhibitor)。 變構酶受效應物的調節過程1. 激活劑激活無活性的酶；2.抑制劑抑制有活性的酶在微生物代謝調節中更常見的是反饋調節，尤其是末端產物對酶活的反饋抑制。抑制劑與調節亞基結合引起酶構象發生變化，使催化亞基的活性中心不再能與底物結合，酶的催化性能隨之消失。調節酶的抑制劑通常是代謝終產物或其結構類似物，作用是抑制酶的活性。效應物的作用是可逆的，一旦效應物濃度降低，酶活性就會恢復。調節酶常常是催化分支代謝途徑一系列反應中第一個反應的酶，這樣就避免了不必要的能量浪費。 5.4微生物代謝調節的模式在微生物合成

41、代謝過程中，反饋阻遏和反饋抑制往往共同對代謝起著調節作用，它們通過對酶的合成和酶的活性進行調節，使細胞內各種代謝物濃度保持在適當的水平。反饋阻遏是轉錄水平的調節，產生效應慢，反饋抑制是酶活性水平調節，產生效應快。此外，前者的作用往往會影響催化一系列反應的多個酶，而后者往往只對是一系列反應中的第一個酶起作用。反饋阻遏（ feedback repression ）與反饋抑制（ feedback inhibition ）的性質比較反饋阻遏反饋抑制調控對象酶的合成酶的活性調控開關終產物濃度終產物濃度調控的水平DNA-mRNA-酶蛋白（轉錄水平）酶蛋白的構象變化調控方式終產物與阻遏蛋白親和力終產物與變構

42、部位親和力調控動作阻遏蛋白與操縱基因結合，不能合成mRNA通過變構效應，酶的構象變化對酶的影響影響催化一系列反應的多個酶只對是一系列反應中的第一個酶起作用形成的控制開、關控制控制酶活性大小調控反應速度遲緩迅速5.5 微生物代謝調節的模式5.5.1 直線式代謝途徑的反饋控制對于只有一個末端代謝產物的途徑，即直線式代謝途徑，當末端代謝產物達到一定濃度時，就會反饋控制該代謝途徑。末端產物的反饋阻遏一般是阻止該途徑中所有酶的合成，末端產物抑制一般是抑制該途徑第一個酶的活性。5.5.2 分支代謝途徑的反饋控制由幾種末端代謝產物共同對生物合成途徑進行控制的體系較為復雜。即便是同一代謝途徑，不同菌種也會有不

43、同的控制模式。這些控制可以是反饋阻遏或反饋抑制單獨作用的結果，也可以是兩者共同作用的結果。5.5.2.1協同反饋調節分支代謝途徑的幾個末端產物同時過量時，該途徑的第一個酶才會受到反饋阻遏或反饋抑制。5.5.2.2增效反饋調節這類控制體系與協同反饋控制類似，但是該體系中的末端產物都有較弱的獨立控制作用。當所有的末端產物同時過剩時，會導致增效的阻遏或抑制，即其阻遏或抑制的程度比這些末端產物各自獨立過量時的總和還要大，因此，又稱為增效反饋控制 。5.5.2.3累積反饋控制每個分支途徑的末端產物都獨立于其它末端產物，以一定百分比控制該途徑第一個共同的酶所催化的反應。當幾個末端產物同時存在時，它們對酶反

44、應的抑制是累積的，各末端產物之間既無協同效應，也無拮抗作用。5.5.2.4順序反饋調節在順序反饋控制體系中，直接對第一個共同的酶起控制作用的并不是末端產物，而是分支點上的中間產物。5.6能荷調節能荷指細胞中、AMP系統中可為代謝反應供能的高能磷酸鍵的量度。能荷調節也稱腺苷酸調節，系指細胞通過改變ATP、ADP、AMP三者比例來調節其代謝活動。它們所含能荷依次遞減，上述三者在細胞中的含量不同，表明細胞的能量狀態不同。細胞中能荷的作用：1）調節形成ATP的分解代謝酶類的活性;2）調節利用ATP的生物合成酶類的活性。5.7次級代謝與次級代謝調節次級代謝是相對于初級代謝而言的，所謂初級代謝是一類普遍存

