1、設計實驗報告 1103018 宋 躍1103019 胡嘉健1103020 劉炫邑1103021 石雨晴 Experimental design report一，如何正確設計從生物樣品中分別純化生物大分子的道路和正確的設計方案？二，案例實驗：從動物肝組織樣品中分別提取純化鑒定一種酶如何正確設計從生物樣品中分別純化生物大分子的道路和正確的設計方案？ 1，確定生物大分子的種類2，查閱文獻資料確定生物大分子的性質例如，分子量，等電點，沉降細數溶解度，耐熱性等3，查閱分別純化鑒定的方法以及其各有何特點和適用范圍4，根據所測生物大分子的知條件和實踐情況選擇適宜的分別純化方法5，根據選取的方法設計實驗詳細步

2、驟1，正確選材 總的來說，資料選擇應遵照的原那么是：有效成分含量多，穩定性好；來源豐富、堅持新穎；提取容易、工藝簡單；雜質有綜合利用價值。2，資料預處置 及時運用防止有效成分喪失，否那么應及時冰凍或枯燥儲存，同時把易于除去的非需求物質如脂質除去。3，初分 根據目的大分子的性質確定初分方法，保證回收率高。4，純化 按照先選用粗放、快速、有利于減少樣品體積和后工序處置的方法，后選擇準確、費時和需樣品量少的方法的原那么確定分別方法的排布順序。5，鑒定 用于鑒定性質和含量的方法有：光譜法、氣候層析法和生物芯片法等。用于鑒定生物樣品純度的方法有：電泳法、免疫分析。 根據實驗目確實定鑒定方法，操作務必準確

3、，盡量防止目的物質的流失案例實驗：從動物肝組織樣品中分別提取純化鑒定一種酶實驗目的：1，掌握從肝細胞中分別提取純化鑒定某種酶的實驗方法 2，培育靈敏選擇并綜合運用各種生物實驗方法的才干3， 培育探求精神及團隊協作認識 一，資料預處置1，因動物肝臟中的酶往往結合較多的脂質、核酸的物質，所以取饑餓24小時的動物肝臟為實驗資料。2，由于細胞膜的半透膜性質，將細胞置于低滲溶液中，細胞易脹破，經過攪碎研磨可以得到細胞質中的胞液以及細胞核等各種細胞器和少量的細胞器碎片。3，由于目前未知該酶的詳細位置，因此對胞液，細胞核和線粒體應該分開研討，使得提取物中雜質盡量減少。實驗原理 實驗原理 實驗原理 實驗原理

4、五，離子交換柱層析(Ion exchange column chromatography )，按照可交換離子的類型分為陽離子交換柱色譜法和陰離子交換柱色譜法。根據物質酸堿性、極性等差別，經過離子間的吸附和解吸而將電解質各組分分開。在離子交換過程中，可以將雜蛋白選擇性地結合到離子交換劑上，其他蛋白存在于過柱液中;或將欲分別蛋白選擇性地結合到離子交換劑上，雜蛋白存在于過柱液中;或幾種帶同性電荷的蛋白均結合到交換劑上，利用其結合的結實程度不同(即帶電荷的數目不同)，靜電引力不同，分步洗脫下來，到達分別的目的。實驗原理 六，脫鹽經過各種純化手段提取的蛋白質溶液經常含有較高的鹽離子濃度，需求將多余的鹽離

5、子去除，稱為蛋白質的脫鹽，脫鹽的主要方法有透析法，超濾法，凝膠過濾法等。實驗原理 七，SDS電泳(SDS electrophoresis )該方法中，由于該蛋白質有三個大小不同的亞基，所以將會構成三條不同的區帶。到達了實驗鑒定的目的。SDS-PAGE：運用陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉，先將蛋白質大分子變性，并與其蛋白質分子結合構成帶負電荷蛋白質-SDS復合體沿著以聚丙烯酰胺凝膠構成的分子篩向電場的正極方向挪動，從而將蛋白質根據它們分子量的大小而分開。由于小分子量的蛋白質挪動速度大于分子量較大的，所以在垂直凝膠中其蛋白質分子量由上至下遞減。實驗原理 實驗步驟實驗取材因動物肝臟中的酶往往結合較多的脂

