1、二代測序（NGS）實驗實施方案和 應(yīng)用1 / 102 / 10作者:日期:個人收集整理，勿做商業(yè)用途這里為您介紹二代測序的相關(guān)流程和應(yīng)用。隨著人類基因組工程的完成，對于低花費的測序技術(shù)的需求促進了高通量二代測序技術(shù)的發(fā)展。這些新的測序平臺允許進行高通量測序，具有廣泛的應(yīng)用： 全基因組從頭測序或者重測序 目標序列重測序 轉(zhuǎn)錄組分析 微生物組研究 基因調(diào)控研究NGS序列二代測序儀器有很多種組合，在通量、片段長度、準確度、每一輪測序成本、每百萬堿基對測序成本、初始成本、規(guī)格和技術(shù)方面存在 存在差異。從規(guī)格和初始成本的角度而言，二代測序儀器可輕松地分類為更窄的范圍，也就是所謂的臺式測序儀”和高通量儀器

2、。臺式測序儀使得任何實驗室都可以像使用real-time PCR 一樣，自己進行測序。這些儀器可以和一些靶標序列富集技術(shù)相結(jié)合，用在一些臨床的應(yīng)用中，其中：選定的靶標基因用于深度分析，以檢測稀有的突變，或者檢測多樣樣本中（比如癌癥樣本）中的突變。目前，這些儀器的通量在10 Mb到7.5 Gb之間，但是隨著硬件，軟件和試劑的持續(xù)改善，通量也在穩(wěn)步增加。高通量測序儀非常適合于大量的，基因組范圍的研究，每次測序能測定600 Gb的序列。一些這樣的高通量和高精度的平臺，能測定的片段長度相對較短，這對于高重復性的序列和未知基因組的從頭測序就可能成為問題。與此相反，也有一些儀器能測序的片段較長（達到250

3、0 bp ）,但是其精度和測序能力（90 Mb）要低很多。還有一些測序能力位于兩者之間的儀器（800 bp , 700 Mb ）。因此，應(yīng)用決定了哪一種儀器是最合適的。有一種新的方法被稱作 納米孔測序這種技術(shù)中，根據(jù)一個 DNA鏈通過一個合成的或者蛋白納米孔道所引起的電流的改變，可以確定通過這個孔道的堿基。這理論上可以僅用一步就測序一個完整的染色體，而不需要生成新的DNA鏈。DNA測序二彳t DNA測序的工作流程如下： DNA樣本制備 文庫構(gòu)建和驗證 文庫分子大規(guī)模平行克隆擴增 測序二代測序DNA樣本的質(zhì)量控制首先，評價基因組 DNA的質(zhì)量是非常必要的（完整性和純度）凝膠電泳法3 / 10基因

4、組DNA的完整性和大小，可以用常規(guī)或者脈沖場瓊脂糖凝膠電泳 （PFGE）來檢測。常規(guī)的凝膠電泳的精確度不高， 這是因為大的DNA 分子在凝膠中移動的時候，本質(zhì)上是用一種與尺寸無關(guān)的方式一起移動的。但是，它仍然能夠提供完整性（大小范圍）和純度（RNA污染物在凝膠底部形成脫尾條帶）方面的有效信息。因此，它仍然是評價基因組DNA質(zhì)量的有效方法之一。注：RNA污染會導致DNA濃度高估，并且抑制一些下游步驟。如果能肯定有RNA污染，則可使用去 DNase的RNase I處理樣本。分光光度測定法分光光度儀在260 nm和280 nm處讀數(shù)的比例（A260/A280 ）可以用來估計 DNA相對于一些吸收紫外

5、光的雜質(zhì)（比如蛋白）的純度。純 凈的DNA的A260/A280比例大約為1.7 T.9。注：想要獲得精確的 A260/A280值，需要在弱堿性的緩沖溶液中測定吸光度此如，10 mM Tris?Cl, pH 7.5）。第二個步驟是測定基因組 DNA的濃度。分光光度法DNA的濃度可以通過使用分光光度儀測定其在260 nm波長的吸光度來確定。Nanodrop目前被廣泛使用，因為它需要的樣本量少（10.1至I1.0之間。并且使用方便（不需要比色皿）。為了確保結(jié)果的可靠性，讀數(shù)應(yīng)該在注：吸光度測定不能區(qū)別 DNA和RNA。RNA污染物會導致 DNA濃度高估。但是，純凈 RNA的A260/A280比值在2

