1、基因工程藥物基因工程藥物制備技術制備技術 一、實驗目的一、實驗目的 經過本實驗了解和掌握基因工程經過本實驗了解和掌握基因工程蛋白藥物的發酵表達、提取、純化蛋白藥物的發酵表達、提取、純化及純度檢測等根本方法及純度檢測等根本方法二、實驗原理本實驗工程菌在含卡那霉素的LB培育基中，在IPTG誘導下可大量表達重組蛋白。重組蛋白以無活性、不溶性的包涵體方式存在。要獲得活性蛋白，必需進展變性、復性處置。重組蛋白N端存在6個延續的組氨酸His序列，可與鎳進展可逆鰲合反響，因此，可用鎳螯合的瓊脂糖柱Ni-IDA進展親合純化，以鎳柱親合層析法獲得純化的重組蛋白。工程菌培育工程菌培育破菌破菌誘導表達誘導表達包涵體

2、制備包涵體制備變性變性復性復性重組蛋白純化重組蛋白純化親和層析親和層析紫外分光光紫外分光光度計檢測度計檢測三、實驗器材三、實驗器材恒溫震蕩培育箱、超凈任務臺、天平、高速恒溫震蕩培育箱、超凈任務臺、天平、高速冷凍離心機、制冰機。、超聲波細胞破碎冷凍離心機、制冰機。、超聲波細胞破碎儀、儀、ompW ompW 重組大腸桿菌、試劑、玻璃器重組大腸桿菌、試劑、玻璃器皿等皿等四、實驗內容四、實驗內容1、實驗設計及菌種活化、實驗設計及菌種活化實驗整體設計方案確實定實驗整體設計方案確實定 培育基及溶液的配制培育基及溶液的配制工程菌接種培育工程菌接種培育配制溶液配制溶液 每組試管、三角燒瓶培育基各一份；每組試管

3、、三角燒瓶培育基各一份；PBS全班全班2升；升； 培育基滅菌后加卡那培育基滅菌后加卡那霉素。霉素。菌種活化菌種活化 取菌種接種于取菌種接種于10ml的的LB培育培育基中試管，基中試管，37，190r/min搖床搖床培育過夜。培育過夜。溶液配方溶液配方1LB培育基培育基1L 蛋白胨蛋白胨 10g 酵母膏酵母膏 5g NaCl 10g 用用 NaOH溶液調溶液調pH至至7.4，高壓滅菌。，高壓滅菌。2卡那卡那/LB液體培育基中，按終濃度液體培育基中，按終濃度50g/ml參與參與卡那霉素母液濃度為卡那霉素母液濃度為0.25g/ml3PBSpH7.41L NaCL 8g KCL 0.2g Na2HPO

4、4 1.44g KH2PO4 0.24g 用用 HCL調理溶液的調理溶液的pH至至7.4，高壓滅菌后，保管，高壓滅菌后，保管于室溫。于室溫。2、 工程菌的發酵培育及誘導表達工程菌的發酵培育及誘導表達實驗內容實驗內容工程菌的發酵培育工程菌的發酵培育誘導表達外源蛋白誘導表達外源蛋白離心搜集菌體離心搜集菌體配制液體配制液體實驗操作實驗操作1搖瓶發酵表達搖瓶發酵表達 將試管中活化的菌種接入三角燒瓶，將試管中活化的菌種接入三角燒瓶，37，190r/min搖菌培育搖菌培育34小時，參與小時，參與IPTG至至終濃度為終濃度為1mmol/L母液母液0.1mol/L，37誘導表達誘導表達3-4小時。小時。2菌體

5、搜集菌體搜集誘導表達終了后，誘導表達終了后，4 10000rpm離心離心10min，PBS緩沖液清洗一次后同樣條件離心后再緩沖液清洗一次后同樣條件離心后再次搜集菌體。次搜集菌體。-20保管備用。保管備用。3 3配制包含體洗滌液明天用配制包含體洗滌液明天用包含體洗滌緩沖液包含體洗滌緩沖液I I：包含體洗滌緩沖液包含體洗滌緩沖液II II：包含體洗滌緩沖液包含體洗滌緩沖液IIIIII：變性液變性液300mL)300mL)變性液：變性液： 100MLTris 1.2114gEDTA 0.0584g2-硫蘇糖醇硫蘇糖醇 0.154 g 尿素尿素 48.048g HCl 調至調至pH 7.5包含體洗滌緩

