1、實驗安排1 實驗安排實驗安排實驗一：實驗一：DNA重組與轉化重組與轉化實驗二：重組實驗二：重組DNA提取與鑒定提取與鑒定實驗三：實驗三： 基因組基因組DNA制備制備實驗四：實驗四：PCR實驗五：實驗五：SDS-PAGE實驗六：實驗六：Western Blot實驗七八：實驗七八：Southern Blot / FISH課程擔任人：潘鑾鳳課程擔任人：潘鑾鳳教師：邵紅霞教師：邵紅霞 王松梅王松梅 支秀玲支秀玲實驗流程圖2 質粒重組質粒重組 轉化轉化 鑒定鑒定 制備探針制備探針 實驗一、二實驗一、二 Southern Blot 實驗七、八實驗七、八 細胞培育細胞培育 基因組基因組DNA的制備的制備 濃

2、度測定濃度測定 PCR擴增擴增 實驗三、四實驗三、四2細胞總蛋白提取細胞總蛋白提取 濃度測定濃度測定 SDS-PAGE Western Blot實驗五、六實驗五、六溫馨提示女廁在女廁在3、5樓西側；男廁在樓西側；男廁在2、4樓西側樓西側寄包柜密碼僅一次有效，再次存放需重新寄包柜密碼僅一次有效，再次存放需重新啟動。非貴重物品建議不要存放，可放置啟動。非貴重物品建議不要存放，可放置旁邊的架子上旁邊的架子上走廊左側有飲水機走廊左側有飲水機3實驗本卷須知1. 1. 實驗用品分組實驗用品分組3 3人一組標志，放于實驗桌上。實驗開人一組標志，放于實驗桌上。實驗開始時清點；實驗終了，請各組同窗將用品歸于原位

3、，整理好始時清點；實驗終了，請各組同窗將用品歸于原位，整理好本組桌面后再分開。需求回收的器皿初步沖洗后浸泡在水槽本組桌面后再分開。需求回收的器皿初步沖洗后浸泡在水槽內的盆中如玻璃耗材等，有疑問請咨詢帶教教師內的盆中如玻璃耗材等，有疑問請咨詢帶教教師4實驗開場前請勿亂翻動！實驗開場前請勿亂翻動！每組每組2 2個盆，個盆，1 1個桶，分別放冰，液體渣滓，個桶，分別放冰，液體渣滓，固體渣滓，終了時每組自行清理固體渣滓，終了時每組自行清理52. 2. 實驗試劑：實驗試劑：常規試劑通常常規試劑通常3 3人一組放在桌上，部分試劑一大桌放一管人一組放在桌上，部分試劑一大桌放一管需求低溫放置的試劑在講臺，需到

4、講臺來加樣，特別是酶，需求低溫放置的試劑在講臺，需到講臺來加樣，特別是酶，加完及時放回原位加完及時放回原位有些常規用試劑如水，加樣有些常規用試劑如水，加樣bufferbuffer，可室溫保管，多，可室溫保管，多次運用次運用63. 3. 離心機的正確運用：留意平安和儀器維護離心機的正確運用：留意平安和儀器維護 平衡平衡 15ml 15ml連同托架一同平衡，連同托架一同平衡， 1.5ml 1.5ml目測體積，對應位置放置目測體積，對應位置放置 離心機蓋包括內蓋離心機蓋包括內蓋 最高速度不能超限最高速度不能超限 離心時，請等到達設定轉速并運轉正常后再分開離心時，請等到達設定轉速并運轉正常后再分開 離

5、心終了如是低溫離心，請先開機將離心機預冷，離心間歇離心終了如是低溫離心，請先開機將離心機預冷，離心間歇階段關機蓋，離心終了，請翻開機蓋晾干階段關機蓋，離心終了，請翻開機蓋晾干74.加樣槍加樣槍Pipet的正確運用的正確運用 當加樣槍轉到它的最高體積時，絕對不能再往前轉，不然當加樣槍轉到它的最高體積時，絕對不能再往前轉，不然這把加樣槍就會被損壞，完全不能再用。這把加樣槍就會被損壞，完全不能再用。選用適宜量程的加樣器選用適宜量程的加樣器正確進展刻度調理不能旋過頭正確進展刻度調理不能旋過頭清潔維護加樣器清潔維護加樣器吸樣品和加樣品時的手勢合理吸樣品和加樣品時的手勢合理8 加樣槍的維護：加樣槍的維護：