6、.0左右，而純凈的DNA大約為1.8。因此，如果這個值為1.95,那么說明樣本里面有 RNA雜質(zhì)。注：苯酚在270 275 nm的波長范圍內(nèi)有最大的吸光度，非常接近于 DNA。因此苯酚能提高樣本在260 nm附近的吸光度，從而導致高 估DNA的產(chǎn)量和純度。熒光法熒光法使用熒光染料測定 DNA的濃度，具有特異性和靈敏性。Hoechst 33258結(jié)合到DNA上后，能增大458 nm波長附近的發(fā)光強度，除此之外，也可以使用一些更加靈敏的熒光染料，比如PicoGreen染料。基于PicoGreen染料的實驗，比紫外吸光光度法靈敏10, 000倍，而比使用Hoechst 33258染料的方法至少靈敏

7、400倍。和紫外吸光光度法不同，PicoGreen實驗對雙鏈DNA的選擇性要遠高于 RNA 和單鏈DNA。DNA標準品和樣本與熒光染料混合，并且使用熒光計檢測。將樣本的測定結(jié)果與標準品的測定結(jié)果相比較，以確定DNA的濃度。Real-time PCR可以使用real-time PCR 技術(shù)來測定DNA樣本的數(shù)量和質(zhì)量。多重 PCR技術(shù)使用引物集在多個位點擴增不同大小的片段，是檢測DNA損傷和片段化的有效質(zhì)控手段。此類技術(shù)試驗專門測定可經(jīng)PCR擴增，適于二代測序的 DNA分子。上述提到的這些常規(guī)方法，通常不能測定的樣本中擴增得到的DNA的量，或者會高估了 DNA的量。與它們相比，real-time

8、 PCR 更加適用于預(yù)測 DNA樣本是否適合于二代測序。文庫制備4 / 10對于大多數(shù)商業(yè)化的二代測序平臺，使用諸如橋式擴增或者乳液PCR方法，對文庫中的 DNA片段進行克隆擴增，以產(chǎn)生足夠拷貝數(shù)量的測序模板非常必要。 通過將平臺特異性的適配子與感興趣的DNA源（比如基因組 DNA、雙鏈cDNA或者PCR擴增子等所產(chǎn)生的 DNA片段）退火，得到片段文庫。適配子序列的存在，使得我們可以對文庫分子進行選擇性的克隆擴增。因此，這種方法不需要像傳統(tǒng)的方法那樣，在微生物中間體中，對基因組片段進行微生物克隆。另外，適配子序列中，還含有平臺特異性的測序引物的結(jié)合位點。通常情況下，一個常規(guī)的 DNA文庫構(gòu)建方

9、案包含四步： 片段化DNA 對DNA片段進行末端修復 連接適配子序列（不適用于單分子測序） 對可選的文庫進行擴增目前有四種方法用于產(chǎn)生基因組 DNA碎片：酶消化法、超聲波法、噴霧法和水動力剪切法。這四種方法都可以用于文庫構(gòu)建，但是每一 種方法都有其優(yōu)點和局限性。核酸內(nèi)切酶消化的方法快速并且容易，但是難以精確的控制片段長度的分布。另外這種方法可能會對基因組DNA的呈遞引入偏倚。另外三種技術(shù)使用物理的方法將DNA的雙鏈打斷，這種斷裂是隨機的，因此能在文庫中對DNA進行無偏的呈遞。可以使用瓊脂糖凝膠電泳或者自動化的DNA分析方法，對DNA片段的尺寸分布進行控制。片段化DNA之后，需要將DNA修復，產(chǎn)

10、生5磷酸化的平末端 DNA ,以便能夠和測序平臺特異性的適配子相連接。文庫構(gòu)建的效率直接 依賴于DNA末端修復的效率和準確性。末端修復混合溶液將 5或者3的粘性末端轉(zhuǎn)變成 5磷酸化的平末端 DNA。在大多數(shù)情況下，末端修復通過 T4 DNA聚合酶的5一舞合 酶活性和3一酌核酸外切酶活，性完成。而 T4多聚核甘酸激酶確保平末端的DNA片段5端的磷酸化，以便進行后續(xù)的適配子連接。根據(jù)所使用的測序平臺，平末端 DNA片段可以直接與適配子連接，或者需要在其片段的3端增加一個單獨的突出的腺甘酸A,以便與平臺特異性適配子上突出的胸背酸 T相互配對。通常情況下，使用Klenow片段（具有最低的3到5端的核酸

