1、第十三章第十三章 核酸的生物合成核酸的生物合成Biosynthesis of Nucleic Acids 1958 年年 Crick 提出中心法則的概念：提出中心法則的概念：DNA RNAProtein一、一、DNA的生物合成的生物合成1、信息流與中心法則、信息流與中心法則 1961 年年 法國巴塞爾研究所法國巴塞爾研究所 Jacob 和和 Monod 發現發現 mRNAProteinDNA RNA復制復制轉錄轉錄1965 年年 破譯了遺傳密碼破譯了遺傳密碼20 世紀六十年代的信息流概念：世紀六十年代的信息流概念：轉譯轉譯翻譯翻譯1970 年年 美國有兩家實驗室分別獨立地發現了美國有兩家實驗室

2、分別獨立地發現了 逆轉錄酶。從那時至今，中心法則概逆轉錄酶。從那時至今，中心法則概 念為：念為：ProteinDNA RNA轉譯轉譯逆轉錄逆轉錄轉錄轉錄復制復制復制復制復制復制：DNA（或（或 RNA）以自己為模板，合成與自己）以自己為模板，合成與自己 完全相同的完全相同的 DNA（或（或 RNA）的過程叫復制。）的過程叫復制。轉錄轉錄：以：以 DNA 為模板，按堿基配對原則合成相應為模板，按堿基配對原則合成相應 RNA鏈的過程，叫轉錄。鏈的過程，叫轉錄。翻譯翻譯：以：以 mRNA 為模板，按為模板，按 mRNA 上每三個核苷上每三個核苷 酸決定一個氨基酸的原則合成特定多肽鏈的酸決定一個氨基酸

3、的原則合成特定多肽鏈的 過程叫翻譯（或轉譯）。過程叫翻譯（或轉譯）。逆轉錄逆轉錄：以：以 RNA 為模板，按堿基配對原則合成相應為模板，按堿基配對原則合成相應 DNA鏈的過程，叫逆轉錄。鏈的過程，叫逆轉錄。 親代親代DNA分子分子2、 DNA的半保留復制的半保留復制：DNA復制時，兩條鏈分開，分別復制時，兩條鏈分開，分別以每一條鏈為模板，按堿基配對原則，合成對以每一條鏈為模板，按堿基配對原則，合成對應的互補鏈。結果，由一個應的互補鏈。結果，由一個 DNA 分子形成了兩分子形成了兩個與原來的個與原來的 DNA 分子完全相同的分子完全相同的 DNA 分子。分子。由于子代由于子代 DNA 分子中的兩

4、條鏈，一條來自親代分子中的兩條鏈，一條來自親代 DNA，另一條是新合成的，所以就稱這種復制，另一條是新合成的，所以就稱這種復制方式為半保留復制。方式為半保留復制。 15NDNA（14N- -15N）DNA14NDNA（14N- -15N）DNA3、DNA復制的起點和方式復制的起點和方式 復制子復制子：基因組能獨立進行復制的單位：基因組能獨立進行復制的單位叫復制子，其含有控制復制起始的起點，可叫復制子，其含有控制復制起始的起點，可能還有終止復制的終點。能還有終止復制的終點。復制叉復制叉：DNA合成時的生長點。合成時的生長點。4、原核生物原核生物 DNA 的復制的復制 實驗材料：大腸桿菌（實驗材料

5、：大腸桿菌（E.coli）、DNA聚合反應有關的酶聚合反應有關的酶、DNA 聚合酶聚合酶 DNA 指導下的指導下的 DNA 聚合酶聚合酶或：或： 依賴于依賴于 DNA 的的 DNA 聚合酶聚合酶 1956年，美國年，美國Kornberg（獲（獲1959年諾貝爾獎）年諾貝爾獎）（ Kornberg 酶）酶） DNA聚合酶聚合酶：相對分子質量：相對分子質量：103 000，由，由單一鏈組成，活性部位含有單一鏈組成，活性部位含有 Zn2+。DNA 聚合酶聚合酶催化反應的條件：催化反應的條件：n1dTTP+DNAn4dCTPn3dGTPn2dATPMg2+DNA Pol1dAMPn2dGMPn3dCM

6、Pn4DNA+dTMPn1(n1+n2+n3+n4)PPi引物引物（模板）（模板） 底物（底物（dNTP）、模板（）、模板（DNA）、）、 引物（必須具有游離的引物（必須具有游離的3- -OH）、）、Mg2+DNA 聚合酶聚合酶的特點：的特點： A聚合反應具有方向性，新合成鏈的延聚合反應具有方向性，新合成鏈的延伸方向為伸方向為 5 3聚合反應不能從頭開始，必須要有引物。聚合反應不能從頭開始，必須要有引物。新合成鏈的性質完全取決于模板鏈的性質新合成鏈的性質完全取決于模板鏈的性質 模板：模板：DNA DNA 聚合酶聚合酶：E.coliDNA 聚合酶聚合酶是一個多功能的酶：是一個多功能的酶： 具有從

7、具有從 5 3聚合酶功能聚合酶功能 具有從具有從 3 5核酸外切酶功能核酸外切酶功能 具有從具有從 5 3核酸外切酶功能核酸外切酶功能 DNA聚合酶聚合酶：催化：催化DNA合成的速度只有合成的速度只有體內體內 DNA復制速度的復制速度的 1%；持續合成能力低；許；持續合成能力低；許多影響多影響DNA復制的基因突變均與酶復制的基因突變均與酶無關。無關。1969 年發現一年發現一 E.coli 突變株，突變株，DNA 聚合酶聚合酶活力只活力只有野生型酶活力的有野生型酶活力的 0.51%，其復制正常進行，其復制正常進行，但損傷修復功能缺陷。但損傷修復功能缺陷。、DNA 聚合酶聚合酶和和 197019

