1、 堿裂解法提取質粒DNA 通過質粒的一些特性、質粒DNA的提取、測定，學習用堿變性法提取質粒DNA的方法，掌握堿裂解法提取質粒DNA的原理及操作。一、實驗目的一、實驗目的質粒(Plasmid) ：質粒是細菌細胞內一種自我復制的環狀雙鏈DNA分子，能穩定地獨立存在于染色體外，并傳遞到子代，一般不整合到宿主染色體上。 在細胞內它們常以共價閉環的超螺旋形式存在。存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多。二、實驗原理二、實驗原理質粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，具有以下特點： 易于鑒定；易于鑒定； 在受體細胞中可以獨立復制；在受體細胞中可以獨立復制； 易于篩選；易于篩選；

2、 易于導入受體細胞。易于導入受體細胞。 二、實驗原理二、實驗原理高堿高堿細菌的細胞壁破裂，內容物釋放細菌的細胞壁破裂，內容物釋放染色體染色體DNADNA斷裂成不同長度的線性雙鏈斷裂成不同長度的線性雙鏈DNADNA；線性雙鏈線性雙鏈DNADNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。質粒質粒DNADNA不發生斷裂，保持雙鏈閉合環狀；不發生斷裂，保持雙鏈閉合環狀；雙鏈雙鏈DNADNA并不完全分離。并不完全分離。高酸高酸中和中和至中至中性性變性的染色體變性的染色體DNADNA與變性的蛋白質以及細胞碎片凝聚與變性的蛋白質以及細胞碎片凝聚成網絡狀大分子不溶性沉淀物成網絡狀大分子不

3、溶性沉淀物質粒質粒DNADNA又恢復天然構型，溶解在上清液中又恢復天然構型，溶解在上清液中純化純化RNARNA酶消化除去酶消化除去RNARNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質 SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質變性，所以SDS處理細菌細胞后，會導致細菌細胞壁的破裂，從而使質粒DNA以及基因組DNA從細胞中同時釋放出來。釋放出來的DNA遇到強堿性(NaOH)環境，就會變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質粒DNA將迅速復性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復性。離心后，質粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細胞碎片

4、一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可 將 質 粒 D N A 從 細 菌 中 提 取 出 來 。三、主要試劑及作用三、主要試劑及作用溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成組成 (保護、緩沖保護、緩沖)葡萄糖葡萄糖的作用是增加溶液的粘度的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的減少抽提過程中的 機械剪機械剪切作用切作用,防止破壞質粒防止破壞質粒 (保護作用保護作用)EDTA 的作用是絡合掉鎂等二價金屬離子的作用是絡合掉鎂等二價金屬離子, 防止防止DNA酶對質酶對質粒分子的降解作用（保護作用）粒分子的降解作用（保護作用）Tris-HCl 使溶菌液維持溶菌作用的最適使溶菌液

5、維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）范圍（緩沖作用）8 溶液溶液II：由：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與（十二烷基硫酸鈉）與 NaOH 組成組成(裂解、變性裂解、變性)SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之變性（裂的作用是解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之變性（裂解細胞和蛋白質變性作用）解細胞和蛋白質變性作用）NaOH（PH12）的作用是破壞氫鍵，使）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性分子變性（DNA變性作用）變性作用）9溶液溶液III：HAc和和 KAc組成的高鹽溶液組成的高鹽溶液 (復性，分離復性，分離) HAc溶液溶液能中和溶液能中和溶液的堿性，使染色體的堿性，使染色體DNA 變性

6、而變性而發生纏繞，并使質粒發生纏繞，并使質粒DNA復性。復性。KAc會與會與SDS形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質形成沉形成溶解度很低的鹽，并與蛋白質形成沉淀而除去；溶液中的淀而除去；溶液中的DNA也會與蛋白質也會與蛋白質-SDS復合物纏復合物纏繞成大分子而與小分子質粒繞成大分子而與小分子質粒DNA分離。分離。四、試劑配制四、試劑配制 溶液溶液：50mM葡萄糖，葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)。 1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅

7、菌15min ，貯存于4。 溶液溶液：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。 3. 溶液溶液：醋酸鉀（：醋酸鉀（KAc）緩沖液，）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存備用。4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4保存備用。 5. 苯酚/氯

8、仿/異戊醇（25：24：1） 6. 乙醇（無水乙醇、70%乙醇） 7. 5TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na22H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4保存備用。 8. RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20。 實實驗驗步步驟驟加加1.5ml1.5ml培養物于培養物于EPEP管，管，12000g12000g30S30S 除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的200 200 l l 溶液溶液I I，劇烈振蕩，劇

9、烈振蕩EPEP管，室溫管，室溫3min3min 加入加入300300l l 溶液溶液IIII，快速顛倒數次，冰浴，快速顛倒數次，冰浴3min3min 加入加入400400l l 冰冰溶液溶液IIIIII，溫和振蕩，溫和振蕩10s10s，冰浴，冰浴5min5min，12000g12000g5min5min轉移上清到新轉移上清到新EPEP管，加入等體積管，加入等體積酚酚/ /氯仿氯仿(1:1)(1:1)，溫和振蕩，冰浴，溫和振蕩，冰浴3min3min，12000g12000g5min5min 上層水相轉移到新上層水相轉移到新EPEP管管，加入，加入2 2倍體積倍體積無水乙醇無水乙醇，顛倒混勻，顛倒混勻，-20 -20 冰箱中放置冰箱中放置15min15mi