1、實驗三 微生物接種技術 一、實驗目的1、掌握無菌操作在微生物接種過程中的重要性。2、掌握幾種常用的微生物接種方法。3、掌握微生物微生物擴大繁殖的基本方法。4、認識微生物接種工具二、實驗原理 微生物接種技術是生物科學研究中最基本的操作技術。由于實驗目的、培養基種類及容器等不同，所用接種方法不同，如斜面接種、液體接種、固體接種和穿刺接種等，以獲得生長良好的純種微生物。為此，接種必須在一個無雜菌污染的環境中進行嚴格的無菌操作；同時，因接種方法的不同，常采用不同的接種工具，如接種針、接種環、移液管和玻璃刮鏟等。三、實驗器材主要儀器及設備 無菌室、超凈工作臺、培養箱、振蕩器、接種針、接種環、接

2、種鉤、接種鏟，試管固體斜面培養基、培養基平板、三角瓶液體培養基，PDA平板及斜面，牛肉膏-蛋白胨-瓊脂平板、斜面培養基、牛肉膏-蛋白胨液體培養基、試管半固體培養基。菌種 大腸桿菌（Escherichia coli)、青霉(Penicillium sp)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)、細黃鏈霉菌(Streptomyces microflavus)放線菌等。四、操作步驟 (一)斜面接種技術具體操作如下： 1、貼標簽 接種前在試管上貼上標簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等。貼在距試管口徑2-3厘米的位置。 2、點燃酒精燈。 3、接種 用接種環將菌種移接

3、到貼好標簽的試管斜面上。無菌操作程序簡述如下： 手持試管 將菌種和用于接種的斜面兩支試管用大拇指和其他四指握在左手中、使中指位于兩試管之間。斜面向上，并使它們位于水平位置(圖a)。 旋松棉塞 先用右手將棉塞旋松，以便接種時易于拔出。取接種環 右手拿接種環在火焰將環端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部分，均用火燒過滅菌。拔棉塞 用右手的無名指、小指和手掌邊先后拔出試管的棉塞，然后讓試管口緩緩過火滅菌(切勿燒得過燙)，如圖b、c所示。環冷卻 將灼燒過的接種環伸入菌種管，先使環接觸沒有長菌的培養基部分，使其冷卻。取菌種 待環冷卻后輕輕沾取少量菌或孢子，然后將接種環移出接種管，如圖d所示，注意不要

4、使環的部分碰到管壁，取出后不可使環通過火焰。接種 在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環伸入另一支待接斜面試管。從斜面培養基的底部向上部作“之” 字形來回劃線，方向是從下部開始，一直劃至上部，勿劃破培養基(圖e)。有時也可用接種針僅在斜面培養基的中央劃一條線作斜面接種，以便觀察菌種的生長特點。塞棉塞 取出接種環，灼燒試管口，并在火焰旁將棉塞塞上。塞棉塞時，不要用試管迎棉塞，以免試管在移動時帶入不潔空氣，如圖f、g所示。環滅菌 將接種環燒紅滅菌。放下接種環，再將棉花塞旋緊，如圖所示。斜面接種時的無菌操作（二）穿刺接種 （1）取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白胨柱狀培養基，做好標記（寫上菌名）、接種日期

5、，接種人等）。（2）接種的方法是，用接種針沾取少量待接菌種，然后從柱狀培養基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路線抽出接種針，注意接種針不要移動。（3）接種后30恒溫培養， 24h后觀察，比較兩種菌的生長結果。    穿刺接種示意圖   （三）液體接種1、用斜面菌種接種液體培養基，分為兩種情況：（1）如接種量小，可用接種環（鏟、針等）取不量菌體移入培養基容器中，將環在液體表面處的器壁上輕輕摩擦，使菌苔碾散；抽出接種環再搖動液體培養基使菌體均勻分布在液體中。（2）如接種量大，可先在斜面菌種管中倒入一定量的無菌水，用接種環將菌苔刮下，再將菌懸液倒入液體培養基中，倒前需將管口在火焰上灼燒滅菌。（四）平板接種以中指、無名指及小指托住培養皿下蓋底部，用虎口及食指扶住上蓋，再將斜面菌種管放于培養皿上之上，以拇指壓住。然后以移菌環挑菌苔的菌體移入平板的中央，也可在平板上劃線3-5條。五、接種后的培養 將接種后的試管、平板放適宜的條件下培養，分別于48h、72h后進行觀察。六、報告 1、觀察記述所有接種培養的微生物的形態特征、生長情況等，結果填入表內：觀察項目菌名(細菌)菌名(放線菌)菌名(霉母)菌名(酵母菌)形 狀突 起色 素大 小透明程度氣味干濕度 2、思考題：1）接種前后為什么要灼燒接種環