6、 汲取樣品時，加樣槍不要碰到管口或瓶壁汲取樣品時，加樣槍不要碰到管口或瓶壁 汲取酚、氯仿等腐蝕性液體時，要慢吸快放汲取酚、氯仿等腐蝕性液體時，要慢吸快放 刻度調試和清洗消毒刻度調試和清洗消毒保證汲取樣品量的準確并且不呵斥試劑浪費保證汲取樣品量的準確并且不呵斥試劑浪費 9準確汲取液體體積準確汲取液體體積10加樣前，先將裝試劑的加樣前，先將裝試劑的EP管輕彈幾下混勻，然后再進展管輕彈幾下混勻，然后再進展短暫離心后才干汲取樣品短暫離心后才干汲取樣品汲取樣品的時候，為保證汲取量的準確，需盡能夠將槍汲取樣品的時候，為保證汲取量的準確，需盡能夠將槍頭深化液體深部頭深化液體深部汲取粘稠的樣品如汲取粘稠的樣品

7、如DNA時，宜漸漸汲取以保證量的準確，時，宜漸漸汲取以保證量的準確，還可用同批槍頭汲取水分以察看液體在槍頭上的位置以還可用同批槍頭汲取水分以察看液體在槍頭上的位置以保證汲取量的準確保證汲取量的準確先加體積大的樣品，特別是水，然后再加小體積的樣品先加體積大的樣品，特別是水，然后再加小體積的樣品或酶等或酶等小體積的樣品或酶要參與到液體中，并需悄然吹打幾次小體積的樣品或酶要參與到液體中，并需悄然吹打幾次以混勻以混勻關于加樣槍運用，以下說法正確嗎？關于加樣槍運用，以下說法正確嗎？5. 5. 實驗中請留意化學試劑對人體的損傷。帶手套實驗中請留意化學試劑對人體的損傷。帶手套 如酚有腐蝕性；溴化乙啶有致癌之

8、嫌；丙烯酰胺有如酚有腐蝕性；溴化乙啶有致癌之嫌；丙烯酰胺有神經毒性；某些酸堿，尤其濃酸濃堿的腐蝕性；等神經毒性；某些酸堿，尤其濃酸濃堿的腐蝕性；等等。嚴防手套呵斥二次污染等。嚴防手套呵斥二次污染6. 6. 紫外線會呵斥眼睛損傷。在紫外檢測儀上察看電紫外線會呵斥眼睛損傷。在紫外檢測儀上察看電泳條帶時要蓋好有機玻璃板，或戴上防護面罩。泳條帶時要蓋好有機玻璃板，或戴上防護面罩。117. 7. 值日生將按組輪番，擔任整理實驗室。值日生將按組輪番，擔任整理實驗室。值日生擔任清理實驗室，倒渣滓，最后分開值日生擔任清理實驗室，倒渣滓，最后分開實驗報告撰寫實驗稱號、實驗時間、學生姓名、學號、專業、帶實驗稱號、

9、實驗時間、學生姓名、學號、專業、帶教教師等教教師等實驗目的、實驗原理、實驗器材和試劑可不寫、實驗目的、實驗原理、實驗器材和試劑可不寫、實驗步驟簡單、實驗結果、實驗本卷須知等實驗步驟簡單、實驗結果、實驗本卷須知等實驗討論對實驗過程、結果的討論；本人的領會實驗討論對實驗過程、結果的討論；本人的領會等等 重點重點12實驗報告要求每人獨立完成，分四次上交實驗報告要求每人獨立完成，分四次上交 儀器及位置引見13恒溫氣浴搖床恒溫氣浴搖床412室室超凈任務臺超凈任務臺14410室室制冰機制冰機低溫冰箱低溫冰箱15413室室全自動化學發光全自動化學發光/熒光圖像分析系統熒光圖像分析系統16402室室PCR儀儀