8、71 年年 DNA 聚合酶聚合酶和和 與聚合酶與聚合酶的的共同點共同點：在聚合反應中，要模：在聚合反應中，要模板、引物、板、引物、Mg2+、dNTP、聚合方向：、聚合方向：5 3、均、均具有具有 3 5核酸外切酶功能。核酸外切酶功能。 與聚合酶與聚合酶的的區別區別：無：無 5 3核酸外切酶功核酸外切酶功能。另外，三個酶的活力（聚合速度、持續合成能。另外，三個酶的活力（聚合速度、持續合成能力）也各不相同。能力）也各不相同。DNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶結構基因結構基因*pol Apol Bpol C=dna E分子數細胞分子數細胞4001001020不同種類亞基數目

9、不同種類亞基數目1710相對分子質量相對分子質量103 00088 000*830 00035核酸外切酶核酸外切酶53核酸外切酶核酸外切酶 聚合速度聚合速度 （核苷酸分）（核苷酸分）1 0001 2002 40015 00060 000持續合成能力持續合成能力32001 500500 000功能功能切除引物、修復切除引物、修復修復修復復制復制 * ：對于多亞基酶，僅列出聚合活性亞基的結構基因：對于多亞基酶，僅列出聚合活性亞基的結構基因* ：僅聚合活性亞基。聚合酶：僅聚合活性亞基。聚合酶和和共有許多輔助亞基共有許多輔助亞基 酶酶的溫度敏感條件致死突變株于的溫度敏感條件致死突變株于45以上環境中，

10、酶以上環境中，酶將失活。將失活。 酶酶為多亞基酶。為多亞基酶。DNA聚合酶聚合酶全酶由全酶由10個亞基組成，含有個亞基組成，含有 Zn 原子。原子。具催化活性具催化活性具具 3 5外外切酶功能切酶功能組建核心酶組建核心酶使核心酶使核心酶二聚化二聚化具依賴具依賴 DNA 的的ATP 酶活酶活力力夾子裝置器，夾子裝置器，幫助幫助 -亞基亞基夾住夾住 DNA滑動夾子，使酶滑動夾子，使酶具持續合成能力具持續合成能力在在 復合物的幫復合物的幫助下，助下， 夾子夾夾子夾住模板與引物組住模板與引物組成的雙鏈并轉移成的雙鏈并轉移到核心酶上，開到核心酶上，開始始 DNA 復制。復制。 -亞基：具聚合酶活性亞基：

11、具聚合酶活性 -亞基：具亞基：具 3 5核酸外切酶校對功能核酸外切酶校對功能 -亞基：組建核心酶（亞基：組建核心酶（、 組成核心酶）組成核心酶） （ Tau） -亞基：負責核心酶的二聚化亞基：負責核心酶的二聚化 -亞基：具依賴亞基：具依賴 DNA 的的ATP 酶活力酶活力 、 （ Chi）及及 （ Psi） -亞基：與亞基：與 -亞亞 基一起形成基一起形成復合物：夾子裝置器，幫助復合物：夾子裝置器，幫助 -亞亞 基夾住基夾住 DNA -亞基：形成滑動夾子，使酶具持續合成能力亞基：形成滑動夾子，使酶具持續合成能力具催化活性具催化活性具具 3 5外外切酶功能切酶功能組建核心酶組建核心酶使核心酶使核

12、心酶二聚化二聚化具依賴具依賴 DNA 的的ATP 酶活酶活力力夾子裝置器，夾子裝置器，幫助幫助 -亞基亞基夾住夾住 DNA滑動夾子，使酶滑動夾子，使酶具持續合成能力具持續合成能力在在 復合物的幫復合物的幫助下，助下， 夾子夾夾子夾住模板與引物組住模板與引物組成的雙鏈并轉移成的雙鏈并轉移到核心酶上，開到核心酶上，開始始 DNA 復制。復制。、DNA 聚合酶聚合酶和和 DNA 聚合酶聚合酶和和于于 1999 年發現，它們年發現，它們涉及涉及 DNA 的錯誤傾向修復。的錯誤傾向修復。 當當 DNA 受到嚴重損傷時，可誘導產生這受到嚴重損傷時，可誘導產生這兩個酶，由于這兩個酶對兩個酶，由于這兩個酶對

13、DNA 的修復缺乏準的修復缺乏準確性，所以出現高的突變率。確性，所以出現高的突變率。 高突變率雖然會殺死許多細胞，但至少高突變率雖然會殺死許多細胞，但至少可以克服復制障礙，使少數突變的細胞得以可以克服復制障礙，使少數突變的細胞得以存活。存活。 動物及一些噬菌體的能量供體是動物及一些噬菌體的能量供體是細菌的細菌的能量供體是能量供體是 、DNA 連接酶（多核苷酸連接酶）連接酶（多核苷酸連接酶） 19671968 年在研究環狀年在研究環狀 DNA 的復制時發現的復制時發現 DNA 連接酶可催化連接酶可催化 DNA 鏈上的缺刻（切口：鏈上的缺刻（切口：nick）封閉）封閉、解鏈蛋白與解旋蛋白、解鏈蛋白

14、與解旋蛋白 （E.coli DNA 長長 1 mm。設其。設其 30復制一復制一代。反方向旋轉一圈解開代。反方向旋轉一圈解開 3.4 nm 的的 10 個堿基個堿基對，則每分鐘要旋轉：對，則每分鐘要旋轉：1063.43010 000 轉）轉）、DNA 解螺旋酶（解螺旋酶（解鏈酶解鏈酶：helicase） 由由 ATP 提供能量可解開雙螺旋。每消耗提供能量可解開雙螺旋。每消耗 2 分子分子ATP，解開，解開 1 個個 bp。E.coli 的參與的參與 DNA 復復制的解螺旋酶為制的解螺旋酶為 Dna B 蛋白，其沿模板鏈從蛋白，其沿模板鏈從 5 3方向移動并解鏈。方向移動并解鏈。、單鏈結合蛋白單

