1、分子生物學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用期末復(fù)習(xí)資料一名詞解釋（10x4分=40分）1. DNA文庫：DNA 或DNA的所有片斷隨機地連接到基因載體上，然后轉(zhuǎn)移到適當?shù)乃拗骷毎?，通過細胞增殖而構(gòu)成各個片段的無性繁殖系(克隆)，在制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部DNA都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就被稱為某種生物的基因文庫。2. cDNA文庫: 以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化，在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當?shù)妮d體。連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織或細胞的cDNA文庫。3. 內(nèi)切酶: 內(nèi)切酶，即限制性核酸內(nèi)切酶。

2、亦稱限制性核酸酶。是一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸順序，并以內(nèi)切方式水解雙鏈DNA的核酸水解酶。它們不同于一般的脫氧核糖核酸酶（DNase），它們的切點大多很嚴格，要求專一的核苷酸順序 識別順序。4. 蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics) 指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律。5. 基因組學(xué)（Genomics）：是研究生物基因組的組成，組內(nèi)各基因的精確結(jié)構(gòu)、相互關(guān)系及表達調(diào)控的科學(xué)。6. 綠色熒光蛋白(green fluorescent p

3、rotein)，簡稱GFP，這種蛋白質(zhì)最早在水母中發(fā)現(xiàn)。其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍色波長范圍的光線激發(fā)下，會發(fā)出綠色螢光。這個發(fā)光的過程中還需要冷光蛋白質(zhì)Aequorin的幫助，且這個冷光蛋白質(zhì)與鈣離子(Ca2+)可產(chǎn)生交互作用7. 流動相:色譜過程中攜帶待測組分向前移動的物質(zhì)稱為流動相，是與固定相處于平衡狀態(tài)、帶動樣品向前移動的另一相，用作流動相的物質(zhì)有氣體、液體、超臨界流體。8. 示蹤分子：用于標記DNA序列或蛋白質(zhì)，使之可遺傳并被檢出的物質(zhì)，有放射性和非放射線兩種9. 修飾酶：能催化稀有堿基參入RNA或DNA，或?qū)υ袎A基進行修飾的酶。以防止限制性內(nèi)切酶的破壞。體內(nèi)有些酶可在其他酶的作用

4、下，將酶的結(jié)構(gòu)進行共價修飾，而使其在高活性形式和相對較低的活性形式之間互相轉(zhuǎn)變，這種調(diào)節(jié)稱為共價修飾調(diào)節(jié)，這類酶稱為修飾酶。例如某些酶的巰基發(fā)生可逆的氧化還原，一些酶以共價鍵與磷酸、腺苷等基團的可逆結(jié)合，都會引起酶結(jié)構(gòu)的變化而呈現(xiàn)不同的活性。酶的共價修飾是體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)的另一重要的方式。10. 熒光定量PCR技術(shù)（Real-Time PCR）：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，對未知模板進行定量分析的方法。其對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)的產(chǎn)物進行定量分析；特異性強；靈敏度高；可直接對產(chǎn)物進行定量；可解決PCR污染問題；自動化程度高、操作簡單。11. 探針：是

5、一小段單鏈DNA或者RNA片段（大約是20到500bp）， 用于檢測與其互補的核酸序列。雙鏈DNA加熱變性成為單鏈，隨后用放射性同位素、螢光染料或者酶（如辣根過氧化物酶）標記成為探針。12. 基因芯片：該技術(shù)系指將大量（通常每平方厘米點陣密度高于 400 ）探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。用來大規(guī)模檢測基因轉(zhuǎn)錄。13. 蛋白質(zhì)印記: 一種分析和鑒定特定蛋白質(zhì)的技術(shù)。用來檢測在不均一的蛋白質(zhì)樣品中是否存在目標蛋白的一種方法。即將混雜的蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至固相膜(如硝酸纖維素膜、尼龍膜等)上，

6、再用標記的抗體或二抗與之反應(yīng)，以顯示膜上特定的蛋白條帶。14. 核酸雜交：兩條核酸單鏈可以通過序列互補形成雙鏈化合物的過程。有DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等雜交類型。核酸雜交是一種很重要的、被廣泛應(yīng)用的技術(shù)，如設(shè)計反義核酸、合成探針等。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對規(guī)律形成雙邊結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測樣品的不同又被分為DNA印跡雜交和RNA印跡雜交。15. 雙向凝膠電泳：第一向為等電聚焦，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同而將其分離，第二向SDS-PAGE，根據(jù)其分子量的大小而

