1、會計學1沈陽藥科大學生物化學沈陽藥科大學生物化學基因工程基因工程DNA重組重組接合作用接合作用 (conjugation)轉化作用轉化作用 (transformation)轉導作用轉導作用 (transduction)轉轉 座座 (transposition)同源重組同源重組 (homologous recombination)位點特異的重組位點特異的重組(site-specific recombination)發生在同源序列間的重組稱為發生在同源序列間的重組稱為同源重組同源重組(homologous recombination)，又稱，又稱基本重組基本重組。是最基本的。是最基本的DNA重組方

2、式，通過鏈的斷裂重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。單鏈或雙鏈片段的交換。 以以E.coli的同源重組為例，了解同源重組的同源重組為例，了解同源重組機制的機制的Holliday模型。模型。一、同源重組一、同源重組片段重組體片段重組體(patch recombinant)拼接重組體拼接重組體(splice recombinant) 片段重組體片段重組體 （見模型圖左邊產物）：（見模型圖左邊產物）： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區，其兩側來自同一親本體含有

3、一段異源雙鏈區，其兩側來自同一親本DNA。拼接重組體拼接重組體（見模型圖右邊產物）：（見模型圖右邊產物）： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區的兩側來自不同親本雙鏈區的兩側來自不同親本DNA。 內切酶內切酶 (recBCD)DNA侵擾侵擾(recA)分支遷移分支遷移 (recA) 內切酶內切酶(recBCD) DNA 連接酶連接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3

4、 目目 錄錄Holiday中間體中間體5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 內切酶內切酶(ruvC)內切酶內切酶(ruvC) DNA連接酶連接酶 DNA連接酶連接酶片段重組體片段重組體拼接重組體拼接重組體目目 錄錄二、細菌的基因轉移與重組二、細菌的基因轉移與重組（一）接合作用（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌

5、）的另一細胞（細菌）的DNA轉移稱為轉移稱為接合作用接合作用(conjugation)。可接合質粒如可接合質粒如 F 因子因子(F factor) 質粒質粒 細菌染色體外的小型環狀雙鏈細菌染色體外的小型環狀雙鏈DNA分子分子（二）轉化作用（二）轉化作用通過自動獲取或人為地供給外源通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養的受體細胞獲得新的遺傳表型使細胞或培養的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為，稱為轉化作用轉化作用 (transformation)。 例：例：溶菌時，裂解的溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。片段被另一細菌攝取。目目 錄錄（三）轉導作用（三）轉導作用當病毒從被感染的（供體

6、）細胞釋放出當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發生在來、再次感染另一（供體）細胞時，發生在供體細胞與受體細胞之間的供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因轉移及基因重組即為重組即為轉導作用轉導作用(transduction)。噬菌體的生活史噬菌體的生活史溶菌生長途徑溶菌生長途徑(lysis pathway)溶源菌生長途徑溶源菌生長途徑(lysogenic pathway)例例目目 錄錄目目 錄錄三、位點特異重組三、位點特異重組位點特異重組位點特異重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在兩個是由整合酶催化，在兩個DNA序列

7、的特異位點序列的特異位點間發生的整合。間發生的整合。例例 （一）一）噬菌體噬菌體DNA的整合的整合噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發生選擇性整合；反轉錄病體的特異靶位點發生選擇性整合；反轉錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉錄病毒毒整合酶可特異地識別、整合反轉錄病毒cDNA的的長末端重復序列長末端重復序列(long terminal repeat, LTR)。 例例（二）細菌的特異位點重組（二）細菌的特異位點重組沙門氏菌沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉變片段倒位決定鞭毛相轉變 hix為反向重復序列，它們之間的為反向重復序列，它們之間的H片片段可在段

8、可在Hin控制下進行特異位點重組控制下進行特異位點重組(倒位倒位)。H片段上有兩個啟動子片段上有兩個啟動子P，其一驅動，其一驅動hin基基因表達，另一正向時驅動因表達，另一正向時驅動H2和和rH1基因表達基因表達，反向，反向(倒位倒位)時時H2和和rH1不表達。不表達。rH1為為H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重組酶重組酶轉位片段轉位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA啟動序列啟動序列H1啟動序列啟動序列沙門氏菌沙門氏菌H H片段倒位決定鞭毛相轉變片段倒位決定鞭毛相轉變例例（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排免疫