15、鏈結合蛋白（SSB 蛋白）蛋白） E.coli 的的 SSB 蛋白由蛋白由 4 個相同的亞基組成。個相同的亞基組成。其功能在于：其功能在于：穩定解開的穩定解開的 DNA 單鏈，阻止復性單鏈，阻止復性并保護單鏈部分不被核酸酶降解并保護單鏈部分不被核酸酶降解。、DNA 拓撲異構酶拓撲異構酶 細菌的拓撲異構酶細菌的拓撲異構酶（DNA旋轉酶：旋轉酶：gyrase） 兼具內切酶和連接酶的活性。在兼具內切酶和連接酶的活性。在 ATP 提供能量的提供能量的情況下，可連續地引入負超螺旋，每分鐘可引入情況下，可連續地引入負超螺旋，每分鐘可引入約約 100 個負超螺旋。在無個負超螺旋。在無 ATP 存在時，可松弛

16、負存在時，可松弛負超螺旋，但速度較引入負超螺旋慢超螺旋，但速度較引入負超螺旋慢 10 倍。倍。 拓撲異構酶拓撲異構酶引入負超螺旋，可以消除復制引入負超螺旋，可以消除復制時（復制叉前進時）所帶來的扭曲張力，從而促時（復制叉前進時）所帶來的扭曲張力，從而促進進 DNA 雙鏈的解開。雙鏈的解開。 拓撲異構酶拓撲異構酶 I：？又名又名RNA聚合酶，可催化引物的合成：以聚合酶，可催化引物的合成：以DNA為模板，以四種為模板，以四種NTP為底物，需要為底物，需要Mg2+、合成、合成方向方向53。E.coli 的引物合成酶為的引物合成酶為Dna G蛋白蛋白IV、引物酶、引物酶、DNA 的復制過程的復制過程

17、5 3 3 5 3 5 3 5 雙螺旋雙螺旋DNA解螺旋方向解螺旋方向 DNA 復制時：復制時：5 3模板鏈的復制問題模板鏈的復制問題、DNA的半不連續復制和岡崎片段的半不連續復制和岡崎片段 DNA 復制時的引物復制時的引物1968 年年 日本日本 岡崎岡崎 用用 3H 標記的脫氧胸苷（標記的脫氧胸苷（ 3H- -dTTP DNA）標記被）標記被 T4 噬菌體感染的噬菌體感染的 E.coli，低溫，低溫（8）下保溫一段時間，以蔗糖做密度介質，）下保溫一段時間，以蔗糖做密度介質，進行密度梯度離心。發現：短時間內合成的都是進行密度梯度離心。發現：短時間內合成的都是較短的較短的 DNA 片段（片段（

18、810S），時間延長出現較），時間延長出現較大的分子（大的分子（70100S）。）。T4 噬菌體的溫度敏感突變株（其噬菌體的溫度敏感突變株（其 DNA 連接連接酶在酶在20時有正常的活力，在時有正常的活力，在 44以上時失活）以上時失活）在在44條件下培養，條件下培養，E.coli 體內積累大量的小片體內積累大量的小片段段 DNA。 前導鏈前導鏈滯后鏈滯后鏈復制叉移動方向復制叉移動方向岡崎片段岡崎片段岡崎片段岡崎片段：指以親代：指以親代 5 3鏈為模板，沿著鏈為模板，沿著 與復制叉相反的方向所合成的一些小片段。與復制叉相反的方向所合成的一些小片段。 原核生物岡崎片段長：原核生物岡崎片段長： 真

19、核生物岡崎片段長：真核生物岡崎片段長：半不連續復制半不連續復制：DNA 兩條鏈的復制方式不一樣。兩條鏈的復制方式不一樣。 一條鏈連續復制，另一條鏈不連續復制一條鏈連續復制，另一條鏈不連續復制 半不連續復制。半不連續復制。前導鏈前導鏈：以：以 3 5鏈為模板合成的鏈叫前導鏈鏈為模板合成的鏈叫前導鏈 或領先鏈，該鏈連續合成。或領先鏈，該鏈連續合成。滯后鏈滯后鏈：以：以 5 3鏈為模板合成的鏈叫滯后鏈鏈為模板合成的鏈叫滯后鏈 或后續鏈，該鏈不連續合成。或后續鏈，該鏈不連續合成。、復制過程、復制過程 復制過程：起始、延長和終止三個階段復制過程：起始、延長和終止三個階段、起始、起始 特定的起始位點：原核

20、生物特定的起始位點：原核生物一個；真核一個；真核 生物生物多個。靠許多酶和蛋白因子共同多個。靠許多酶和蛋白因子共同。 E.coli 復制起點成串排列的重復序列復制起點成串排列的重復序列Dna G 由解旋蛋白和解鏈蛋白催化，由解旋蛋白和解鏈蛋白催化，（復制眼或復制泡）（復制眼或復制泡）（引物合成酶）（引物合成酶）（解螺旋酶）（解螺旋酶）（識別起點）（識別起點）（DNA結結合蛋白）合蛋白）（幫助（幫助DnaB結合于起點）結合于起點） ATP拓撲異構酶拓撲異構酶。 實驗中發現，合成岡崎片段時，底物中既有實驗中發現，合成岡崎片段時，底物中既有dNTP，也有，也有NTP。 噬菌體噬菌體M13感染細菌后，