10、微孔板分光光度計微孔板分光光度計+ Take3超微量超微量多體積檢測板多體積檢測板 17交聯儀交聯儀雜交爐雜交爐402室室18水浴鍋水浴鍋實驗室側邊臺實驗室側邊臺脫色搖床脫色搖床191.5ml離心機臺式離心機臺式低溫離心機低溫離心機實驗室側邊臺實驗室側邊臺微波爐微波爐20電熱恒溫培育箱電熱恒溫培育箱實驗室側邊臺實驗室側邊臺分光光度計分光光度計2115ml離心機臺式離心機臺式低溫離心機低溫離心機實驗室后面邊臺實驗室后面邊臺實驗室桌上實驗室桌上22漩渦振蕩器漩渦振蕩器常溫低速小離心機常溫低速小離心機23可調微量加樣器和加樣頭可調微量加樣器和加樣頭實驗室桌上實驗室桌上24接種環接種環推棒推棒實驗室桌

11、上實驗室桌上25長玻璃試管長玻璃試管刻度吸管刻度吸管滴管滴管實驗室桌上實驗室桌上離心管離心管一、實驗目的1CaCl2法制備感受態細胞法制備感受態細胞 E.coli DH52目的基因與載體的銜接目的基因與載體的銜接c-myc pSV；粘端銜接；粘端銜接3重組質粒轉化大腸桿菌并挑選轉化體重組質粒轉化大腸桿菌并挑選轉化體 DH5 ；Ampr 實驗一 DNA重組與細胞轉化二、基因工程技術的根本內容質粒載體質粒載體pSV的構建的構建目的基因目的基因c-myc基因片段的獲取基因片段的獲取載體與目的基因的銜接粘端銜接載體與目的基因的銜接粘端銜接重組體導入受體細胞重組體導入受體細胞CaCl2法制備感受態細胞法

12、制備感受態細胞重組體的鑒定重組體的鑒定目的基因在細胞中的表達目的基因在細胞中的表達表達產物的分別、鑒定表達產物的分別、鑒定2728 pSV 3.5kbBamH I Xba Ic-myc DNA片段片段4.8kbT4DNA銜接酶銜接酶大腸桿菌大腸桿菌E.coli DH5CaCl2法法感受態細胞感受態細胞轉化轉化Amp平板平板轉化轉化推板推板孵育過夜孵育過夜8.5kbBamH I Xba I pSV29pSV-c-mycBamH IXba Ic-myc基因片段基因片段4.8 kbpSV2載體片段載體片段3.5kbpSVcmyc1 pmetD (ATCC 41029) -TCTAGA-AGATCT-

13、粘性末端粘性末端防止載體的本身環化防止載體的本身環化目的基因定向插入目的基因定向插入30目的基因目的基因c-myc基因片段的獲基因片段的獲取取c-myc基因是基因是myc基因家族的重要成員之一基因家族的重要成員之一c-myc基因與多種腫瘤發生開展有關基因與多種腫瘤發生開展有關本實驗采用的本實驗采用的4.8kbc-myc基因位于基因位于2,3外顯子區域外顯子區域BamH I 和和Xba I 雙酶切處置雙酶切處置31 載體與目的基因的銜接構建重組子載體與目的基因的銜接構建重組子1. 平端銜接平端銜接 添加添加DNA濃度或提高銜接酶濃度以提高銜接濃度或提高銜接酶濃度以提高銜接效率效率2. 粘端銜接粘

14、端銜接 效率較高，參與銜接酶后可立刻轉化，即有轉效率較高，參與銜接酶后可立刻轉化，即有轉化子出現化子出現3. 粘粘-平銜接平銜接32銜接酶的選擇：銜接酶的選擇： T4 DNA銜接酶：適用粘端、平端銜接銜接酶：適用粘端、平端銜接 可用于可用于DNA-RNA，RNA-RNA雜交體雜交體 大腸桿菌大腸桿菌DNA銜接酶：適用粘端銜接銜接酶：適用粘端銜接也可用于平端，效率低也可用于平端，效率低銜接溫度：銜接溫度： 普通普通1216 ，也可提高溫度到，也可提高溫度到22 載體與目的基因的比例：載體與目的基因的比例： 摩爾比約摩爾比約1：1 1：533轉化：將異源轉化：將異源DNA分子引入另一細胞，使分子引