7、將其分離。由于其具有大規(guī)?？焖俜治龊丸b定蛋白質(zhì)的能力以及有較好的可重復(fù)性和可比性，相對于蛋白質(zhì)微列矩陣把其稱為蛋白質(zhì)宏觀矩陣。二、問答題（60分）1、氣相色譜和液相色譜優(yōu)缺點比較？（1）氣相色譜：主要是利用物質(zhì)的沸點、極性及吸附性質(zhì)的差異來實現(xiàn)混合物的分離。用于可揮發(fā)、熱穩(wěn)定、沸點不超過500的化合物（20%-25%）優(yōu)點：用毛細管柱色譜可得到很高的柱效 有很靈敏的檢出器，如ECD和較靈敏的通用檢測器如TCDFID 流動相為氣體，無毒，易于處理，固定相種類多 運行和操作容易 儀器制造難度小缺點：只能分析揮發(fā)性的物質(zhì)，只能分析20%的化合物 不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析（2）液相色譜：不受樣品揮發(fā)

8、度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，分析對象為可以溶于水或有機溶劑的各種物質(zhì)，大約占有機物的70%-80%優(yōu)點：幾乎可以分析各種物質(zhì)可以用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析缺點：色譜柱不能很長，柱效不會很高沒有較靈敏的通用檢測器流動相有毒，費用較高，固定相種類少運行和操作比較難儀器制造難度大超高效液相色譜優(yōu)點（根據(jù)老師ppt整理的）超高速度 顆粒填料色譜柱能超乎尋常地提高分析速度而不降低分離度，顯著增加樣品的通量，提高工作效率，降低分析成本n節(jié)省以往一向耗時的方法開發(fā)與認證的時間超高靈敏度 n小顆粒技術(shù)和整體化的儀器設(shè)計，UPLCTM能

9、在改善分離度的同時提高靈敏度，更高的柱效和更窄的色譜峰，意味著更高的色譜峰高和更高的靈敏度在得到超高分離度和超高速度的同時能夠得超高靈敏度。超高分離度利用高效創(chuàng)新小顆粒填料（1。7L），獲得超強分離能力，超低擴散體積，充分發(fā)揮小顆粒填料分離能力，適合復(fù)雜混合物的分離分析超級創(chuàng)新為滿足色譜實驗室對歷史追蹤不斷增長的需求，每根ACQUITY UPLCTM色譜柱出售時均帶一個永久性的eCordTM，它能記錄進樣次數(shù)，最高的反壓和柱溫，其中還含有由Waters Waters 公司提供的該色譜柱的分析測試合格證書。色譜柱安裝后，智能化的芯片會自動地把關(guān)鍵參數(shù)采集進入色譜柱的歷史文檔，并記錄色譜柱整個壽命

10、周期的歷史。該記錄不能被刪除。2、層析技術(shù)？（色譜技術(shù)） 層析技術(shù)是一種物理的分離方法，無論何種層析都是由互不相溶的兩個相組成：一個是固定相，（固體或吸附在固體上的液體），一是流動相（液體或者氣體）。層析時利用混合物中各組分理化性質(zhì)（吸附力，分子形狀和大小，分子極性，分子親和力，溶解度等）的差異，使各組分不同程度地分布在兩種相中，隨著流動相從固定相上流過，不同組分以不同速度移動而最終被分離。（1）凝膠層析色譜：根據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進行分離純化。凝膠層析的固定相是惰性凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當含有不同分子大小的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴

11、散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外面的空間內(nèi)隨著流動相向下流動，它們經(jīng)歷的流程短，流動的速度快，所以首先流出，而較小的分子則可以完全滲透進入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長，流動的速度慢，所以最后流出，而分子大小介于兩者之間的分子在流動中部分滲透，滲透的程度取決于分子的大小，所以它們流出的時間介于兩者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按照分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。（2）離子交換色譜：根據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進行

12、分離純化。離子交換層析的固定相是離子交換劑，離子交換劑可以分為三個部分，高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團和平衡離子。電荷基團和高分子聚合物基質(zhì)共價結(jié)合，形成一個帶電的可進行離子交換的基團。平衡離子(交換離子) 是結(jié)合于電荷基團上的相反離子，它能與溶液中其他的離子基團發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的粒子基團發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑，平衡離子帶負電的離子交換劑能與帶負電的離子基團發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。（3）疏水作用色譜（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）：是根據(jù)分子表面疏水性差別來分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的