21、感染細菌后，DNA合成的啟動合成的啟動可被利福平抑制。可被利福平抑制。 新合成新合成DNA鏈的鏈的 5 端以共價鍵連著一小段端以共價鍵連著一小段RNA。 在前引發復合物存在的條件下，引物合成酶在前引發復合物存在的條件下，引物合成酶或或RNA聚合酶即可催化引物的合成：以聚合酶即可催化引物的合成：以DNA為為模板，以四種模板，以四種NTP為底物，需要為底物，需要Mg2+、合成方、合成方向向53。E.coli 的引物合成酶為的引物合成酶為Dna G蛋白蛋白 引物長度：幾個至十幾個核苷酸或更多。引物長度：幾個至十幾個核苷酸或更多。、延長、延長 由由 DNA 聚合酶聚合酶發揮發揮 5 3的聚合功能，的聚

22、合功能，在在RNA引物的引物的 3- -OH端逐個添加脫氧核苷酸。端逐個添加脫氧核苷酸。前導鏈和滯后鏈同時合成，前者持續合成，后前導鏈和滯后鏈同時合成，前者持續合成，后者分段合成。者分段合成。、終止、終止 切除引物、填補缺口（切除引物、填補缺口（gap）。邊切邊補，）。邊切邊補，由由 DNA 聚合酶聚合酶發揮發揮 5 3外切酶的功能及外切酶的功能及 5 3聚合酶的功能來完成。聚合酶的功能來完成。 最后由最后由 DNA 連接酶將各個岡崎片段連接連接酶將各個岡崎片段連接成完整的成完整的 DNA 鏈。鏈。、復制的真實性（忠實性）、復制的真實性（忠實性）、DNA聚合酶的選擇作用和校對功能：聚合酶的選擇

23、作用和校對功能： 第一重校對：按堿基配對原則選擇核苷酸第一重校對：按堿基配對原則選擇核苷酸 第二重校對：第二重校對： 3 5外切酶的校對功能外切酶的校對功能、引物合成的作用：、引物合成的作用： DNA聚合的起始階段，聚合的起始階段，5末端通常不穩定，末端通常不穩定，此時合成此時合成RNA引物，雖然出現錯配的可能性大，引物，雖然出現錯配的可能性大，但在完成引物功能后就被切除，代之以高保真的但在完成引物功能后就被切除，代之以高保真的DNA鏈。鏈。5、真核生物、真核生物 DNA 的復制的復制 真核生物真核生物 DNA 與組蛋白構成核小體，以染色質與組蛋白構成核小體，以染色質形式存在于細胞核中。其復制

24、大致過程與形式存在于細胞核中。其復制大致過程與E.coli 相似：相似： 復制方式：半保留復制復制方式：半保留復制 具體復制過程：半不連續復制具體復制過程：半不連續復制 聚合反應：由聚合反應：由 DNA 聚合酶催化（聚合酶催化（ Mg2+、模板、引、模板、引 物、物、dNTP、聚合方向：、聚合方向：5 3） 復制過程也需各種解鏈蛋白和解旋蛋白的參與、復制過程也需各種解鏈蛋白和解旋蛋白的參與、RNA引物引物與原核生物與原核生物 DNA 復制的不同之處：復制的不同之處： 、真核生物的復制起始點、真核生物的復制起始點 有多個復制起始點，同時進行雙向復制。有多個復制起始點，同時進行雙向復制。 E.co

25、li 每個復制叉移動速度為每個復制叉移動速度為 50 000 bpmin 哺乳動物復制叉移動速度為哺乳動物復制叉移動速度為1 0003 000bpmin 真核生物染色體在全部復制完成之前，不再重新真核生物染色體在全部復制完成之前，不再重新開始復制（真核生物在快速生長時，往往采用更多的開始復制（真核生物在快速生長時，往往采用更多的復制起點）；而在快速生長的原核生物中，起點可以復制起點）；而在快速生長的原核生物中，起點可以連續發動復制。連續發動復制。DNA聚合聚合酶酶 （）DNA聚合聚合酶酶 （M）DNA聚合聚合酶酶（）定位定位細胞核細胞核細胞核細胞核線粒體線粒體細胞核細胞核細胞核細胞核亞基數目亞

26、基數目41221外切酶活性外切酶活性無無無無3 5外切酶外切酶3 5外切酶外切酶3 5外切酶外切酶引物合成酶活引物合成酶活性性有有無無無無無無無無持續合成能力持續合成能力中等中等高高高高有有PCNA時高時高高高抑制劑抑制劑蚜腸霉素蚜腸霉素雙脫氧雙脫氧TTP 雙脫氧雙脫氧TTP蚜腸霉素蚜腸霉素蚜腸霉素蚜腸霉素功能功能修復修復線粒體線粒體DNA復制復制修復、填修復、填補缺口補缺口PCNA：增殖細胞核抗原，相當于：增殖細胞核抗原，相當于 E.coli DNA聚合酶聚合酶的的 亞基（亞基（夾子）夾子） RP-A相當于原核的相當于原核的SSB蛋白；蛋白；RF-C相當于原核的相當于原核的 復合物復合物、真

27、核生物的、真核生物的 DNA 聚合酶聚合酶、真核生物的岡崎片段和引物長、真核生物的岡崎片段和引物長 岡崎片段：岡崎片段：100200 個堿基，引物：約個堿基，引物：約 10 個堿基個堿基、真核生物、真核生物DNA復制具復雜的調控機制復制具復雜的調控機制（6）端粒）端粒DNA復制復制5、DNA 的損傷修復的損傷修復最多見的是：最多見的是：T T、DNA 損傷損傷 在一些因素的影響在一些因素的影響下，下，DNA 正常的雙螺旋正常的雙螺旋結構造到破壞，使其功結構造到破壞，使其功能受到影響，從而引起能受到影響，從而引起生物突變，甚至導致死生物突變，甚至導致死亡亡 DNA 損傷的原因損傷的原因、物理因素

