1、第一節 細胞形態結構的觀察方法· 在細胞結構中，細胞核、線粒體、核仁、染色體直徑大于0.2um，能在普通光學顯微鏡中觀察到的結構，稱為顯微結構。· 內質網膜、核膜、微管、微絲、核糖體等因小于0.2um而在普通光學顯微鏡中觀察不到的結構，被稱為亞顯微結構。、光學顯微鏡（一）普通復式光學顯微鏡分辨力D=0.61 / Nsin（/2）數值孔徑（numeric aperture）NANsin（/2）=波長;N=介質折射率；=鏡口角，標本在光軸上的一點對物鏡鏡口的張角，140°。提高分辨力的途徑:(1)降低l，可采用不同光源(2)提高N.A普通顯微鏡最大分辨率為0.2m，人

2、眼的分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設計的最大放大倍數通常為1000X。（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡相差顯微鏡1應用范圍：這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經染色的標本和活細胞，甚至細胞核、線粒體等細胞器的動態。2相差顯微鏡的基本原理：光線透過標本后發生衍射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4（波長），如果再增加或減少1/4，則光程差變為1/2，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減小，增強反差。 相差顯微鏡以較強的可見光作光源，當光線到達標本面時，標本內部的小粒、小孔或其他結構均可產生衍射光 ，衍射光比直接入射的光線相位遲約l/4，而且發生偏轉、發散。 相差顯微鏡的集光器內裝有一套環狀光欄

3、，環狀光欄可使直射光在經標本面后，最后在物鏡后面聚集形成一個光環；而標本面上發散的衍射光在到達物鏡后焦面時不能聚焦成光環，而分散在光環之外，從而將直射光與衍射光在后焦面分開。在相差顯微鏡后焦面裝有一個相差板，相差板分為環狀的共軛區和環兩側的并協區，直射光通過共軛區，衍射光通過并協區。可在共軛區和并協區分別涂上延遲相位的物質：如果在并協區涂上延遲相位的物質，使衍射光的相位差再延遲1/4 l ，使直射光與衍射光的相位差達1/2 l ，當這些產生衍射的顆?；蚱渌Y構成像時，合成波的振幅為二波振幅之差，因而合成波的振幅比背景直射光的振幅小，物象顯得很黑而背景明亮，這種效果叫暗反差；如果在共軛區涂上延遲

4、相位的物質，直射光與被延遲1/4 l的衍射光同相位，從而發生相長干涉，合成波振幅比直射光振幅大，物象比背景亮 ，這種效果叫明反差。微分干涉顯微鏡DIC顯微鏡的應用：DIC顯微鏡使細胞的結構，特別是一些較大的細胞器，如核、線粒體等，立體感特別強，適合于顯微操作。（三）熒光顯微鏡熒光顯微鏡技術是目前在光鏡水平對特異蛋白質等生物大分子定性定位研究最有力工具之一。（四）激光掃描共焦顯微境激光掃描共焦顯微鏡既的應用：細胞內生化組分的定位及動態變化分析。 二、電子顯微鏡用途：· 用來觀察標本內部（透射電鏡）或表面細微結構（掃描電鏡）。第二節 細胞及其組分的分析方法一、用超離心技術分離細胞組分（略

5、） 二、細胞成分的細胞化學顯示方法（細胞化學技術）基本原理：細胞化學染色（histochemical or cytochemical staining）是利用顯色劑可同細胞的某種成分發生反應而著色的原理，對某種成分進行定性、定位和相對含量分析的技術。細胞內核酸、蛋白質、酶、糖與脂類的顯示方法舉例：核酸反應Feulgen反應：DNA+Shiff試劑 紫紅色多糖反應PAS反應：多糖+過碘酸+無色品紅 紫紅色可用于多糖、粘多糖、粘蛋白的檢測。脂類反應四氧化鋨+脂肪酸（不飽和） 黑色蘇丹可使脂滴著紅色，蘇丹黑可使磷脂和膽固醇著黑色。三、特異蛋白抗原的定位與定性（免疫細胞化學技術）基本原理：免疫細胞化學