11、外切酶活性），或者使用其它具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的聚合酶催化這一步驟。T4 DNA連接酶將雙鏈的適配子與文庫片段修復過的末端相連，然后使用回收反應(yīng)或者根據(jù)DNA的尺寸，選擇性去除文庫中未連接的適配子和適配子二聚體。大小篩選方法包括使用瓊脂糖凝膠電泳分離，使用磁珠或者使用高等的基于柱的純化方法。在連接過程中可能出 現(xiàn)適配子的二聚體，它們會和與適配子連接的文庫片段共同擴增，從而降低測序平臺對真正文庫片段測序的能力并且降低測序的質(zhì)量， 因此在測序之前，必須將它們從文庫中除去。一些測序平臺要求文庫片段的長度分布在比較窄的范圍內(nèi)，以得到最佳的結(jié)果，很多時候， 這只能通過去除凝膠電泳上的相應(yīng)的片段條帶實現(xiàn)。這

12、種方法也可以用來去除適配子二聚體。完成這一步驟之后，應(yīng)該對 DNA片段文庫的質(zhì)量進行檢測，并進行定量檢測。根據(jù)濃度和測序文庫的適配子設(shè)計，既可以直接稀釋溶液 并用于測序，也可以對文庫進行選擇性擴增。在文庫擴增階段，使用高保真的DNA聚合酶，合成完整的適配子序列，通過與 PCR引物的重疊，用于后續(xù)的克隆擴增和與測序引物結(jié)合，或者提高DNA文庫的產(chǎn)量。為了得到最佳白文庫擴增結(jié)果，要求 DNA聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚。文庫質(zhì)量評估方法，參見 NGS文庫質(zhì)控。為了充分利用測序能力，不同樣本得到的測序文庫可以放在一起，在同一輪實驗中一同測序。通過將DNA片段與具有不同特征的適配子相連接，可以實

13、現(xiàn)這一過程，即對于每一個樣本使用不同的短核甘酸序列作為適配子。5 / 10有一些其它的方法可以用于簡化文庫構(gòu)建。有一種新方法使用轉(zhuǎn)位酶/DNA的復合物進行體外轉(zhuǎn)座，以便在同一個試管中同時將DNA片段化并標記。通過對所標記的 DNA片段進行有限次數(shù)的 PCR擴增，可以構(gòu)建完整的測序文庫，這節(jié)省了操作步驟和時間。但是，使用 體外轉(zhuǎn)座構(gòu)建的文庫，與傳統(tǒng)方法構(gòu)建的文庫相比，具有更高的序列偏倚。NGS文庫質(zhì)控高質(zhì)量的文庫是成功進行第二代測序的關(guān)鍵。文庫構(gòu)建包含復雜的步驟，比如片段化樣本、修復末端、將末端腺甘酰化、連接適配子和 擴增文庫。根據(jù)使用的平臺和文庫類型，這些步驟也會發(fā)生變化。監(jiān)控每一個步驟非常必

14、要，包括在片段化樣本之后檢查片段的尺寸， 以及連接適配子之后檢查片段的大小和濃度。文庫驗證過程中，需要分析文庫中片段的大小和數(shù)量，這是質(zhì)控的最后步驟。評估文庫中片段的大小瓊脂糖和PAGE凝膠電泳是傳統(tǒng)的檢測片段大小的方法，它們比較耗時。最近，基于微流技術(shù)的電泳或者毛細管電泳越來越廣泛的用于檢測片段的大小和濃度。即買即用的芯片和膠盒省去了配置凝膠的步驟， 使用方便。它們具有更高的通量，并且省去了很多的手動操作時間。除此之外，它們的靈敏度更高（對于檢測的限制更少），并且能完 全自動化的獲取數(shù)據(jù)和輸出電子化的數(shù)據(jù)資料。這些儀器能同時檢測片段的大小和濃度。 測定文庫中的片段數(shù)量 分光光度法和熒光法 參