28、：紫外線、物理因素：紫外線、 電離輻射、各種放電離輻射、各種放 射性射線射性射線、化學因素：、化學因素： 烷基化試劑烷基化試劑 化學化學 誘變劑誘變劑 亞硝酸類化亞硝酸類化 合物合物、生物因素：黃曲霉、生物因素：黃曲霉 素等素等（造成（造成 AP 位點）位點）、損傷修復、損傷修復 在一定條件下，生物機體能使其在一定條件下，生物機體能使其 DNA 的損的損傷得到修復，這就叫傷得到修復，這就叫 ，這是生，這是生物在長期進化過程中獲得的一種保護功能。物在長期進化過程中獲得的一種保護功能。 細胞對細胞對 DNA 損傷的修復系統有五種：直接損傷的修復系統有五種：直接修復、切除修復、重組修復、錯配修復和易

29、錯修復、切除修復、重組修復、錯配修復和易錯修復。修復。、直接修復（光復活修復）、直接修復（光復活修復） 機制：可見光（最有效波長機制：可見光（最有效波長400nm）激活）激活了了，它能分解由于紫外線照射所形成，它能分解由于紫外線照射所形成的嘧啶二聚體。的嘧啶二聚體。、切除修復（暗修復）、切除修復（暗修復） 所謂切除修復，就是在一系列酶的作用下，所謂切除修復，就是在一系列酶的作用下，切除損傷部位而代之以正常的結構。切除修復切除損傷部位而代之以正常的結構。切除修復可對多種損傷進行修復。可對多種損傷進行修復。 切除修復的方式：切除修復的方式： 先切后補與先補后切。先切后補與先補后切。 切除修復包括兩

30、個過程：一是由細胞內特切除修復包括兩個過程：一是由細胞內特異的酶找到異的酶找到DNA的損傷部位，切除含有損傷結的損傷部位，切除含有損傷結構的核酸鏈；二是修復合成并連接。構的核酸鏈；二是修復合成并連接。 原核生物擔負損傷修復的主要酶：原核生物擔負損傷修復的主要酶：DNA聚合酶聚合酶 真核生物承擔損傷修復的主要酶：真核生物承擔損傷修復的主要酶：DNA聚合酶聚合酶 和和DNA聚合酶聚合酶 ：短片段修復、長片短片段修復、長片段修復段修復 細胞切除修復系統和癌癥的關系：細胞切除修復系統和癌癥的關系： ：患者皮膚缺乏與核苷患者皮膚缺乏與核苷酸切除修復有關的酶，對紫外線引起的酸切除修復有關的酶，對紫外線引起

31、的DNA損傷不能修復。因此切除修復系統的損傷不能修復。因此切除修復系統的障礙可能是引起癌癥的一個原因。障礙可能是引起癌癥的一個原因。 在某些情況下無法為修復提供正確的模在某些情況下無法為修復提供正確的模板，復制叉遇到未修復的損傷鏈，正常的復板，復制叉遇到未修復的損傷鏈，正常的復制過程受阻，此時將進行制過程受阻，此時將進行或易錯修或易錯修復（暗修復）。復（暗修復）。AABBBBAAaaabbb6、細菌的限制、細菌的限制- -修飾系統修飾系統 該系統包括二類酶活性：修飾甲基化酶和該系統包括二類酶活性：修飾甲基化酶和限制性內切酶。限制性內切酶。 類型類型酶：酶：多亞基雙功能酶，對多亞基雙功能酶，對D

32、NA的甲的甲基化和切割由同一酶完成。基化和切割由同一酶完成。 類型類型酶：酶：兩個亞基雙功能酶，兩個亞基雙功能酶，M亞基負亞基負責識別與修飾，責識別與修飾，R亞基負責切割。亞基負責切割。 類型類型酶：酶：最重要、應用最多的修飾最重要、應用最多的修飾-限限制系統，其修飾、限制活性由分開的兩個酶來制系統，其修飾、限制活性由分開的兩個酶來完成。完成。、限制性內切酶、限制性內切酶 、屬于核酸內切酶，作用于雙鏈、屬于核酸內切酶，作用于雙鏈 DNA。 ds DNA 5- G A A T T C - 3 3- C T T A A G - 5、識別位點具特殊核苷酸序列、識別位點具特殊核苷酸序列 一般由一般由4

33、6個核苷酸組成，呈回文結個核苷酸組成，呈回文結構（構（180旋轉對稱結構或叫二元對稱結構）旋轉對稱結構或叫二元對稱結構） Eco R的識別序列的識別序列、切口、切口 齊頭切口：產生平頭末端齊頭切口：產生平頭末端 交錯切口：產生粘性末端交錯切口：產生粘性末端 粘性末端處，堿基相互配對，在一定條件粘性末端處，堿基相互配對，在一定條件下，能重新配對組成下，能重新配對組成 dsDNA ，在基因工程中，在基因工程中，粘性末端具有重要作用。粘性末端具有重要作用。 5- G A A T T C - 3 3- C T T A A G - 5MeMe、修飾甲基化酶、修飾甲基化酶 ds DNA 修飾甲基化酶與限制