6、沖液包含體洗滌緩沖液I：1LTris 6.057g濃濃HCl 2mLEDTA 0.584gNaCl 5.85gTriston X-100 5 mL尿素尿素 240.24g包含體洗滌緩沖液包含體洗滌緩沖液II 1LTris 6.057g濃濃HCl 2mL EDTA 0.584g NaCl 5.85g Triston X-100 3mL包含體洗滌緩沖液包含體洗滌緩沖液III 1LTris 12.114g濃濃HCl 3mLEDTA 0.584g 2-硫蘇糖醇硫蘇糖醇DTT 1.54 g 以下為每升溶液配方以下為每升溶液配方3、破菌及包涵體的變性、破菌及包涵體的變性實驗內容實驗內容菌體的破碎菌體的破碎

7、包涵體的分別包涵體的分別包涵體的洗滌包涵體的洗滌規范曲線的繪制規范曲線的繪制實驗操作：實驗操作：1懸浮菌體：離心搜集的菌體，用懸浮菌體：離心搜集的菌體，用50毫升毫升PBSpH 7.4懸浮菌體。懸浮菌體。2超聲破碎：冰浴條件下超聲波裂解細菌，超聲破碎：冰浴條件下超聲波裂解細菌，功率功率400W，5s/5s,直至溶液變為半透明。直至溶液變為半透明。3搜集包涵體沉淀：搜集包涵體沉淀：10000rpm離心離心20min，棄上清，搜集包涵體沉淀。，棄上清，搜集包涵體沉淀。4 4包涵體的洗滌包涵體的洗滌沉淀懸浮于包涵體洗滌緩沖液沉淀懸浮于包涵體洗滌緩沖液I I，充分混勻。，充分混勻。44，10000rp

8、m10000rpm，離心，離心10min10min，棄去上清。，棄去上清。沉淀懸浮于包涵體洗滌緩沖液沉淀懸浮于包涵體洗滌緩沖液II II，充分混勻。，充分混勻。44，10000rpm10000rpm，離心，離心10min10min，棄去上清。，棄去上清。沉淀懸浮于包涵體洗滌緩沖液沉淀懸浮于包涵體洗滌緩沖液IIIIII，充分混勻。，充分混勻。44，10000rpm10000rpm，離心，離心10min10min，棄去上清。，棄去上清。4、包涵體變性及復性包涵體的變性測變性液蛋白含量復性配制親和層析緩沖液配制1 1變性變性 將包涵體沉淀按將包涵體沉淀按5%5%V/VV/V的稀釋度用變性液懸的稀釋度

9、用變性液懸浮，室溫靜置浮，室溫靜置3030分鐘，分鐘，10000rpm10000rpm離心離心30min30min，留，留上清。上清。2 2用紫外吸收法測變性液蛋白含量用紫外吸收法測變性液蛋白含量 利用規范曲線，根據測出的未知樣品的利用規范曲線，根據測出的未知樣品的A280A280值，值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。即可查出未知樣品的蛋白質含量。 3 3復性復性將溶解后的蛋白質將溶解后的蛋白質150 ug/ml150 ug/ml稀釋稀釋100100200ug/ml200ug/ml，以，以PBSPBS低溫透析，換透析液低溫透析，換透析液一次，透析過夜。一次，透析過夜。洗脫緩沖液洗脫緩沖液B B

10、 NaH2PO4 6.00g NaH2PO4 6.00g NaCL 1.755g NaCL 1.755g 咪唑咪唑 27.23 g27.23 g 用高濃度用高濃度NaOHNaOH調調pHpH至至8.08.0。4配制親和層析緩沖液配制以下為每升配方配制親和層析緩沖液配制以下為每升配方平衡緩沖液平衡緩沖液A Na2HPO4 1.42 g KH2PO4 0.245 g NaCL 8.19g KCL 0.201 g 用高濃度用高濃度NaOH調調pH至至8.0。介質洗滌液介質洗滌液0.5M NaOH5 5、親和層析及樣品檢測、親和層析及樣品檢測親和層析親和層析用紫外分光光度計初步檢測樣品用紫外分光光度計初步檢測樣品親和層析操作親和層析操作1樣品處置樣品處置 透析液透析液pH用高濃度用高濃度NaOH調調pH至至8.0待待上樣。上樣。2上樣上樣 將樣品以滴管沿壁悄然加到平衡好的將樣品以滴管沿壁悄然加到平衡好的Ni-IDA上。上。3洗滌雜蛋白洗滌雜蛋白 以平衡緩沖液洗以平衡緩沖液洗5個柱體積。個柱體積。4洗脫洗脫 以咪唑洗脫液洗洗以咪唑洗脫液洗洗5個柱體積并搜集洗脫個柱體積并搜集洗脫液液 5介質清洗用10倍體積0.5M NaOH過柱，保證介質與NaOH溶液接