15、見分光光度法和熒光法電泳設(shè)備如前所述，基于微流技術(shù)的電泳和毛細管電泳除了提供片段大小的信息之外，還提供了定量檢測數(shù)據(jù)。但是，電泳、分光光度法和熒光 法的一個共同的局限性是，都只檢測總的核甘酸的濃度，而非與適配子連接的分子的濃度。Real-time PCR將適配子連接到文庫分子的兩端，使得可以在平行的PCR擴增步驟中擴增上百萬個獨立的DNA分子（乳液PCR或者橋式PCR）。在有些儀器中，乳液PCR可以將一個DNA分子擴增到數(shù)百萬個相同序列的拷貝，并全都結(jié)合在同一個珠子上。在另一種平臺上，橋式PCR能夠?qū)⒁粋€DNA分子轉(zhuǎn)變成一個包含相同序列的多個拷貝的DNA簇。因此，兩端連接了適配子的擴增之后的分

16、子，決定了乳液PCR中模板和珠子的比例以及橋式 PCR中產(chǎn)生的最佳DNA簇。對擴增后的文庫中的分子進行精確的定量檢測，對于確保片段的質(zhì)量和高效的獲得數(shù)據(jù)是非常重要的。低估擴增文庫中的分子數(shù)量，會導致混雜的信號以及難以解析的數(shù)據(jù)；相反地，高估分子的數(shù)量會降低結(jié)合模板的珠子或者DNA簇的產(chǎn)量，并且沒有充分利用測序能力。Real-time PCR能夠特異性的定量檢測兩端結(jié)合有適配子的DNA分子，因此能夠?qū)U增文庫中的分子進行高度精確的定量檢測。Real-time PCR的靈敏性非常高，可以對濃度非常低的文庫分子進行定量檢測，即使其濃度低于傳統(tǒng)方法可以檢測的閾值。因此，這種 方法能盡量減少對文庫的擴增

17、，降低可能的偏倚。用于決對定量檢測的數(shù)字 PCR6 / 10數(shù)字PCR能夠?qū)Χ鷾y序的文庫進行絕對定量檢測， 而不需要標準品。這個技術(shù)對文庫進行有限的稀釋， 并進行大量獨立的 PCR反應(yīng); 因此，大多數(shù)反應(yīng)沒有模板，得到陰性的結(jié)果。一個單獨的陽性PCR反應(yīng)統(tǒng)計為一個單獨的模板分子。通過統(tǒng)計所有陽性PCR的數(shù)量,能夠確定文庫分子的絕對數(shù)目。數(shù)字 PCR的主要優(yōu)點在于： 單分子的敏感性 與PCR擴增的效率無關(guān)，因為成功的擴增被統(tǒng)計為一個分子，而與最終產(chǎn)物的數(shù)量無關(guān)但是，這種技術(shù)需要特殊的儀器，并且花費較高，因此尚未廣泛用于文庫定量檢測。宏基因組學MetagenomicsDNA測序的應(yīng)用領(lǐng)域之一是宏

18、基因組領(lǐng)域，即從環(huán)境樣本中直接回收的遺傳物質(zhì)的非培養(yǎng)研究。宏基因組學是指一個環(huán)境樣本中所包含的所有微生物基因組的功能和序列分析。這個詞匯起源于“meta”（在這里指對于基因多樣性的系統(tǒng)性理解）和“genomics”（對一個物種的遺傳物質(zhì)的綜合分析）。宏基因組不是一個新的學科，但由于二代測序技術(shù)所帶了的諸多可能性，宏基因組的應(yīng)用經(jīng)歷了巨大的提升。據(jù)估計，微生物中僅有 1%左右是可培養(yǎng)的，因此宏基因組學的研究能極大的拓展我們對于環(huán)境的認識。很多年以來， 宏基因組這個詞匯僅與環(huán)境樣本的分析有關(guān)，比如，分析從極端的生存環(huán)境下分離得到的DNA,以便發(fā)現(xiàn)能用于工業(yè)的新的生物催化劑。但是，通量的極大提高，以

