1、 一、基因研究的發展過程 二、DNA的組成、結構和功能 三、基因工程的概念及主要內容 四、工具酶和基因載體 五、基因工程的基本技術 六、基因工程在食品產業中的應用四、工具酶和基因載體 4.1 基因工程的工具酶 限制性內切酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 4.2 基因工程載體 質粒載體 噬菌體載體 柯斯質粒載體 4.1 基因工程的工具酶（1）限制性內切酶 限制性內切酶的定義和分類 II型限制性內切酶的命名 II型限制性內切酶的識別序列 II型限制性內切酶的酶切位點 II型限制性內切酶的的主要用途 限制性內切酶的定義 是一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并在合適的反應條件下使每條鏈一定位點上的磷

2、酸二酯鍵斷開，產生具有3-OH基團和5-P基團的DNA片段的內切脫氧核糖核酸酶。 至今發現的限制性內切酶有三種類型，各具特性，基因工程操作中真正有用的是II型酶。 限制性內切酶的命名 命名原則一般是以酶源生物的屬名和種名前1、2個字母以及株(型)代號來命名。如果從同一種生物中先后分離到多種限制性內切酶，則依次用羅馬數字表示。 舉例：EcoRI中的Eco表示從大腸桿菌(Escherichia coli)中分離出來的，R代表大腸桿菌的R株，I表示從中分離出的第一種限制性內切酶。 從流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)菌株d中分離出來的第三種限制酶，被命名為HindIII。 I

3、I型限制性內切酶的識別序列 限制性內切酶在雙鏈DNA上能夠識別的核苷酸序列被稱為識別序列。 多數限制酶的識別序列由6個核苷酸對組成。 如常用的限制酶EcoRI、HindIII和BamHI的識別序列分別是 GAATTC AAGCTT GGATCC CTTAAG 、 TTCGAA、 CCTAGG。 少數限制酶的識別序列由4個或5個核苷酸對組成，或者由多于6個核苷酸對組成。 如Sau3A的識別序列是GATC MaeIII的識別序列是GTNAC CTAG， CANTG。 限制性內切酶識別序列的共同規律：呈回文結構，即序列被正讀和反讀是一樣的。 為了便于書寫，識別序列可以以5 3走向的單鏈DNA表示。例

4、如，識別序列5AAGCTT 3就可以寫成 3TTCGAA 5 AAGCTT。 有的限制酶可識別兩種以上的核苷酸序列。例如，AccI既可識別GTATAC，又可識別GTCGAC。 II型限制性內切酶的酶切位點 DNA在限制性內切酶的作用下，使多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開的位置被稱為酶切位點，可用 表示。 限制酶在DNA上的酶切位點一般是在識別序列內部，如G GATCC、AT CGAT等。少數在兩側，如 GATC、 CATG 等。 DNA分子經限制性內切酶酶切產生的DNA片段末端，因所用限制酶不同而不同。HindIII對雙鏈DNA分子的切割作用限制性內切酶造成粘性末端有利于重組DNA 分子的構建 I

5、I型限制性內切酶的主要用途 (1) 在特異位點上切割DNA，產生特異的限制酶切割的DNA片段。 對于核苷酸序列已知的DNA分子，可利用此法直接分離目的基因。 (2) 建立DNA分子的限制性內切酶物理圖譜 B E H BHEH BEM3 kb2kb1.5 kb1 kb500 b(a)BBBEHBHEB(b)BEBEBEEEHHEHHBHBHBBBB3 .31.71.71.61.40.32.03.03.50.61.50.93.51.52.31.00.51.23.31.7限制性作圖的基本原理 (3) 構建基因文庫 基因工程中，需要將某種生物的全部基因組的遺傳信息，貯存在可以長期保存的穩定的重組體中，

6、以備需要時隨時能夠應用。這種保存基因組遺傳信息的材料(受體細胞)，就稱為基因文庫。 (4) 用限制酶切出相同的黏性末端，以便重組DNA。5G-C-T- C-T-G-C-A-G-G-A-G33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5(2)DNA連接酶 DNA連接酶的定義 能將兩段DNA拼接起來的酶稱為DNA連接酶。該酶催化DNA相鄰的5磷酸基團和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，將DNA單鏈缺口封合起來。 OH PDNA連接酶5G-C-T- C-T-G-C-A G-G-A-G33C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C5OH P DNA連接酶只能封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口(nick)

7、，即雙鏈DNA上的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現的單鏈斷裂，而不能封閉裂口(gap)，即在雙鏈DNA的某一條鏈上失去一個或數個核苷酸所形成的單鏈斷裂。 DNA連接酶的種類 目前常用的DNA連接酶有大腸桿菌DNA連接酶和T4連接酶。 大腸桿菌DNA連接酶只能催化雙鏈DNA片段互補黏性末端之間的連接。 T4連接酶可用于雙鏈DNA片段互補黏性末端之間的連接，也能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接，但平末端之間的連接效率比較低。 DNA連接酶的連接作用 (a)缺口DNA (b)平末端DNA (c)粘性末端DNA分子 粘性末端DNA片段的連接 具粘性末端的DNA片段的連接比較容易，