15、入另一細胞，使受體細胞獲得新的遺傳性狀。受體細胞獲得新的遺傳性狀。感受態細胞：受體細胞經特殊方法如電感受態細胞：受體細胞經特殊方法如電擊、擊、CaCl2等處置，細胞膜的通透性發生等處置，細胞膜的通透性發生改動，允許帶外源改動，允許帶外源DNA的載體分子進入的的載體分子進入的形狀，稱之。形狀，稱之。轉化體的挑選：選擇性培育基轉化體的挑選：選擇性培育基 如：如：Amp抗性平板抗性平板目的基因片段目的基因片段4.8kb，20ng/l 4.5 l 載體載體DNA3.5kb， 12ng/l 4.0 l 10 銜接銜接buffer 1 l T4 DNA 銜接酶銜接酶10U/ l) 0.5 l 總體積：總體

16、積： 10 l 混勻，混勻，16 水浴中溫育水浴中溫育24小時，小時，4 保管保管備用。備用。 四、實驗步驟詳見實驗講義1. 目的基因目的基因c-myc與與pSV質粒載體的銜接質粒載體的銜接(粘端粘端)34留意：留意：加樣前短暫離心加樣前短暫離心加樣順序加樣順序保證每個樣品參與其保證每個樣品參與其中中加樣完成后混勻后離加樣完成后混勻后離心心2. CaCl2法制備感受態細胞法制備感受態細胞35留意：留意：最好在超凈任務臺內進展，或火焰旁最好在超凈任務臺內進展，或火焰旁5cm無菌圈無菌圈留意無菌操作和冰浴留意無菌操作和冰浴離心前必需平衡離心前必需平衡36倒入經冰預冷的倒入經冰預冷的15mL離心管，

17、冰浴離心管，冰浴10min37 振搖約振搖約2h，細菌長至云霧狀，細菌長至云霧狀取取0.1mL大腸桿菌大腸桿菌HB101培育物，加至培育物，加至5mLLB培育液中培育液中4 ，4000rpm，離心，離心10min棄上清，在紙巾上倒置棄上清，在紙巾上倒置1min，重懸于，重懸于200L 0.1mol/L CaCl2分裝成分裝成50 L /管管沉淀重懸于冰預冷的沉淀重懸于冰預冷的1mL，0.1mol/L CaCl2 ，混勻，混勻轉入轉入1.5mL離心管，冰浴離心管，冰浴10min4 ，4000rpm，離心，離心10min棄上清，在紙巾上倒置棄上清，在紙巾上倒置1min3. 重組質粒轉化感受態細胞重

18、組質粒轉化感受態細胞375L銜接產物或陽性對照質粒銜接產物或陽性對照質粒1L分別參與分別參與50 L感受態細感受態細胞，冰浴胞，冰浴30min42 90sec立刻冰浴立刻冰浴12min分別參與分別參與LB培育液培育液 150 L ，37 振搖振搖45min分別取分別取200L/100L鋪板于含鋪板于含Amp的的LB平板平板轉移要快，溫度要準確轉移要快，溫度要準確37 溫箱培育過夜溫箱培育過夜影響轉化效率的要素1. 感受態細菌的效價感受態細菌的效價2. 轉化的條件轉化的條件3. 質粒質粒DNA與受體菌的比例與受體菌的比例3839結果察看：結果察看：次日取平板察看次日取平板察看4 保管備用保管備用

19、下次實驗：重組DNA的提取及其酶切鑒定下周實驗課前一天下周實驗課前一天5月月6日下午日下午3:304:00挑克隆，過時不候挑克隆，過時不候 40示教：示教： 挑克隆挑克隆思索與疑問：思索與疑問：1. 1. 做感受態時，為何要在冰浴下進展？做感受態時，為何要在冰浴下進展？ 微生物培育時普通培育基中的水分含量較高，且培育溫度普通較高，假設微生物培育時普通培育基中的水分含量較高，且培育溫度普通較高，假設不將培育皿翻轉，培育基中的水分會揮發出來，呵斥培育基中的水分損失，不將培育皿翻轉，培育基中的水分會揮發出來，呵斥培育基中的水分損失，另外，揮發出來的水分會在培育皿蓋子上凝結成水珠，水珠較大時會滴落另外，揮發出來的水分會在培育皿蓋子上凝結成水珠，水珠較大時會滴落下來，對菌落生長和菌落形狀都會呵斥影響。因此，為了防止這兩方面的下來，對菌落生長和菌落形狀都會呵斥影響。因此，為了防止這兩方面的影呼應將培育皿翻轉過來。影呼應將培育皿翻轉過