13、一種較為常用的方法。蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團，我們把這些疏水性基團稱為疏水補丁，疏水補丁可以與疏水性層析介質(zhì)發(fā)生疏水性相互作用而結(jié)合。不同的分子由于疏水性不同，它們與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水性作用力強弱不同，疏水作用層析就是依據(jù)這一原理分離純化蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的?；驹恚喝芤褐懈唠x子強度可以增強蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水作用。利用這個性質(zhì)，在高離子強度下將待分離的樣品吸附在疏水性層析介質(zhì)上，然后線性或階段降低離子強度選擇性的將樣品解吸。疏水性弱的物質(zhì)，在較高離子強度的溶液時被洗脫下來，當離子強度降低時，疏水性強的物質(zhì)才隨后被洗脫下

14、來。3、研究蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)手段?（1）蛋白質(zhì)分離技術(shù) 雙向凝膠電泳：第一向為等電聚焦，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點不同而將其分離，第二向SDS-PAGE，根據(jù)其分子量的大小而將其分離。由于其具有大規(guī)?？焖俜治龊丸b定蛋白質(zhì)的能力以及有較好的可重復(fù)性和可比性，相對于蛋白質(zhì)微列矩陣把其稱為蛋白質(zhì)宏觀矩陣。差異凝膠電泳(DIGE)單向電泳(SDS-PAGE)毛細管電泳(capillary electrophoresis CE)（2）蛋白質(zhì)鑒定技術(shù):傳統(tǒng)方法：蛋白質(zhì)微量測序、氨基酸組成分析 新型方法：質(zhì)譜（MS）法，基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比（m/z）的差異來分離并確定樣品的分子量。(離子源、

15、質(zhì)量分析器和離子檢測器) 聯(lián)合技術(shù)精確鑒定蛋白質(zhì) A:兩級飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）B:傅里葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜（FTMS） C:表面增強激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS） （3）蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué) A:構(gòu)建和分析雙向凝膠電泳圖譜 B:數(shù)據(jù)庫的搜索與蛋白鑒定 常用數(shù)據(jù)庫1):瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。) 2):目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫是NCBInr和MSDB數(shù)據(jù)庫。) 蛋白鑒定的軟件 1):Mascot() 2):ProFound 3):Protein

16、Prospector （4）蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)揭示蛋白質(zhì)組成員間的相互作用、相互協(xié)調(diào)的關(guān)系，并深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，以及基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系。 具體技術(shù)：酵母雙雜交系統(tǒng)1989年Field 和Song等人在酵母細胞中設(shè)計的分析蛋白質(zhì)相互作用的方法。以真核細胞轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)和活性特點為基礎(chǔ)的;主要特點:最主要的應(yīng)用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。優(yōu)勢 :作用信號是在融合基因表達后，在細胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。真實反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用情況可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時

17、期材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析細胞漿、細胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。敏感性高 缺 點:A、假陽性結(jié)果 某些蛋白表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域，能與其他蛋白形成穩(wěn)定 的復(fù)合體，從而引起報告基因的表達，產(chǎn)生"假陽性"結(jié)果。 B、限于核內(nèi)表達的蛋白質(zhì)的相互作用雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助，這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。 該系統(tǒng)利用了酵母的生長轉(zhuǎn)錄因子GAL4含有的兩個結(jié)構(gòu)域，DNA

18、結(jié)合域(DNA binding domain， BD)及轉(zhuǎn)錄激活域( activation domain，AD) ，將已知基因(誘餌基因)和靶基因或含有靶基因cDNA分別構(gòu)建在含BD及AD質(zhì)粒載體上，當這兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞，若BD結(jié)合的誘餌蛋白能夠與AD結(jié)合的靶蛋白或文庫中某些cDNA編碼的蛋白相互作用彼此間結(jié)合時，則會導(dǎo)致位于側(cè)翼的BD與AD在空間上接近，呈現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子的完全活性，啟動下游的報告基因如His及LacZ等基因的表達，從而在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長。因此，利用酵母雙雜交系統(tǒng)能夠篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，還可以研究已知蛋白間的相互作用。噬菌體展示技術(shù):在編碼噬菌