9、球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈，由兩條輕鏈(L鏈鏈)和兩和兩條重鏈條重鏈(H鏈鏈)組成，分別由三個獨立的基因族組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈編碼，其中兩個編碼輕鏈( 和和 )，一個編碼，一個編碼重鏈。重鏈。 輕鏈的基因片段：輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L V D J C 重鏈重鏈(IgH)基因的基因的V-D-J重排和輕鏈重排和輕鏈(IgL)基基因的因的V-J重排均發生在特異位點上。在重排均發生在特異位點上。在V片段片段的下游，的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的兩側均存片段的兩側均存在保守的重組信號序列在保守的重組信號序列

10、(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重組酶基因。此重排的重組酶基因rag (recombination activating gene)共有兩個，分共有兩個，分別產生蛋白質別產生蛋白質RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重組信號序列重組信號序列基因片段基因片段V片段片段J片段片段RSSRSS間插間插DNAOHOHVJ單鏈切開單鏈切開RAG1RAG2分子內轉酯反應分子內轉酯反應單鏈切開單鏈切開轉移核苷酸轉移核苷酸修復、連接修復、連接免疫球蛋白基因重排過程免疫球蛋白基因重排過程目目

11、錄錄四、轉座重組四、轉座重組由插入序列和轉座子介導的基因移位或由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為重排稱為轉座轉座(transposition)。插入序列插入序列(insertion sequences, IS)組成：組成：二個分離的反向重復二個分離的反向重復(inverted repeats, IR)序列序列特有的正向重復序列特有的正向重復序列 一個轉座酶（一個轉座酶（transposase)編碼基因編碼基因 IRTransposase GeneIR發生形式：發生形式：保守性轉座保守性轉座(conservative transposition)復制性轉座復制性轉座(duplicativ

12、e transposition)（一）插入序列轉座（一）插入序列轉座插入序列的復制性轉座插入序列的復制性轉座目目 錄錄轉座子轉座子(transposons) 可從一個染色體位可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。點轉移到另一位點的分散重復序列。 轉座子組成：轉座子組成：反向重復序列反向重復序列轉座酶編碼基因轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）轉座子轉座（二）轉座子轉座由轉座子介導的轉座由轉座子介導的轉座目目 錄錄DNA Recombination Technique 重組重組DNA技術的發展史技術的發

13、展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗的豌豆雜交試驗1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗的肺炎球菌轉化實驗1973年年 美國斯坦福大學的科學家構建美國斯坦福大學的科學家構建第一個第一個重組重組DNA分子分子1977年年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遺傳工遺傳工程公司，專門應用重組程公司，專門應用重組DNA技術制造醫學上重要的藥物。技術制造醫學上重要的藥物。1980年年 開始建造開始建造第一家第一家應用重組應用重組DNA技術生產胰島素的工廠技術生產胰島素的工廠1997年年 英國羅林研究所成功的克隆了英國羅林研究所

14、成功的克隆了多莉多莉本節主要內容本節主要內容克隆克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為獲取同一拷貝的過程稱為克隆化克隆化(cloning)，即即無性繁殖無性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆技術水平：技術水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 細胞克隆細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮﹤€體克隆（動物或植物）DNA克隆克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的

15、的或人工的DNA）與載體）與載體DNA接合成一具有自我接合成一具有自我復制能力的復制能力的DNA分子分子復制子復制子(replicon)，繼而，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一D N A 分 子 ， 也 稱分 子 ， 也 稱 基 因 克 隆 或 重 組基 因 克 隆 或 重 組 D N A (recombinant DNA) 。 生物技術工程生物技術工程: 基因工程、蛋白質工程、基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等酶工程、細胞工程等目的目的 分離獲得某一感

16、興趣的基因或分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）基因工程基因工程(genetic engineering) 實現基實現基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱又稱重組重組DNA工藝學工藝學。重組重組DNA技術中常用的工具酶技術中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使二酯鍵，使DNA切口封合或

17、使兩個切口封合或使兩個DNA分子或片段連接分子或片段連接DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接分子或片段連接缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針DNA序列分析序列分析填補填補3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈第二鏈合成，雙鏈DNA 3 末端標記等末端標記等反轉錄酶反轉錄酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I進行填補，標記或進行填補，標記或DNA序列分析序列分析多聚核苷

18、酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標記探針羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶末端轉移酶在在3 羥基末端進行同質多聚物加尾羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶定義定義限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶(restriction endonuclease, RE)是是識別識別DNA的特異序列的特異序列, 并在識別位點或其周并在識別位點或其周圍切割雙鏈圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。的一類內切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H作用作用與甲基化酶共同構成細菌的限制修與甲基

19、化酶共同構成細菌的限制修飾系統，限制外源飾系統，限制外源DNA， 保護自身保護自身DNA。分類分類、（基因工程技術中常用（基因工程技術中常用型）型）第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發現的先后次序。用羅馬數字表示發現的先后次序。命名命名Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶類酶識別序列特點類酶識別序列特點 回文結構回文結