34、性內切酶的識別位點相同。修飾甲基化酶與限制性內切酶的識別位點相同。其作用：將其中某一堿基甲基化，使該序列不被限其作用：將其中某一堿基甲基化，使該序列不被限制性內切酶識別。制性內切酶識別。 Eco R的識別序列的識別序列 修飾甲基化酶識別同一序列修飾甲基化酶識別同一序列 甲基化酶作用時甲基的供體：甲基化酶作用時甲基的供體：S腺苷甲硫腺苷甲硫氨酸，甲基的受體：氨酸，甲基的受體：DNA 分子上的分子上的 A 或或 C。 限制限制-修飾系統僅在細菌中發現，其生物學修飾系統僅在細菌中發現，其生物學意義：意義：在基因工程中：限制性在基因工程中：限制性內切酶可作為切割內切酶可作為切割DNA分子的手術刀，可制

35、作分子的手術刀，可制作DNA限制酶譜，分離限制片段，進行限制酶譜，分離限制片段，進行 DNA體外體外重組等，是十分有用的工具酶。重組等，是十分有用的工具酶。 1975 年，限制性內切酶的發現者：年，限制性內切酶的發現者：Smith 獲諾貝爾獎。獲諾貝爾獎。7、基因工程與、基因工程與 DNA 克隆克隆 對攜帶遺傳信息的分子進行設計對攜帶遺傳信息的分子進行設計和施工的分子工程，包括基因重組、克隆和表達。和施工的分子工程，包括基因重組、克隆和表達。其核心是構建重組其核心是構建重組 DNA。 將將 DNA 的限制酶切片插入克隆的限制酶切片插入克隆載體，導入宿主細胞，經過無性繁殖，以獲得相載體，導入宿主

36、細胞，經過無性繁殖，以獲得相同同 DNA 擴增分子的過程。擴增分子的過程。 也叫分子克隆。也叫分子克隆。 將外源將外源 DNA 帶入宿主細胞并進帶入宿主細胞并進行復制的運載工具。通常由質粒、病毒或一段染行復制的運載工具。通常由質粒、病毒或一段染色體色體 DNA 經改造而成。經改造而成。該質粒帶有給定的該質粒帶有給定的 DNA 片段（具抗藥片段（具抗藥性）性）含有帶抗藥性質粒含有帶抗藥性質粒的細菌能夠生長的細菌能夠生長鑒定并擴大培養鑒定并擴大培養純化質粒純化質粒 DNA 通過在細菌中生長可擴增百萬以上，當細菌通過在細菌中生長可擴增百萬以上，當細菌增殖期結束后，分離純化雜交的質粒增殖期結束后，分離

37、純化雜交的質粒 DNA ，并，并用同一限制酶進行酶切，即可得到原來的用同一限制酶進行酶切，即可得到原來的 DNA 片段的拷貝。片段的拷貝。8、聚合酶鏈式反應（、聚合酶鏈式反應（PCR）技術與）技術與 DNA 擴增擴增 聚合酶鏈式反應：聚合酶鏈式反應：DNA的體外酶促擴增，也的體外酶促擴增，也叫無細胞分子克隆法。叫無細胞分子克隆法。 PCR技術中每一循環均包括三階段反應：技術中每一循環均包括三階段反應：（兩條鏈分開）（兩條鏈分開）（模板（模板- -引物二者堿基配對）引物二者堿基配對）（DNA聚合酶以聚合酶以 4 種種 dNTP 為底物，在為底物，在引物引導下合成與模板互補的引物引導下合成與模板互

38、補的DNA）。重復此過）。重復此過程，程，DNA 以指數方式擴增。以指數方式擴增。二、二、RNA的生物合成（轉錄）和加工的生物合成（轉錄）和加工 也叫也叫 DNA 指導下的指導下的 RNA 合成，即以合成，即以 DNA 為模板，在為模板，在 RNA 聚合酶的催化下，合成聚合酶的催化下，合成 RNA 的過程。的過程。1、原核生物、原核生物 RNA 的合成的合成、原核生物的、原核生物的 RNA 聚合酶聚合酶 1960年前后年前后 RNA 聚合酶，該酶也叫依賴聚合酶，該酶也叫依賴于于 DNA 的的 RNA 聚合酶，或叫聚合酶，或叫 DNA 指導下的指導下的 RNA 聚合酶。聚合酶。(n1+n2+n3

39、+n4)PPi AMPn1+ CMPn4 UMTPn3 GMPn2RNA Pol2+Mgn2GTPn3UTPn4CTPDNA+n1ATP2+or MnRNA 聚合酶催化反應的條件：聚合酶催化反應的條件： 以以 4 種種 NTP 為底物、需要適當的為底物、需要適當的 DNA 鏈鏈為模板、需要二價金屬離子（為模板、需要二價金屬離子（Mg2+ 或或 Mn2+），），聚合反應方向：聚合反應方向：5 3。 RNA 聚合酶可以啟動新鏈的合成；且無外聚合酶可以啟動新鏈的合成；且無外切酶活性，故無校正與修復功能。切酶活性，故無校正與修復功能。 在催化聚合反應時：在催化聚合反應時：RNA 聚合酶以雙鏈聚合酶以雙

40、鏈 DNA 為模板時的活性要大于單鏈為模板時的活性要大于單鏈 DNA。、轉錄的不對稱性、轉錄的不對稱性 在體內，在體內，DNA 兩條鏈中僅有一條可用于轉兩條鏈中僅有一條可用于轉錄，或者某些區域以這條鏈轉錄，另一些區域錄，或者某些區域以這條鏈轉錄，另一些區域以另一條鏈轉錄，這就叫以另一條鏈轉錄，這就叫轉錄的不對稱性轉錄的不對稱性。 用于轉錄的鏈用于轉錄的鏈模板鏈（負（）鏈、非模板鏈（負（）鏈、非編碼鏈、反義鏈），與模板鏈對應的鏈為編碼鏈編碼鏈、反義鏈），與模板鏈對應的鏈為編碼鏈（正（正（+）鏈、有義鏈）。）鏈、有義鏈）。 編碼鏈與編碼鏈與 RNA 鏈堿基序列相同，僅以鏈堿基序列相同，僅以 U 代