45、在于生物中的代謝類型，是與生物生存有關的，涉及能量產生和能量消耗的代謝類型。5.7.1 碳、氮分解代謝物調節指能迅速被利用的碳源（氮源）及其分解代謝物 ，對其它代謝中的酶的調節。例如:葡萄糖是菌體生長良好的碳源和能源，但對青霉素、卡那霉素等都有明顯降低其產量的作用 5.7.2磷酸鹽的調節磷酸鹽對次級代謝產物合成抑制作用的調節機制是不同的、有的是通過抑制酶的作用，有的是導致細胞能荷變化，或是提高磷酸鹽競爭某些必需金屬離子的作用實現的。5.7.2細胞膜透性的調節在青霉素發酵中，產生菌細胞膜輸入硫化物能力的大小影響青霉素發酵單位的高低。若輸入硫化物能力增大，硫源供應充足，合成青霉素的量就增多。第二節

46、 微生物代謝的人工控制人為地打破微生物的代謝控制體系，就有可能使代謝朝著人們希望的方向進行，這就是所謂代謝的人工控制。雖然微生物代謝調節的理論目前還有很大的局限性，但它已在微生物育種和發酵工藝的優化中發揮了重要的作用。隨著代謝調節理論的不斷充實和完善，代謝的人工控制將對發酵工業發揮更加重要的作用。目前，人工控制代謝主要是通過遺傳學和生物化學方法來實現的。5.8 遺傳學方面通過改變微生物遺傳物質可以從根本上打破微生物原有的代謝控制機制，具體包括應用：1）營養缺陷型突變株；2）抗反饋調節的突變株;3)滲漏突變菌株;4)抗分解代謝突變株;5)組成型突變菌株.5.9 生化方面不通過遺傳學方法也能改變菌

47、株的調節機制，具體包括：1）添加前體；2）控制誘導劑；3）發酵與分離過程耦合；4）控制細胞膜的通透性；5）培養基成分和濃度控制。5.10 代謝調控在氨基酸發酵中的應用以谷氨酸為例： 目前工業上應用的谷氨酸產生菌有谷氨酸棒狀桿菌、乳糖發酵短桿菌、散枝短桿菌、黃色短桿菌、嗜氨短桿菌等。在發酵過程中，氧、溫度、pH和磷酸鹽等的調節和控制如下： 氧。谷氨酸產生菌是好氧菌，通風和攪拌不僅會影響菌種對氮源和碳源的利用率，而且會影響發酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在發酵后期，加大通氣量有利于谷氨酸的合成。其中谷氨酸棒狀桿菌在溶氧不足時產生的是乳酸或琥珀酸。溫度。菌種生長的最適溫度為3032 。當菌體生長到穩

48、定期，適當提高溫度有利于氨基酸產生，因此，在發酵后期，可將溫度提高到3437 。 pH。谷氨酸產生菌發酵的最適pH在7.08.0。但在發酵過程中，隨著營養物質的利用，代謝產物的積累，培養液的pH會不斷變化。如隨著氮源的利用，放出氨，pH會上升；當糖被利用生成有機酸時，pH會下降。其中谷氨酸棒狀桿菌在pH呈酸性時生成乙酰谷胺酰胺。 磷酸鹽。它是谷氨酸發酵過程中必需的，但濃度不能過高，否則會轉向纈氨酸發酵。發酵結束后，常用離子交換樹脂法等進行提取。從代謝調控的角度分析一株谷氨酸高產菌應具備的代謝特征： 第六章 培養基教學基本要求：使學生掌握培養基成分選擇的一些基本原則，掌握和了解培養及優化的基本方

49、法以及培養基設計時主義的一些相關問題。教學內容：6.1 定義培養基通常指人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養基質。廣義上說，凡是支持微生物生長和繁殖的介質或材料均可作為微生物的培養基。 用途：培養基是微生物學尤其是工業微生物學研究的重要內容。一個恰當的培養基配方，對發酵產品的產量和質量有著極大的影響。 6.2 培養基的基本要求必須含有作為細胞合成的原料；滿足一般生化反應的基本條件，如碳源、氮源、無機鹽、生長因子，還有一定的pH條件等等；原材料營養豐富，配比合理、各成分之間不發生化學反應；含有能夠促進微生物合成產物所必需的成分（工業發酵培養基）；來源豐富、價格便宜、質量穩定、有利于提