19、及所花費的費用和時間的降低，將這個領(lǐng)域的應(yīng)用擴展到了很多其他方面。宏基因組學可分成幾個領(lǐng)域，包括： 病理基因組學/感染基因組學 微生物組分析 環(huán)境宏基因組學注：這并不是全面的分類，研究者可以選擇其他的分類標準。病理基因組學/感染基因組學和疾病的診斷相關(guān)，用于確定有疾病癥狀的患者體內(nèi)未知的病原體。這通常是極具挑戰(zhàn)性的過程，因為微生物的數(shù)量可能非常少（每毫升血液中大概有1T0個細胞）。與之相反，微生物組分析則涉及到數(shù)量巨大的微生物，比如口腔或者直腸拭子中的微生物。此時，我們的目標是分析這些菌群的組成。考慮到人體僅包含1%的人類細胞而其它 99%都是微生物細胞，微生物組分析在未來的診斷技術(shù)中有潛在的

20、巨大應(yīng)用。更多細節(jié)，請見 人類微生物組工程（ ）。環(huán)境宏基因組學的目標除了包括傳統(tǒng)的尋找新的生物催化劑之外，還包括研究和鑒定棲息環(huán)境。 從理論上來講，環(huán)境宏基因組學有兩種不同的研究方法： 全基因組分析：又t所有存在的DNA進行測序 16S分析：僅對16S rRNA DNA 進行測序7 / 10第一種方法只是簡單的對樣本中存在的所有DNA進行測序。這可以完整地描繪所有出現(xiàn)過的微生物，并且可能發(fā)現(xiàn)新的酶或者酶家族，以及抗生素的抗性。另一方面，這種方法需要較高的測序能力，因而，相對于第二種方法，其通量較低并且花費較高。與此相關(guān)的進一 步的方法正在研發(fā)。在宏基因組的應(yīng)用中

21、，通常需要能提供較高的片段長度的測序儀，這是因為通常沒有參考序列可供參照。對于16S rRNA分析而言，測序儀的讀長需要覆蓋整個區(qū)域（另請參照二代測序儀）。RNA測序RNA測序（RNA-seq ）是使用深度測序技術(shù)來研究生物體轉(zhuǎn)錄組的方法。此方法在構(gòu)建合適的文庫之后，對樣本中的RNA直接測序，得到豐富的數(shù)據(jù)集以進行分析。這項技術(shù)的高靈敏度和高分辨率使得它成為研究整個轉(zhuǎn)錄情形的有價值的工具。數(shù)據(jù)的定量性以及測序 技術(shù)的高動態(tài)范圍使得其對基因表達的分析具有高度的靈敏性。數(shù)據(jù)的單個堿基的分辨率提供了關(guān)于單核甘酸多態(tài)性（SNP）、選擇性剪接、外顯子/內(nèi)含子邊界、非翻譯區(qū)及其它元件的詳細信息。除此之外，

22、RNA-seq不需要預(yù)先知道參考序列，這使得從頭的轉(zhuǎn)錄組分析和新的變異體和突變體的檢測成為可能。RNA-seq是研究轉(zhuǎn)錄組的強大、革命性方法，但是使用這種技術(shù)需要非常仔細以獲得最高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。RNA-seq中需要考慮的因素第一個需要考慮的因素是樣本富集。總RNA通常只包含比例很少的編碼 RNA或者功能RNA ;樣本中大部分 RNA是核糖體RNA （rRNA:大約占到了總 RNA的80 $0% ）和較少的轉(zhuǎn)運 RNA （tRNA）。為了避免將 80 40%的測序資源用在重復的 rRNA序列上，通常在測序之 前，需要從樣本中去除 rRNA。這通常可以通過特定的消耗 rRNA實現(xiàn)，也可以通過使用寡聚

23、胸腺嗑咤富集技術(shù)選擇性富集Poly A實現(xiàn)。消耗rRNA的方法可以同時保留編碼RNA和非編碼RNA （一項非常重要的研究內(nèi)容）的信息，而 Poly A富集則僅保留了編碼 mRNA。Poly A富集可能會丟掉特定的 RNA和具有高轉(zhuǎn)換率的 RNA。有一些其他的方法可以避免rRNA的影響，比如選擇性降解大量轉(zhuǎn)錄物，或者不擴增 rRNA的擴增技術(shù)。但是這些方法不像rRNA消耗或者poly A富集那么常見，并且可能扭曲轉(zhuǎn)錄物表征的正常水平。另外一個需要考慮的因素是要研究的RNA的大小。RNA轉(zhuǎn)錄物跨越比較大的大小范圍；與常規(guī)的 RNA分析相比，關(guān)注小 RNA的實驗（比如microRNA或者長度范圍在1