8、也比較常用。但是，在連接反應混合物中，具有粘性末端的載體DNA分子會發生自我環化作用，并在連接酶的作用下重新變成穩定的共價閉合的環形結構。這樣，就會使只含有載體分子的轉化子克隆的“本底”比例大幅上升，最終給重組DNA分子的篩選工作帶來麻煩。 用堿性磷酸酶預先處理線性的載體DNA分子，以移去其末端的5磷酸基團，可以克服這一缺點。堿性磷酸酶的脫磷酸作用阻止線性的質粒DNA分子再環化 平末端DNA片段的連接 基因克隆實驗中，常用的平末端DNA片段的連接法，主要有同聚物加尾法、接頭連接法等。 (1)同聚物加尾法 同聚物加尾法是利用互補的同聚物序列之間的退火作用完成的連接。其核心部分是，利用末端脫氧核苷

9、酸轉移酶（能夠在無模板鏈的情況下，將核苷酸加到DNA分子單鏈延伸末端的3-OH基團上）轉移核苷酸的特殊功能。 應用互補的同聚物加尾法連接DNA片段 (2)接頭連接法 DNA接頭，是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。人工接頭連接(3)DNA聚合酶 DNA聚合酶的定義 具有催化DNA體外合成反應作用的酶稱為DNA聚合酶。這類酶的特點在于，能夠把脫氧核苷酸連續地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。DNA聚合酶作用時大多都需要模板，合成產物的序列與模板互補。 常用的DNA聚合酶 大腸桿菌DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、 T7

10、 DNA聚合酶、耐熱DNA聚合酶和反轉錄酶等。 到目前為止，已從大腸桿菌中純化出了三種不同類型的DNA聚合酶，即大腸桿菌DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。 DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II的主要功能是參與DNA的修復過程，而DNA聚合酶III的主要功能與DNA的復制有關。 基因工程中常用的DNA聚合酶 耐熱DNA聚合酶：是它的發現使PCR擴增特異性DNA片段成為可能。PCR反應過程中需將模板DNA置于高溫下變性、解鏈，而耐熱DNA聚合酶在靶DNA變性的高溫下仍能保持活性，因而在PCR過程中只需一次性加入反應系統即可，簡化了操作過程。 目前有于PCR的耐熱DNA聚合酶主要

11、有Taq DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶等。 反轉錄酶：催化以單鏈RNA為模板生成雙鏈DNA的反應，又稱依賴RNA的DNA聚合酶。 反轉錄酶是分子生物學中最重要的核酸酶之一。以mRNA模板合成cDNA，是其最主要的用途。反轉錄酶的5 3方向的DNA聚合酶活性 都齊全了，能夠在試管中切割或連接都齊全了，能夠在試管中切割或連接DNA了了4.2 基因工程載體理想的基因工程載體應具備的特征(1)具有復制起點，能攜帶外源DNA片段進入受體細胞，進行穩定的DNA自我/同步復制(2)具有標記基因(3) 具有若干限制酶的單一識別位點(4) 具有較高的外源DNA的載裝能力常見的基因工程

12、載體 包括質粒載體、 噬菌體類載體等。(1)質粒載體 質粒的一般生物學特性 質粒DNA 質粒DNA的復制類型 質粒載體的構建及重要的質粒載體 天然質粒用作克隆載體的局限性 重要的質粒載體 質粒DNA 質粒是存在于細胞質中的一類獨立于染色體的自主復制的遺傳成分。 絕大多數是質粒都是由環形雙鏈DNA分子組成的復制子。 環形雙鏈的質粒DNA分具有三種不同的構型： 共價閉合環形DNA(SC)、開環DNA(OC)和線形DNA(L)。 質粒DNA的分子構型 在瓊脂糖凝膠電泳中，不同構型的同一種質粒DNA具有不同的電泳遷移率。走在最前沿的是scDNA，其后依次是LDNA和ocDNA。 質粒DNA瓊脂糖凝膠電

13、泳模式圖 不同質粒DNA分子量差異顯著，小的不到1 kb，大的超過500 kb，多數在10 kb。 標準的質粒命名，通常用一個小寫的p來代表質粒，而用一些英文縮寫或數字來對這個質粒進行描述。例如，pBR322，BR代表研究出這個質粒的研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的頭一個字母，322是實驗編號。 質粒DNA的復制類型 根據寄主細胞所含拷貝數的多少，可將質粒分成兩個不同的復制型：一種是低拷貝數的質粒（1-3份拷貝），稱為“嚴密型”復制控制的質粒；另一種是高拷貝數的質粒（10-60份拷貝)，稱為“松弛型”復制控制的質粒。 拷貝數的常用定義：生長在標準的培養基條件下，每個細菌細胞中所含