19、體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當噬菌體生長時，表面就表達出相應(yīng)的單抗。將這種單克隆抗體做成親和柱，當被分離的蛋白通過親和柱子時，所含有的目的蛋白就會和相應(yīng)的的抗體結(jié)合，而被特異分離。親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù):將某種蛋白質(zhì)以共價鍵固定在基質(zhì)（如瓊脂糖）上，含有與之相互作用的蛋白質(zhì)的細胞裂解液過柱，先用低鹽溶液洗脫下未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后用高鹽溶液或SDS溶液洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白質(zhì)，最后用多維液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù):以細胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細胞總蛋白進行免疫共沉淀純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。

20、蛋白質(zhì)芯片技術(shù):將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析。4、WesternBlot？（老師說就考下面兩題，這是標準答案）（注：概念就是原理）（1）、名詞解釋：蛋白印跡：蛋白印跡，也稱為免疫印跡，是一種分析和鑒定特定蛋白質(zhì)的技術(shù)，用來檢測在不均一的蛋白質(zhì)樣品中是否存在目標蛋白的一種方法。即將混雜的總蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至固相膜(如硝酸纖維素膜、尼龍膜和PVDF膜等)上，再用特定蛋白質(zhì)抗體進行免疫反應(yīng)，顯色后，可顯示出該特定蛋白是否存在及其表達量。（2）、簡答題：蛋白印跡方

21、法的實驗原理及其操作步驟答：（1）實驗原理：蛋白印跡，也稱為免疫印跡，是一種分析和鑒定特定蛋白質(zhì)的技術(shù)，用來檢測在不均一的蛋白質(zhì)樣品中是否存在目標蛋白的一種方法。即將混雜的總蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至固相膜(如硝酸纖維素膜、尼龍膜和PVDF膜等)上，再用特定蛋白質(zhì)抗體進行免疫反應(yīng)，顯色后，可顯示出該特定蛋白是否存在及其表達量。（2）實驗操作步驟（以在PVDF膜上直接顯色為例）：蛋白質(zhì)的分離根據(jù)目的蛋白的性質(zhì)，利用電泳方法將其進行分離。為提高電轉(zhuǎn)移的效率，通常采用SDS/PAGE技術(shù)。分離實驗結(jié)束后，首先將樣品墻的上邊緣用小刀去除，然后在膠板的右上角切一個小口以便定位，小心放

22、入轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。電轉(zhuǎn)移準備PVDF膜：根據(jù)膠的大小剪出一片PVDF膜，膜的大小應(yīng)略微小于膠的大小。將膜置于甲醇中浸泡1分鐘，再移至轉(zhuǎn)移緩沖溶液中待用。制作膠膜夾心：在一淺盤中打開轉(zhuǎn)移盒，將一個預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸泡過的海綿墊放在轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板上，在海綿墊的上方放置經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕的3MM紙，小心地將膠板放在3MM紙上，并注意排除氣泡。將PVDF膜放在膠的上方同時注意排除氣泡，再在膜的上方放上一張同樣用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕過的3MM紙并趕出氣泡，放置另一張浸泡過的海綿墊，關(guān)閉轉(zhuǎn)移盒。將轉(zhuǎn)移盒按照正確的方向放入轉(zhuǎn)移槽中，轉(zhuǎn)移盒的黑色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的黑色端，轉(zhuǎn)移盒的白色篩孔板貼近轉(zhuǎn)移槽的白

23、色端，填滿轉(zhuǎn)移緩沖溶液同時防止出現(xiàn)氣泡。電轉(zhuǎn)移：連接電源，在4°C條件下維持恒壓100V，1小時。免疫檢測封閉：倒出TBS/PBS緩沖溶液，加入封閉緩沖溶液，輕輕搖動至少1小時。清洗：倒掉封閉緩沖溶液，并用TBS/PBS緩沖溶液清洗1-3次， 每次5-10分鐘。一抗：倒掉TBS/PBS緩沖溶液，加入適量的一抗溶液，輕輕搖動1小時以上。清洗：從容器中倒出一抗溶液，用TTBS/PBST緩沖溶液清洗3次，每次10分鐘。二抗：倒出TTBS/PBST 緩沖溶液，加入適量的二抗溶液，輕輕搖動30分鐘左右。清洗：從容器中倒出二抗溶液，用TTBS/PBST緩沖溶液清洗3次，每次10分鐘。檢測：倒掉T