41、代替替 T。編碼鏈無轉錄功能，只能進行復制。但現。編碼鏈無轉錄功能，只能進行復制。但現在認為：編碼鏈對轉錄過程可能具有調節作用。在認為：編碼鏈對轉錄過程可能具有調節作用。G、轉錄過程、轉錄過程 轉錄過程可人為分為四個階段：轉錄過程可人為分為四個階段：模板的識模板的識別別、轉錄的起始轉錄的起始、轉錄的延伸轉錄的延伸及及轉錄的終止轉錄的終止。 、模板的識別、模板的識別 模板鏈上每轉錄一個模板鏈上每轉錄一個RNA，就要有一個特，就要有一個特殊的轉錄起始位點即殊的轉錄起始位點即啟動子啟動子。 RNA 聚合酶識別、結合并起始轉錄的一段聚合酶識別、結合并起始轉錄的一段 DNA 序列就叫序列就叫。 上游上游

42、 10 下游下游 35（識別位點）（識別位點）（緊密結合位點）（緊密結合位點）+1（起始轉錄位點）（起始轉錄位點） 、轉錄的起始、轉錄的起始 在轉錄泡上，開始聚合反應，合成在轉錄泡上，開始聚合反應，合成 RNA 鏈最鏈最初的初的 29 個核苷酸。第一個核苷酸往往是帶有三個核苷酸。第一個核苷酸往往是帶有三個磷酸基的鳥苷或腺苷（個磷酸基的鳥苷或腺苷（pppG 或或 pppA），隨后），隨后 因子脫離核心酶，起始階段結束。因子脫離核心酶，起始階段結束。pppG+ pppNpppGpN-OH、轉錄的延長、轉錄的延長 因子的脫落，使核心酶可以離開啟動因子的脫落，使核心酶可以離開啟動子沿著子沿著 DNA

43、分子向前移動，解鏈區也跟著移分子向前移動，解鏈區也跟著移動，動，RNA 鏈得以不斷延長。鏈得以不斷延長。RNA 鏈延伸方向：鏈延伸方向：5 3，延伸速度：，延伸速度：2550 核苷酸秒。核苷酸秒。 RNA 聚合酶能夠局部解開聚合酶能夠局部解開 DNA 的兩條鏈，并以的兩條鏈，并以其中的一條鏈為模板，在其上合成出互補鏈。其中的一條鏈為模板，在其上合成出互補鏈。、轉錄的終止、轉錄的終止 DNA 分子上終止轉錄的信號分子上終止轉錄的信號特殊的特殊的核苷酸序列叫核苷酸序列叫。 在在 Nus A 因子的幫助下，核心酶識別轉因子的幫助下，核心酶識別轉錄終止信號，停止錄終止信號，停止 RNA 鏈的延長。酶與

44、鏈的延長。酶與 RNA 鏈離開模板，鏈離開模板，DNA 恢復雙螺旋結構。恢復雙螺旋結構。4、RNA 生物合成的抑制劑生物合成的抑制劑、嘌呤和嘧啶類似物、嘌呤和嘧啶類似物 例如：例如： 6-巰基嘌呤巰基嘌呤 5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶 NNNNSHNNOOF 作用：酶的抑制劑；或滲入核酸分子。作用：酶的抑制劑；或滲入核酸分子。、DNA 模板功能的抑制物模板功能的抑制物 一些化合物能夠與一些化合物能夠與 DNA 結合，使之失去模板功結合，使之失去模板功能，從而抑制其復制和轉錄能，從而抑制其復制和轉錄、烷基化試劑、烷基化試劑、放線菌素、放線菌素 有抗菌和抗癌有抗菌和抗癌作用。作用。 放線菌素放線菌素 D能

45、能與與 DNA 形成非共價形成非共價的復合物，是原核的復合物，是原核及真核及真核 RNA 聚合酶聚合酶的專一性抑制劑。的專一性抑制劑。、嵌入染料、嵌入染料 具扁平芳香族發色團，可插入到具扁平芳香族發色團，可插入到 dsDNA 相相鄰堿基對之間，是鄰堿基對之間，是 RNA 聚合酶的抑制劑。并能聚合酶的抑制劑。并能在插入后使在插入后使 DNA 復制時缺失或增添一個核苷酸，復制時缺失或增添一個核苷酸，從而導致移碼突變從而導致移碼突變、RNA 聚合酶的抑制物聚合酶的抑制物 利福平（利福霉利福平（利福霉素素B衍生物）及利鏈菌衍生物）及利鏈菌素均是細菌素均是細菌 RNA 聚合聚合酶的抑制劑，能與細酶的抑制

46、劑，能與細菌菌 RNA 聚合酶的聚合酶的 - -亞亞基結合，從而抑制轉基結合，從而抑制轉錄過程中鏈的延長反錄過程中鏈的延長反應。應。 -鵝膏蕈堿是從毒蘑菇中提取出來的一種鵝膏蕈堿是從毒蘑菇中提取出來的一種八肽化合物，它是真核生物八肽化合物，它是真核生物 RNA 聚合酶的抑聚合酶的抑制劑。主要通過抑制真核制劑。主要通過抑制真核 RNA 聚合酶聚合酶而阻而阻斷真核生物蛋白質的合成。斷真核生物蛋白質的合成。5、轉錄產物的加工、轉錄產物的加工 由由 RNA 聚合酶剛轉錄出來的初級轉錄產物，聚合酶剛轉錄出來的初級轉錄產物，通常不具生物活性，叫通常不具生物活性，叫 RNA 前體前體。RNA 前體經前體經一

