1、研究細胞生命活動的流研究細胞生命活動的流式解決方案式解決方案 techuniv丁 瑋瑋細胞凋亡概述細胞凋亡概述又稱為程序性細胞死亡又稱為程序性細胞死亡 (Programmed Cell Death) 是機體是機體主動的、高主動的、高度有序度有序地清除無用細胞的過程。和地清除無用細胞的過程。和細胞壞死細胞壞死 (Necrosis) 相區別，壞死相區別，壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。薄膜有小泡狀形成薄膜有小泡狀形成細胞凋亡與疾病的關系細胞凋亡與疾病的關系3細胞凋亡事件發生表細胞凋亡

2、事件發生表細胞膜事件線粒體事件Caspase事件細胞核事件1. 細胞膜變化的檢測：細胞膜變化的檢測：Annexin V/PI磷脂酰絲氨酸磷脂酰絲氨酸 (PS) 的檢測：早期凋亡的檢測：早期凋亡早期凋亡早期凋亡PS檢測及結果判定檢測及結果判定早期凋亡特征：早期凋亡特征：磷脂膜(PS)外翻，但是細胞膜保持完整性，因此PI染色為陰性DNA沒有發生斷裂早期凋亡早期凋亡PS檢測及結果判定檢測及結果判定Annexin V-FITCPI細胞膜變化的檢測：細胞膜變化的檢測：Annexin V/PI優點：優點：簡便、快速、準確區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞樣本設置：樣本設置：1. 空白對照：空白對照：輔助判斷管

3、，即不加Annexin V/PI，但用它調電壓的話，電壓偏高，即根據它確定的陰陽性界限是偏低的。2. 單陽樣本：單陽樣本：誘導凋亡，Annexin V單染，用來調補償3. 單陽樣本：單陽樣本：誘導凋亡，PI單染，用來調補償注意事項：注意事項：1. 細胞制備或儲存時細胞膜損傷，造成假陽性2. 貼壁細胞消化時避免使用EDTA，螯合鈣離子BD Annexin V 流式檢測試劑盒流式檢測試劑盒KitCat no.Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit I556547Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit II-Contains

4、 unlabeled recomb. Annexin V556570Annexin V:PE Apoptosis Detection Kit I559763提供FITC, PE, APC,CY5,CY5.5, BD Horizon V450, BD Horizon V500等多種熒光標記的Annexin V以及純凈的Annexin V。Annexin V檢測常見問題檢測常見問題1. 是否 Annexin V Kits 可以檢測小鼠或其他物種? Annexin V試劑盒可以檢測多種屬2. 這個試劑盒是否可用于貼壁細胞、固定或凍存的細胞、或組織? No. 上述樣本的細胞細胞膜都會或多或少受到損害，

5、這樣的樣本建議用免疫熒光技術 (Cat. No. 550911) 3. 是否與細胞表面標記兼容? CD11B/MAC-1 LY-71 只要Ca離子不影響該表面Marker就可以同時做2. 線粒體水平的檢測線粒體水平的檢測激活Caspase 9激活Caspase 3啟動細胞凋亡 凋亡與線粒體膜電位的去極化相關 BD Mitoscreen (JC-1) Cat# 551302 25 tests JC-1: 可穿透細胞膜的親脂性陽離子熒光素 原理：原理： JC-1在正常細胞中以聚合體形式存在于線粒體基質上產生紅色熒光（FL-2 Channel）； 細胞凋亡時，線粒體膜電位發生去極化，膜電位降低，JC

6、-1 以單體形式存在于胞漿內，熒光 強度減弱甚至消失 （只能在FL1通道檢測到），故用熒光信號的變化判別凋亡的發生。p 操作簡單，試劑直接加入細胞中，操作簡單，試劑直接加入細胞中，20分鐘后檢測分鐘后檢測2. 線粒體水平的檢測線粒體水平的檢測JC-1檢測結果流式圖檢測結果流式圖JC-1 (Fl-1)Jurkat T CellsMouse ThymocytesControl StaurosporineCamptothecinFas mAbR1R2R1R2R1R2R1R2R1R2R1R2Control JC-1 (Fl-2)3. 凋亡相關酶的檢測凋亡相關酶的檢測- Caspase 背景知識背景知識

7、 細胞凋亡過程中，胞內主要蛋白通常被降解，調節這一過程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶） Caspase 3是參與DNA維護和調控細胞的重要組分，即Caspase 3激活=細胞凋亡 檢測原理：是通過特異性抗體檢測全長或者剪切后的Caspase活性。Jurkat T-Cells 6 M camptothecin for 4 h untreated Caspase-3 data（IHC） Caspase-3 data（FCM） Jurkat T-Cells Mouse ThymocytesFITC Active Caspase-3 Apoptosis KitCat No.FITC

8、 Active Caspase-3 Apoptosis Kit550480PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit550914Caspase-3 Kits4. 細胞核細胞核DNA檢測檢測 凋亡晚期DNA內切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成185bp為基數的有序片段。檢測方法Tunel流式法:通過在核酸片段末端標記計算凋亡百分比末端轉移酶標記技術細胞核細胞核DNA檢測原理：檢測原理：APO-BrdUTdT: 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶Brd UTP的滲入率顯著高于dUTP，因此檢測靈敏度高TUNEL法法: 流式分析晚期凋亡流式分析晚期凋亡APO-DIREC

9、T KIT 50 tests cat. 556381Part A (store at 4) Part B (store at 20)PI/Rnase staining buffer FITC-dUTPReaction buffer Negative control cellsRising buffer Positive control cellsWash buffer TdT Enzyme實驗用2種染料PI染色總DNA：得到細胞周期的信息；FITC-dUTP染色凋亡細胞：檢測凋亡。在流式細胞儀488nm激發下，PI發射約623nm熒光，FITC發射520nm熒光。 APO-BrdU KIT 6

10、0 tests cat. 556405Part A (store at 4) Part B (store at 20)FITC-Labeled Anti-BrdU mAb Br-dUTPPI/Rnase staining bufferReaction buffer Negative control cellsRising buffer Positive control cellsWash buffer TdT EnzymePI染色檢測細胞周期FITC染色檢測凋亡（如果不需要周期信息，則可不做PI染色步驟） TUNEL法法: 流式分析晚期凋亡流式分析晚期凋亡21BD流式系列課堂流式系列課堂-1：研究細胞生命活動的流研究細胞生命活動的流式解決方案式解決方案 DNA含量與細胞周期含量與細胞周期檢測原理檢測原理利用特殊的熒光染料(PI等)與細胞內DNA堿基結合，被這些熒光染料染色的細胞在激光照射下發射出熒光，熒光強度與DNA含量成正比。流式細胞儀通過測定細胞的熒光強度推算出細胞的DNA含量。PI染色細胞周期樣本檢測細胞周期樣本檢測結果分析結果分析CellQuest、WinMDI等軟件均可以進行分析，但需要手工進行參數統計和計算；推薦使用ModFit分析軟件（分析如下：）1. 打開軟件；2. 在FL2-W/FL2-A散點圖中設定單個細胞門（R1），去除聚集細胞，必要