20、構(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口同功異源酶同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同一位點，這些酶稱同功異源酶同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同尾酶同尾酶有些限制性內切酶雖然識別序列不完全有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，產生相

21、同的粘性末端后，產生相同的粘性末端，稱為，稱為同尾酶同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端配伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A（四）基因載體（四）基因載體定義定義為攜帶目的基因，實現其無性繁殖或為攜帶目的基因，實現其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分分子。子。常用載體常用載體質粒質粒DNA噬菌體噬菌體DNA病毒病毒DNA克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被

22、擴增而特意序列被擴增而特意設計的載體稱為設計的載體稱為克隆載體克隆載體。表達載體表達載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體表達載體。載體的選擇標準載體的選擇標準1. 1. 質粒質粒 (plasmid)特點特點 能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息些遺傳信息, , 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 目目 錄錄噬菌體噬菌體DNA改造系統改造系統 gt系列（插入型，適用系列（插入型，適用cDNA克隆）克隆

23、）EMBL系列（置換型，適用基因組克?。┫盗校ㄖ脫Q型，適用基因組克隆）2. 噬菌體噬菌體(phage) M13噬菌體噬菌體DNA改造系統（含改造系統（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列3. 粘性質粒粘性質粒(cosmid)酵母人工染色體酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC)細菌人工染色體細菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)動物病毒動物病毒DNA改造的載體改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）其他其他二、重組二、重組DNA技

24、術基本原理技術基本原理基本原理基本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導入受體菌導入受體菌外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建克隆載體的選擇和構建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達克隆基因的表達 以以 質質 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過過 程程目目 錄錄* 化學合成法獲取目的基因化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列序列組織或細胞染色體組織或細胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉化菌含重組分子的轉化菌限制性內切酶限制性內切酶受體菌受體菌基因組基因組DN

25、A文庫文庫存在于轉化細胞內存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNA的集合的集合* 從基因組從基因組DNA文文庫獲取目的基因庫獲取目的基因目目 錄錄限制酶切位點限制酶切位點限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應連接反應 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫

26、基因文庫目目 錄錄mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫文庫 反轉錄酶反轉錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復制復制* 從從cDNA文庫獲取目的基因文庫獲取目的基因 逆轉錄酶逆轉錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T目目 錄錄（三）外源基因與載體的連接（三）外源基因與載體的連接1. 1. 粘性末端連接粘性末端連接方式：方式：(1)同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接不同限制酶切位點連接配伍末端連接配伍末端連接非配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構

27、建（二）克隆載體的選擇和構建Bam H切割反應切割反應 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割載體載體DNA用用Bam H切割切割重組體重組體載體自連載體自連目的基因自連目的基因自連同一限制酶切位點連接同一限制酶切位點連接目目 錄錄不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接Eco R切割位點切割位點Bg l切割位點切割位點EcoR+ Bg l雙酶切雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切雙酶切T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體配伍末端的配伍末端的連接情況和同一連接情況和同一限制酶

28、切位點連限制酶切位點連接相似。接相似。目目 錄錄2. 平端連接平端連接適用于：適用于：限制性內切酶切割產生的平端限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因目的基因載體載體限制性內切酶限制性內切酶限制性內切酶限制性內切酶T4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體載體自連載體自連目的基因目的基因 自連自連目目 錄錄3. 同聚物加尾連接同聚物加尾連接在末端轉移酶在末端轉移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。、制造出粘性末端，再進行粘端連接。5

29、3 3 5 載體載體DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機械剪切限制酶或機械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉移酶末端轉移酶+ dATP末端轉移酶末端轉移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體目目 錄錄4. 4. 人工接頭人工接頭(linker)連接連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接除產生粘性末

30、端，而進行粘端連接。 人工接頭及其應用人工接頭及其應用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目目 錄錄受體菌條件受體菌條件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態處于感受態(competent) 導入方式導入方式轉化轉化 (transformation)轉染轉染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重組（四）重組DNA導入受體菌導入受體菌（五）重組體的篩選（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法直接選擇法(1) 抗藥性標記選擇抗藥性標記選擇(2) 標志補救標志補救(marker rescue)