24、TBS/PBST 緩沖溶液，并加入顯影劑，輕輕搖動PVDF膜，觀察顯影情況，當能夠清晰的看到顯色帶時，用蒸餾水在30分鐘內(nèi)分三次清洗PVDF膜以終止顯色反應(yīng)的繼續(xù)進行。實驗結(jié)果：檢查膜上顯色結(jié)果，藍紫色帶所對應(yīng)的即是目標蛋白的位置。5。 利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達蛋白質(zhì)優(yōu)點：積累了相對充分的研究工作，有多種表型的宿主菌和相應(yīng)的載體可供選擇應(yīng)用；易于進行遺傳操作和高效表達；操作安全，致病能力低；生長速度快；培養(yǎng)基廉價，生產(chǎn)成本低；清楚宿主的遺傳背景；表達水平高。缺點：缺乏真核生物的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后加工機制，不宜表達真核生物的蛋白；缺乏表達蛋白復(fù)性系統(tǒng)，表達蛋白無特異性空間結(jié)構(gòu)， 常形成不溶性包涵體

25、(inclusion body) ；表達產(chǎn)物不穩(wěn)定，易被細菌蛋白酶降解；細菌的內(nèi)毒素（熱源）不易除去，會造成人畜發(fā)熱。外源蛋白在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的表達過程：1. 選擇合適的大腸桿菌表達載體（如分泌型表達載體pET28a）。2. 將編碼目的蛋白的基因片段和載體通過連接酶連接，構(gòu)建重組表達載體。3. 將重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主（如DE3）4. 大量培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達對表達的蛋白質(zhì)進行分離純化。6、質(zhì)譜分析與色譜分析的比較？質(zhì)譜分析與色譜分子連用的優(yōu)點？（1）色譜分析：色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動相之間分配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配會不同，這使其隨流動相運動速度各不

26、相同，隨著流動相的運動，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。根據(jù)物質(zhì)的分離機制，又可以分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜、親和色譜等類別。（2）質(zhì)譜分析：使試樣中各組分電離生成不同荷質(zhì)比的離子，經(jīng)加速電場的作用，形成離子束，進入質(zhì)量分析器，利用電場和磁場使發(fā)生相反的速度色散離子束中速度較慢的離子通過電場后偏轉(zhuǎn)大，速度快的偏轉(zhuǎn)小；在磁場中離子發(fā)生角速度矢量相反的偏轉(zhuǎn)，即速度慢的離子依然偏轉(zhuǎn)大，速度快的偏轉(zhuǎn)??；當兩個場的偏轉(zhuǎn)作用彼此補償時，它們的軌道便相交于一點。與此同時，在磁場中還能發(fā)生質(zhì)量的分離，這樣就使具有同一質(zhì)荷比而速度不同的離子聚焦在同一點上，不同質(zhì)荷比的離子聚焦在不同的點

27、上，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量。隨著聯(lián)用技術(shù)的日趨成熟，LC-MS日益顯現(xiàn)出優(yōu)越的性能。它除了可以彌補GC-MS的不足之外，還具有以下幾方面的優(yōu)點：廣適性檢測器，MS幾乎可以檢測所有的化合物，比較容易地解決了分析熱不穩(wěn)定化合物的難題；分離能力強，即使在色譜上沒有完全分離開，但通過MS的特征離子質(zhì)量色譜圖也能分別畫出它們各自的色譜圖來進行定性定量，可以給出每一個組分的豐富的結(jié)構(gòu)信息和分子量，并且定量結(jié)構(gòu)十分可靠；檢測限低，MS具備高靈敏度，它可以在<10-12g水平下檢測樣品，通過選擇離子檢測方式，其檢測能力還可以提高一個數(shù)量級以上，特別是對于那些沒有=> 吸收的樣品

28、，用12 檢測更是得心應(yīng)手；可以讓科學(xué)家從分子水平上研究生命科學(xué)；質(zhì)譜引導(dǎo)的自動純化，以質(zhì)譜給餾分收集器提供觸發(fā)信號，可以大大提高制備系統(tǒng)的性能，克服了傳統(tǒng)UV制備中的很多問題。7、熒光定量PCR和常規(guī)PCR的區(qū)別?熒光定量PCR的特點：特異性強；靈敏度高；可直接對產(chǎn)物進行定量；可解決PCR污染問題；自動化程度高、操作簡單。常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴增反應(yīng)的終產(chǎn)物進行定性及定量分析熒光定量PCR技術(shù)：對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)的產(chǎn)物進行定量分析定量PCR的化學(xué)原理兩種定量化學(xué)染料染色：SYBR®Green I是一種雙鏈DNA小溝結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合時才發(fā)光，游離時不發(fā)光。在傳