47、系列的變化成為成熟分子的過程，叫一系列的變化成為成熟分子的過程，叫 RNA 的的成熟成熟或或轉錄后的加工轉錄后的加工。、rRNA 前體的加工前體的加工、原核生物、原核生物 rRNA 前體的加工前體的加工 原核生物原核生物 rRNA 前體為前體為 30S rRNA，內含，內含 5S、23S 及及 16S rRNA以及一個或幾個以及一個或幾個 tRNA，需進，需進行復雜的剪接加工。行復雜的剪接加工。（主要在核糖上）（主要在核糖上）、真核生物、真核生物 rRNA 前體的加工前體的加工 哺乳動物哺乳動物 rRNA 前體為前體為 45S rRNA，內含，內含 5.8S、28S 及及 18S rRNA。其

48、加工過程類似于原核生物。其加工過程類似于原核生物。 rRNA 前體合成、加工及裝配成核糖體的場所在前體合成、加工及裝配成核糖體的場所在核仁。核仁。 真核生物真核生物5S rRNA的基因也是排列成行，由的基因也是排列成行，由 RNA聚合酶聚合酶轉錄，經適當加工后與轉錄，經適當加工后與28S及及18S rRNA及相關蛋白質組裝成核糖體大亞基；及相關蛋白質組裝成核糖體大亞基；18S rRNA與相關蛋白質組裝成核糖體小亞基，再通過核與相關蛋白質組裝成核糖體小亞基，再通過核孔轉移到細胞質參與核糖體循環。孔轉移到細胞質參與核糖體循環。（主要在核糖上）（主要在核糖上）、tRNA 前體的加工前體的加工、原核生

49、物、原核生物 tRNA 前體的加工前體的加工 由核酸內切酶在由核酸內切酶在 tRNA 的兩端切斷的兩端切斷 由核酸外切酶從由核酸外切酶從 3端逐個切去附加的序端逐個切去附加的序列，進行修剪列，進行修剪 在在 tRNA 的的 3端加上端加上 - -C- -C- -AOH 序列序列 核苷酸的修飾與異構化核苷酸的修飾與異構化內切酶內切酶5端成熟酶端成熟酶內切酶內切酶外切酶外切酶3端成熟酶端成熟酶I、真核生物、真核生物 tRNA 前體的加工前體的加工 與原核生物類似的與原核生物類似的 RNase P 切除切除 5端的附端的附加序列，加序列，3端附加序列的切除則需多種內切酶端附加序列的切除則需多種內切酶

50、和外切酶的共同作用。和外切酶的共同作用。 真核生物真核生物 tRNA 前體前體 3端不含端不含 CCA 序列，序列，所以也需加工上去。所以也需加工上去。 核苷酸的修飾與異構化核苷酸的修飾與異構化 有居間序列（內含子）的要將該序列切除有居間序列（內含子）的要將該序列切除、mRNA 前體（前體（hnRNA）的加工）的加工 原核生物原核生物 mRNA 一般不需加工，即可直接一般不需加工，即可直接作為模板指導蛋白質的合成。作為模板指導蛋白質的合成。 真核生物的真核生物的mRNA為單順反子。大多數蛋為單順反子。大多數蛋白質基因存在居間序列（內含子），且由于真白質基因存在居間序列（內含子），且由于真核生物

51、成熟核生物成熟 mRNA 結構上的特點，故真核生物結構上的特點，故真核生物 mRNA 前體具復雜的轉錄后加工。前體具復雜的轉錄后加工。 真核生物真核生物mRNA 前體的一般加工過程：前體的一般加工過程：、 5端形成特殊的帽子結構端形成特殊的帽子結構 m7G5ppp 5N1mpN2p、3末端的產生和多聚腺苷酸化末端的產生和多聚腺苷酸化、mRNA 內部的甲基化內部的甲基化 主要是主要是 N6 甲基腺嘌呤（甲基腺嘌呤（m6A）、mRNA 前體的剪接前體的剪接 切除內含子，將外顯子準確地連接起來切除內含子，將外顯子準確地連接起來 這是基因表達的重要環節。這是基因表達的重要環節。 剪接需在拼接體形成之后

52、才能進行，剪接需在拼接體形成之后才能進行，snRNA（U族族 RNA）及幾十種蛋白質參與此過程）及幾十種蛋白質參與此過程6、RNA 復制復制 RNA 復制：復制：RNA 指導下的指導下的 RNA 合成。合成。 RNA 病毒：病毒： 一般一般 RNA病毒：以釋放毒病毒：以釋放毒素的形式使宿主得病，在宿主體內增殖到一定程素的形式使宿主得病，在宿主體內增殖到一定程度后，使宿主細胞破裂死亡；度后，使宿主細胞破裂死亡；致癌致癌 RNA 病毒：病毒：能引起鳥類、哺乳類等動物白血病、肉瘤或其他能引起鳥類、哺乳類等動物白血病、肉瘤或其他腫瘤的病毒。這類病毒浸染細胞后可使細胞發生腫瘤的病毒。這類病毒浸染細胞后可使細胞發生惡性轉化。惡性轉化。 RNA 復制酶催化反應的條件：復制酶催化反應的條件： 以以 4 種種 NTP 為底物、以為底物、以 RNA 鏈為模板、需鏈為模板、需要二價金屬離子（要二價金屬離子（Mg2+ 或或 Mn2+），聚合反應方），聚合反應方向：向：5 3。 RNA 復制酶也叫復制酶也叫