6、質、核酸的物質，所以取饑餓24小時的動物肝臟為實驗資料。細胞破碎細胞破碎參與蛋白質抑制劑，防止蛋白酶參與蛋白質抑制劑，防止蛋白酶水解作用常用的絲氨酸蛋白酶水解作用常用的絲氨酸蛋白酶抑制劑有苯甲基磺酰氟抑制劑有苯甲基磺酰氟PMSF、二異丙基氟磷酸；、二異丙基氟磷酸；金屬蛋白酶抑制劑有金屬蛋白酶抑制劑有EDTA和和EGTA乙二醇四乙酸乙二醇四乙酸 除核酸：除核酸：普通微生物和植物的粗酶液中有普通微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀劑的選擇需方法是沉淀法，沉淀劑的選擇需求大量的實驗來選定，知的有求大量的實驗來選定，知的有1%2%的鏈霉素硫

7、酸鹽、溶菌的鏈霉素硫酸鹽、溶菌酶等。酶等。破碎方法：機械研磨破碎方法：機械研磨將剪碎的兔肝置于研缽中用將剪碎的兔肝置于研缽中用研磨棒研碎，參與一定的研磨棒研碎，參與一定的石英可提高研磨效果也可石英可提高研磨效果也可用勻漿器進展勻漿，參與低用勻漿器進展勻漿，參與低滲溶液。運用差速離心法在滲溶液。運用差速離心法在1600r/min 離心機中離心得離心機中離心得到上清一和沉淀一。將沉淀到上清一和沉淀一。將沉淀參與一定濃度蔗糖溶液后在參與一定濃度蔗糖溶液后在3500r/min離心機離心得到上離心機離心得到上清二和沉淀二細胞核。清二和沉淀二細胞核。將上清一二混合，取少量上將上清一二混合，取少量上清液在清

8、液在6600r/min離心機中離離心機中離心得到沉淀三是線粒體，棄心得到沉淀三是線粒體，棄去上清液微粒體與溶酶體去上清液微粒體與溶酶體最后得到上清液為胞液，沉最后得到上清液為胞液，沉淀二為細胞核，沉淀三為線淀二為細胞核，沉淀三為線粒體粒體以下步驟分別對三部分進展以下步驟分別對三部分進展操作操作酶的分別提取酶的分別提取鹽溶液提取適用于大多數酶。鹽溶液提取適用于大多數酶。 用用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液提取線粒體和磷酸鹽緩沖液提取線粒體和細胞核中的酶細胞核中的酶一，初分，鹽析一，初分，鹽析運用飽和硫酸銨以一定的恰當比例，使蛋運用飽和硫酸銨以一定的恰當比例，使蛋白質析出，視詳細情況經過過濾和離心

9、的白質析出，視詳細情況經過過濾和離心的方法沉淀分別出來，得到的沉淀即為蛋白方法沉淀分別出來，得到的沉淀即為蛋白質質等電點沉淀法等電點沉淀法將上一步得到的沉淀溶解在將上一步得到的沉淀溶解在ph為為6.2的緩的緩沖液中，離心后得到上清液和沉淀，沖液中，離心后得到上清液和沉淀，棄去上清，沉淀即為一切棄去上清，沉淀即為一切pI為為6.2的蛋白質的蛋白質二，精分，離子交換柱層析法二，精分，離子交換柱層析法利用利用DEAE纖維素為作為纖維素為作為陰離子交換劑，帶有正電荷可以吸附帶有陰離子交換劑，帶有正電荷可以吸附帶有負電荷的蛋白質負電荷的蛋白質DEAE預處置，裝柱，平衡樣品上樣與洗預處置，裝柱，平衡樣品上

10、樣與洗脫搜集得到相對純真的蛋白質脫搜集得到相對純真的蛋白質利用利用CM-纖維素纖維素ph為為5.0作為陽離子作為陽離子交換劑，吸附帶正電荷的酶交換劑，吸附帶正電荷的酶DEAE的再生與保管的再生與保管實驗步驟如何使線粒體和細胞核破碎？脫鹽，運用透析袋脫鹽脫鹽，運用透析袋脫鹽SDS電泳，電泳，1，制備待測蛋白質樣品：，制備待測蛋白質樣品：2，垂直板狀聚丙烯酰胺凝膠的灌制：垂直板狀聚丙烯酰胺凝膠的灌制：3，加，加樣：樣：4，電泳：，電泳：5，剝膠：，剝膠：6，染色和褪色。，染色和褪色。實驗步驟實驗結果：察看脫色后凝膠中的蛋白質區帶，假設被測蛋白質樣品分別純化的好，純度高，應出現三條區帶，假設在同一凝