50、取。6.3 培養基的成分及種類大部分微生物為異養型微生物所以培養基的基本成分有以下幾類：碳源，氮源，無機鹽和微量元素，前體、促進劑和抑制劑，水分。培養基的種類6.4 培養基配置原則在考慮某一菌種對培養記得總體要求時，在成分選擇時應該注意一下幾個方面的問題。6.4.1菌體的同化能力小分子物質能夠通過細胞膜進入細胞內進行代謝。大分子物質則需要相應的水解酶才能利用。由于微生物來源和種類的不同，能分泌的水解酶系不一樣，所以利用的的物質也不一樣，所以必須要充分考慮微生物的同化能力。葡萄糖是幾乎所有微生物都能利用的碳源，因此在選擇培養基時一般優先加以考慮。工業生產中一般采用淀粉水解糖糖化過程，得到的糖液稱

51、為淀粉水解糖。目前淀粉水解糖的制備方法分為酸法、酸酶法和雙酶法，其中以雙酶發制得的糖液質量最好。許多有機氮源都是很復雜的大分子蛋白質。有些微生物缺乏蛋白分解酶，不能直接分解蛋白質必須將有機氮源水解后才能被利用。6.4.2 代謝的阻遏和誘導在配制培養基考慮碳源和氮源時，應該根據微生物的特性和培養的目的，注意快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮）源的相互配合。對于快速利用的碳（氮）源，當菌體利用葡萄糖時產生的分解代謝產物會阻遏或抑制某些產物合成所需酶系的形成或酶的活性，即發生葡萄糖效應6.4.3 合適的C、N 比培養基中碳氮比對微生物生長繁殖和產物合成的影響極為顯著。氮源過多，菌體生長旺盛，pH

52、偏高，不利于代謝產物的積累；氮源不足，菌體繁殖量少，從而影響產量。碳源不足，容易引起菌體的衰老和自溶碳氮比不當還會引起菌體按比例的吸收營養物質，從而直接影響菌體的生長和產物的合成。微生物在不同的生長階段，其對碳氮比的最適要求也不一樣。6.4.4 pH的要求pH對于微生物的生長是一個極為重要的環境因子，在配制培養基培養基選取營養物質時，也要考慮其代謝后對培養體系pH緩沖體系的影響，保證整個發酵過程中pH處于較為適宜的狀態。6.5 影響培養基質量的因素6.5.1 培養基成分的影響6.5.2 高溫滅菌對培養基成分的影響第七章 種子擴大培養教學基本要求：使學生了解并掌握種子擴大培養的概念、種子要求及制

53、備過程，以及種子罐級數的確定，并了解種子擴大培養在發酵生產中的重要作用。教學內容：7.1種子擴大培養的概念種子擴大培養是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態的生產菌種接入試管斜面活化后，再經過三角瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養,最終獲得一定數量和質量的純種過程。這些純種培養物稱為種子。發酵工業生產過程中的種子的必須滿足以下條件：（1）菌種細胞的生長活力強，移種至發酵罐后能迅速生長，遲緩期短；（2）生理形狀穩定；（3）菌體總量及濃度能滿足大容量發酵罐的要求；（4）無雜菌污染； （5）保持穩定的生產能力7.2 種子的制備過程 實驗室階段：不用種子罐，所用的設備為培養箱、搖床等實驗室常見設備，在工廠這些培養過程一般都在菌種室完成，因此現象地將這些培養過程稱為實驗室階段的種子培養。生產車間階段：種子培養在種子罐里面進行，一般在工程歸為發酵車間管理，因此形象地稱這些培養過程為生產車間階段。7.2.1 實驗室種子的制備實驗室種子的制備一般采用兩種方式：對于產孢子能力強的及孢子發芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養基培養孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。 對于產孢子能力不強或孢子發芽慢的菌種，可以用液體培養法。7.2.2 生產車間種子制備 實驗室制備的孢子或液體種子移種至種子罐