14、有的質粒DNA分子的數目。 有的文獻定義為每條細菌染色體所平均具有的質粒DNA分子的數目。 一種質粒究竟是屬于嚴密型還是松弛型并非絕對的，還受到寄主的控制。例如，R1質粒 大腸桿菌寄主（嚴密型）、奇異變型桿菌寄主（松弛型）。 2.質粒載體的構建及重要的質粒載體 (1)重組體分子的轉化存在三種可能性 (1)沒有轉化進宿主細胞 (2)質粒發生自身環化，沒有重組成功（空載質粒） (3)重組成功（重組質粒） 質粒的克隆位點位于抗菌素標記之外無抗性有抗性有抗性質粒的克隆位點位于抗菌素標記之內無抗性有抗性無抗性克隆位點克隆位點克隆位點克隆位點 質粒的克隆位點位于抗菌素標記之外無抗性有兩種抗性有兩種抗性質粒

15、的克隆位點位于抗菌素標記之內無抗性有兩種抗性有一種抗性克隆位點克隆位點抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因克隆位點克隆位點抗菌素抗性基因抗菌素抗性基因(2) 天然質粒用作克隆載體的局限性q 天然質粒是指那些沒有經過以基因克隆為目標的體外修飾改造的質粒。 例如：天然質粒pSC101 特點：只有一個四環素抗性選擇標記(Tetr)，三個基因插入失活克隆位點和一個其它克隆位點(EcoRI)。 缺點：分子量較大(9.1 kb)，拷貝數較低，只有一個抗菌素抗性基因（無法使用插入失活技術選擇重組體分子） (3)重要的質粒載體 為改進轉化子篩選技術，有必要用人工的方法構建一種既帶有多種抗藥性的選擇記號，又具有低分子量

16、、高拷貝、以及外源DNA插入不影響復制功能的多種限制酶單酶切位點等優點的新的質粒載體。 pBR322質粒載體 酵母2m質粒 pBR322質粒載體 構建pBR322質粒的關鍵性步驟是，通過體內易位或體外重組加入可選擇的抗藥性記號，同時設法除去非必要的區段（親本質粒DNA上一些對基因克隆無關緊要的DNA片段，及對DNA克隆無用的限制酶識別位點），以降低分子量。pBR322質粒三個不同來源的組成部分質粒載體pBR322pBR322質粒的優點質粒的優點具有較小的分子量(4.36 kb)；具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號；具有較高的拷貝數2) 酵母2m質粒 酵母是一種最簡單的單細胞真核生物，

17、具有對外源基因翻譯后進行蛋白質加工和修飾的功能。 在啤酒酵母中發現的質粒，多數長度為2m 。在每個細胞中的平均拷貝數為50-100，能穩定地存活于細胞中。 目前已構建了一系列用于酵母轉基因的質粒載體，也包括穿梭質粒載體。酵母質粒具有廣闊的發展前景。(2)噬菌體類載體 質粒載體在基因工程研究中快速簡便，但由于其自身特性的限制，最大可以克隆的DNA片段一般在10 kb左右。若要構建一個基因文庫，往往需要克隆更大一些的DNA片段。為滿足這一要求，人們把噬菌體發展成為一種克隆載體。 噬菌體是寄生在細菌中的病毒，其結構比細菌或真核細胞簡單，但比質粒分子復雜得多。它由蛋白質外殼和頭部外殼內的DNA組成。高

18、效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞；自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增，因而噬菌體能被開發成基因工程的有用載體。 v噬菌體的一般生物學特性噬菌體的結構及其核酸類型 噬菌體有三種不同的基本類型，即無尾部結構的二十面體型、具尾部結構的二十面體型和線狀體型。 噬菌體的核酸，最常見的是雙鏈線性DNA。 噬菌體的結構示意圖 噬菌體的生命周期 可分為溶菌周期和溶源周期兩種不同的類型。溶菌周期噬菌體（烈性噬菌體）將其感染的寄主細胞變成噬菌體的“制造廠”，產生大量的子代噬菌體顆粒。溶源生長周期噬菌體（溫和噬菌體）不產生子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA是整合到寄主細胞染色體DNA上。噬菌體的生命周期 烈性噬菌體的生命周期噬菌體的生命周期 溫和噬菌體的生命周期v噬菌體載體 噬菌體是一種中等大小的溫和噬菌體。其基因組中有部分基因為非必要基因，被外源基因取代后，并不影響其生命功能。這是賴以發展作為基因克隆載體的一種重要特性。 噬菌體線性DNA分子的粘性末端(cos位點)及其環化作用v 噬菌體載體的主要類型 構建噬菌體載體的基本原理是多余限制位點的刪除和切除掉非必要的區段。 構建出的派生載體，可歸納成兩種類型：一種只具有一個可供外源DNA插