24、5 -35bp的RNA ）,需要特別的純化和文庫構(gòu)建方案。大多數(shù)其他大小的 RNA片段可以同時測序（RNA測序的常用步驟之一是將 RNA分割成普通長度，比如 200 T00 nt長度的片段）。RNA-seq測序操作步驟一旦確定了移除核糖體的方法和要研究的片段大小，就可以將RNA構(gòu)建成一個文庫。對于大多數(shù)測序儀器而言，這包括首先將RNA打碎成片段，其次通過逆轉(zhuǎn)錄方法構(gòu)建雙鏈 cDNA。在后續(xù)的文庫構(gòu)建過程中，這些雙鏈的 cDNA被當作普通的基因組 DNA來對待。如果 想要保留RNA的直接信息（鏈型），必須使用修改過的文庫構(gòu)建方案，比如將mRNA與連接適配子直接相連，或者標記 cDNA的一條鏈以便

25、在測序之前移除。在進行測序計劃過程中，需要考慮三個主要的因： 測序深度、讀長和是否使用雙端測序數(shù)據(jù)。測序深度可以提供 RNA轉(zhuǎn)錄物的豐度信息，并且較大的測序深度使得對于稀有轉(zhuǎn)錄物的檢測更加靈敏。讀長也很重要，因為較長的讀段對于檢測剪接事件更加靈敏（內(nèi)含子的卜顯子邊界，外顯子的卜顯子邊界）。雙端測序數(shù)據(jù)能提供更多關(guān)于轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)的信息，特別是相互分隔的較遠的外顯子。一般而言，從頭分析以及尋找新的結(jié)構(gòu)變異要求較高的測序深度和讀長，并且會得益于雙端測序數(shù)據(jù)。典型的測序應(yīng)用包含100 -200 M片段，長度為2 x50 100 bp。與之相反，表達分析得益于較高的測序深度，但是讀長和雙端測序數(shù)據(jù)則對結(jié)果

26、的改善作用較小。這方面應(yīng)用的一個典型實驗包含10-30 M片段，讀長為 1 x 35 100 bp。8 / 10基因調(diào)控研究二代測序技術(shù)也是研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的強有力的工具。比如ChIP-seq技術(shù)（染色質(zhì)免疫共沉淀測序）可以用于分析蛋白-DNA的相互作用二代測序技術(shù)也能用于確定基因組的全局甲基化模式。ChIP-Seq染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）是用于研究轉(zhuǎn)錄因子和修飾組蛋白基因調(diào)控機制的強大、多功能方法。這種技術(shù)用于確定活細胞中染色質(zhì) 上那些與轉(zhuǎn)錄因子、共調(diào)節(jié)因子、修飾組氨酸、染色質(zhì)重塑蛋白或者其它的核因子相互結(jié)合的區(qū)域。整個操作過程非常耗時，包含了很多步驟和變量，每一個步驟都需要研究者根

27、據(jù)自己的模型體系進行優(yōu)化。將細胞與甲醛交聯(lián)之后，將染色質(zhì)中共價相連的基因組 DNA和核因子復合物分離出來，然后經(jīng)過超聲波處理，剪切成可以處理的大小。抗體與目標核蛋白特異性免疫共沉淀時，也將與這些核蛋白特異性結(jié)合的基因組DNA也沉淀下來了。去除化學交聯(lián)并經(jīng)過核酸純化處理的這些DNA可用于測序、基于微陣列的基因組雜交或者 PCR擴增。ChIP與二代測序技術(shù)聯(lián)用（ChIP-Seq ）可研究與感興趣蛋白相結(jié)合的位點在基因組的范圍內(nèi)的分布。與微陣列分析（ChIP-Chip）相比，ChIP-Seq技術(shù)提供了較高的空間分辨率，動態(tài)范圍和基因組覆蓋度，因而它對于DNA結(jié)合位點的檢測具有超級的靈敏度和準確度。另