6、（immunocytochemistry）是根據免疫學原理，利用標記抗體（如熒光素、酶、膠體金耦連）同特定抗原專一結合，在光鏡或電鏡下對該抗原在組織、細胞中進行定位測定的技術。包括免疫熒光技術、免疫酶標記技術、免疫膠體金技術等。免疫熒光技術用熒光素對抗體進行標記，常用的螢光素有異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate）、羅丹明（rhodamine）等。包括直接免疫熒光標記和間接免疫熒光標記，直接標記對抗原的抗體直接進行標記，間接標記對抗原的抗體（第一抗體）的抗體（第二抗體）進行標記。免疫熒光技術檢測需用熒光顯微鏡或激光掃描共焦顯微鏡。免疫酶標記技術，常用的酶有辣根過

7、氧化物酶（horseradish peroxidase）和堿性磷酸酶，利用酶與底物發生反應后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位?？梢栽谄胀ü忡R或電鏡下觀察檢測。免疫膠體金技術是目前深受細胞生物學研究者親睞的免疫電鏡技術。四、細胞內特異核酸的定位與定性（原位雜交技術）基本原理：具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當條件下，通過氫鍵結合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。原位雜交就是用標記的核酸探針通過分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體上或在細胞中的位置的方法。探針標記方法：放射性標記、熒光標記、小分子標記等。放射性標記探針具有放射性，通過顯微

8、放射自顯影來顯示位置。熒光標記探針用熒光素進行標記，用熒光顯微鏡或激光掃描共焦顯微鏡觀察。小分子標記探針用生物素或地高辛等小分子標記，雜交反應后，用熒光標記或膠體金標記的抗生物素或抗地高辛的抗體檢測，用熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察。原位雜交技術在顯微和亞顯微水平上研究基因定位、特異mRNA表達等方面具有重要作用五、定量細胞化學分析與細胞分選技術（流式細胞術）目前，流式細胞術是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。應 用：定量測定細胞中DNA、RNA、特異標記蛋白質的含量，以及細胞群體中某種成分不同含量的細胞的數量。分選細胞、細胞核、染色體、細胞器等。（如分選含X和Y染色體的精子等）包被細胞

9、（一般經過特異的熒光染色）的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flow cytometer）。第四節 細胞內生物大分子的動態變化一、熒光漂白恢復技術1概念熒光漂白恢復（fluorescence photobleaching recovery, FPR）技術是使用親脂性或親水性的熒光分子（如熒光素、綠色熒光蛋白等）與蛋白或脂質耦聯，用于檢測所標記分子在活體細胞表面或細胞內部的運動及其遷移速率，有助于解決細胞內脂質和蛋白質的動態變化及其與其它成分的相互作用等一系列問題。2原理利用高能激光束照射細胞某特定區域，使該區域內標記的熒光分子發生不可逆的淬滅（熒光漂白過程，這一區域稱為光漂白區）。隨后，

10、由于細胞中脂質或蛋白質分子的運動，周圍非漂白區的熒光分子不斷向光漂白區遷移，結果使光漂白區的熒光強度逐漸恢復到原有水平（熒光回復過程）。二、單分子技術與細胞生命活動的研究三、酵母雙雜交技術四、熒光共振能量轉移技術熒光共振能量轉移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) 技術用于檢測細胞內2種蛋白質之間是否存在直接的相互作用。其基本原理是：當2個熒光發色基團的距離很近（小于10nm），并且一個基團發出的熒光光譜與另一個基團的吸收光譜相互重疊時，它們之間會發生能量轉移現象，即一個基團發出的熒光被另一個基團吸收，另一個基團發出了熒光。五、放射自顯影術放射自顯影術（radioautography；autoradiography）是利用放射性同位素的電離射線對乳膠(含Ag