29、統(tǒng)PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料能特異性地摻入DNA雙鏈，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，這樣就保證了熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。當PCR循環(huán)復(fù)制時DNA雙鏈也成倍增長，同樣SYBR染料的熒光的信號也隨之增倍，通過實時監(jiān)測整個PCR進程中熒光信號的積累，與標準曲線對比進行定量分析。TaqMan原理：聚合鏈取代Taq酶的5 3外切活性聚合完成TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信

30、號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。再通過實時監(jiān)測整個PCR進程熒光信號的積累，與標準曲線對比進行定量分析。TaqManMGB原理：MGB探針能夠分辨1個堿基的差別；當堿基完全配對，有信號；當一個堿基不配對，就沒有了信號8、蛋白質(zhì)體外表達與現(xiàn)代要學(xué)的聯(lián)系大腸桿菌表達體系的轉(zhuǎn)錄調(diào)控：大腸桿菌的基因多數(shù)以操縱元的形式組成基因表達調(diào)控的單元，操縱元包括相關(guān)結(jié)構(gòu)基因及其上游的調(diào)控序列。乳糖(

31、lac)操縱元的表達調(diào)控是利用阻遏蛋白的負性調(diào)控而實現(xiàn)的：（1）大腸桿菌在沒有乳糖的環(huán)境中生存時，1ac操縱元處于阻遏狀態(tài)。i基因在自身的啟動子pi控制下，產(chǎn)生阻遏蛋白R。R以四聚體形式與操縱子o結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與啟動子P的結(jié)合，阻止基因的轉(zhuǎn)錄起始。 R的阻遏作用不是絕對的，R與O偶爾解離，使細胞中還有極低水平的-半乳糖苷酶及通透酶的生成（本底表達）。 （2）當有乳糖存在時，乳糖受-半乳糖苷酶的催化轉(zhuǎn)變?yōu)閯e的乳糖，與R結(jié)合，使R構(gòu)象變化，R四聚體解聚成單體，失去與O的親和力，與O解離。基因轉(zhuǎn)錄開放，使-半乳糖苷酶在細胞內(nèi)的含量可增加1000倍。這就是乳糖對Iac操縱元得誘導(dǎo)作用。 （3）

32、一些化學(xué)合成的乳糖類似物，不受-半乳糖苷酶的催化分解，卻能與R特異性結(jié)合使R構(gòu)象變化，誘導(dǎo)Iac操縱元得開放。如IPTG。 異丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiog-alactoside IPTG），一種化學(xué)合成的乳糖類似物，能與阻遏蛋白特異性結(jié)合使阻遏蛋白R構(gòu)象變化，誘導(dǎo)lac操縱元的開放，但本身不受-半乳糖苷酶的催化分解而十分穩(wěn)定。CAP(cAMP activated protein)的正調(diào)控（1）cAMP含量與葡萄糖的分解代謝有關(guān)，當細菌利用葡萄糖分解供給能量時，cAMP生成少，cAMP含量低；相反，當環(huán)境中無葡萄糖可供利用時，cAMP含量就升高，cAMP與cAMP的受體蛋白 C

33、RP （cAMP receptor protein）結(jié)合變?yōu)镃AP，并以二聚體的方式與特定的DNA序列結(jié)合。 在缺乏葡萄糖的培養(yǎng)基中時，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等啟動子的功能。一些依賴于CRP的啟動子缺乏一般啟動子所具有的典型的序列特征。因此RNA聚合酶難以與其結(jié)合。CAP能提高RNA聚合酶與啟動子結(jié)合常數(shù)： CAP通過改變啟動子的構(gòu)象以及與酶的相互作用幫助酶分子正確定向，以便DNA結(jié)合。 CAP還能抑制RNA聚合酶與DNA中其它位點的結(jié)合，從而提高與其特定啟動子結(jié)合的概率。（2）在Iac操縱元的啟動子P上游有一段序列與P部分重疊的序列，能與CAP特異結(jié)合，成為CAP結(jié)合位點。CAP與這段序列結(jié)合時，可增強RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性，使轉(zhuǎn)錄提高50倍。相反，當有葡萄糖可供分解利用時，cAMP濃度降低，CRP不能被活化，lac 操