31、(3) 分子雜交法分子雜交法原位雜交原位雜交Southern印跡印跡 2. 免疫學方法免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等如免疫化學方法及酶免檢測分析等( (插入失活法插入失活法) )抗藥性標記選擇抗藥性標記選擇目目 錄錄組氨酸缺陷組氨酸缺陷型大腸桿菌型大腸桿菌無組氨酸無組氨酸的培養基的培養基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因酸脫水酶基因促進組氨酸合成促進組氨酸合成 DNADNA重組體重組體標志補救標志補救目目 錄錄 互補互補目目 錄錄 互互補補的的檢檢測測目目 錄錄原原位位雜雜交交目目 錄錄Southern印跡印跡目目 錄錄雞的雞的肌球蛋白的克隆和檢出肌球蛋白的克隆和檢出目目 錄錄

32、重組重組DNADNA技術操作過程可形象歸納為技術操作過程可形象歸納為 小小 結結分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉轉轉入受體菌轉入受體菌 篩篩篩選重組體篩選重組體 重組重組DNA技術操作的主要步驟技術操作的主要步驟載體載體質粒質粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DNA cDNA 人工合成人工合成PCR產物產物限制酶消化限制酶消化開環載體開環載體DNA目的基目的基因因連接酶連接酶重組體重組體轉化轉化體外包裝，轉染體外包裝，轉染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳

33、鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交目目 錄錄表達體系的建立表達體系的建立表達載體的構建表達載體的構建受體細胞的建立受體細胞的建立表達產物的分離純化表達產物的分離純化（六）克隆基因的表達（六）克隆基因的表達1. 原核表達體系原核表達體系 （E.coli表達體系最為常用）表達體系最為常用）標準：標準：選擇標志選擇標志強啟動子強啟動子 翻譯調控序列翻譯調控序列多接頭克隆位點多接頭克隆位點E.coli表達體系的不足表達體系的不足 不宜表達真核基因組不宜表達真核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質不能加工表達的真核蛋白質表達的蛋白質常形成不溶性包涵體表達的蛋白質常形成不溶性包涵體 (inclusi

34、on body) 很難表達大量可溶性蛋白很難表達大量可溶性蛋白大鼠胰島素原大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌的表達和分泌目目 錄錄優點：優點：可表達克隆的可表達克隆的cDNA及真核基因組及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質可適當修飾表達的蛋白質表達產物分區域積累表達產物分區域積累缺點：缺點：操作技術難、費時、經濟操作技術難、費時、經濟轉染轉染 將表達載體導入真核細胞的過程將表達載體導入真核細胞的過程方法：方法：磷酸鈣轉染磷酸鈣轉染DEAE葡聚糖介導轉染葡聚糖介導轉染電穿孔電穿孔 脂質體轉染脂質體轉染 顯微注射顯微注射 2. 真核表達體系真核表達體系 酵母、昆蟲、乳類動物細胞酵母、昆蟲、乳類動

35、物細胞表達載體表達載體pFASTBACI 的物理圖譜的物理圖譜目目 錄錄目目 錄錄（一）疾病基因的發現與克隆（一）疾病基因的發現與克隆根據基因定位克隆之并研究其性質，而認根據基因定位克隆之并研究其性質，而認識疾病的分子機制。識疾病的分子機制。（二）生物制藥（二）生物制藥 重組重組DNA醫藥產品醫藥產品產產 品品功功 能能組織胞漿素原激活劑組織胞漿素原激活劑抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促進凝血促進凝血顆粒細胞顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成剌激白細胞生成促紅細胞生成素促紅細胞生成素剌激白細胞生成剌激白細胞生成生長因子生長因子(bFGF, EGF)刺激細胞生長與

36、分化刺激細胞生長與分化生長素生長素治療侏儒癥治療侏儒癥胰島素胰島素治療糖尿病治療糖尿病干擾素干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素白細胞介素激活、剌激各類白細胞激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗組織損傷抗組織損傷單克隆抗體單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療瘤導向治療乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)預防乙肝預防乙肝口服重組口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂預防霍亂目目 錄錄基因診斷基因診斷(genetic diagnosis)是利用分子生利用分子生物學及分子

37、遺傳的技術和原理，在物學及分子遺傳的技術和原理，在DNA水平水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變?；虿迦氲韧蛔?。基本過程基本過程區分或鑒定區分或鑒定DNA的異常的異常分離、擴增待測的分離、擴增待測的DNA片斷片斷標準標準. 能正確擴增靶基因；能正確擴增靶基因；. 能準確區分單個堿基的差別；能準確區分單個堿基的差別；. 本底或噪聲低，不干擾本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定的鑒定;. 便于完全自動化操作，適合大面積、便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。大人群普查。（四）基因治療（四）基因治療定義定義基因治療基因治療(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的細胞補充相應功能的基因，以糾正或補償的細胞補充相應功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的目的。其基因的缺陷，從而達到治療的目的。方