28、外，ChIP-Seq技術(shù)通常只要很少的起始樣本輸入量，并且不需要雜交探針，具有較高的靈活性，任何測序過基因組的物種都可以使用這種方法進行研究。高效的ChIP-Seq過程需要優(yōu)化幾個關(guān)鍵的變量。首先，甲醛交聯(lián)的溫度和時間需要優(yōu)化。如果蛋白和DNA交聯(lián)的過于緊密，則在測序之前無法將染色質(zhì)有效地打碎成片段，并且去除交聯(lián)也會遇到困難。通常情況下，最好以在37C下與1%的甲醛共培育10分鐘起始，然后在此基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化。有幾種不同的方法可以將染色質(zhì)打成碎片，比如超聲波和酶消化（比如使用微球菌核酸酶）。如果使用二代測序技術(shù)來分析免疫共沉淀的DNA ,染色質(zhì)碎片的大小應(yīng)在大約100 300核甘酸長度范圍內(nèi)，

29、并且每一個測試系統(tǒng)中（細胞的類型、組織的類型），將染色質(zhì)打碎成片段的參數(shù)也需要嚴格優(yōu)化。ChIP實驗的成功與否取決于所使用的抗體的量和特異性。最好選用能從多家抗體廠商處獲得的，經(jīng)過ChIP實驗驗證的抗體。為了確定抗體能特異性地沉淀目標蛋白，可以使用蛋白印跡技術(shù)檢測核提取物。如果在結(jié)果中，僅能觀察到一條特定大小的條帶，則可認為該抗 體是特異性的。使用選定的抗體進行免疫共沉淀，然后通過蛋白印跡分析技術(shù)確定抗體是否能特異性的沉淀目標蛋白。如果這樣的實驗 失敗了，那么還可以將選定的抗體與培養(yǎng)的細胞進行免疫熒光試驗。如果僅有細胞核顯色，則說明抗體至少能特異性的識別一種位于細 胞核內(nèi)并可結(jié)合到 DNA上面

30、的蛋白。根據(jù)目標蛋白的豐度，經(jīng)過驗證的抗體的量以及用于免疫共沉淀的染色質(zhì)的量必須經(jīng)過優(yōu)化，以便獲得足夠的DNA進行測序。對于識別組蛋白和組蛋白修飾的抗體而言，每一次免疫共沉淀反應(yīng)大概需要100, 000到1百萬個細胞中的染色質(zhì)。如果轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的動態(tài)性較高或者與組蛋白相比，僅在有限的基因組位點上結(jié)合，那么實驗就需要更多的染色質(zhì)。為避免多余的抗體與非目標蛋白和染色質(zhì)的非特異性結(jié)合，同時保證能沉淀足夠多的目標蛋白，每一次免疫共沉淀反應(yīng)使用的抗體的數(shù)量也非常重要。通常而言，1T0四的抗體即可得到合理的結(jié)果。可以用對照反應(yīng)來比對 ChIP反應(yīng)的特異性。在平行的 ChIP反應(yīng)中，使用同樣數(shù)量的染

31、色質(zhì)，可以使用同型的對照抗體或者沒有抗體的珠子用來比照抗體和珠子與蛋白和染色質(zhì)的非特異性的結(jié)合。通過比較陰性對照樣本和ChIP樣本中在特定位點沉淀的 DNA的量，能計算這個位點的富集因子。但是，在這種免疫共沉淀對照實驗中得到的沉淀物的量通常很少，不足以提供足夠的片段進行二代測序。因此，ChIP-Seq實驗通常使用輸入對照樣本作比對。在這種情況下，每個 ChIP反應(yīng)中通常有1%交聯(lián)并且打碎的染色質(zhì)被用來去除交聯(lián)并且與沉淀的樣本一同純化并進行后續(xù)的深度測序。這使得我們可以比對由于打碎染色質(zhì)所引起的偏移，這些偏移表現(xiàn)在染色質(zhì)的局部結(jié)構(gòu)，DNA擴增，測序，拷貝數(shù)量的變化，以及測定基因組區(qū)域的能力。9 / 10在沉淀的DNA碎片去除交聯(lián)和純化之后，建議使用 real-time PCR 技術(shù)確認與目標蛋白結(jié)合的基因組位點的回收和富集效果。通過比較 輸入對照組與 ChIP