1、第三章微生物的代謝調節和代謝工程P22 代謝調節：微生物本身的調節體系。為了適應外界環境，經濟合理的利用各種物質和能量，維持自身的生長繁殖。 代謝工程（調控）：人工調節體系。人為的讓微生物積累人們需要的代謝產物。 代謝工程要勝于代謝調節：目的產物的積累往往對微生物的生長不利，微生物要通過代謝調節來解除人的目的產物的積累。代謝工程需要戰勝微生物的代謝調節。代謝調節？代謝工程？微生物的代謝調節反饋抑制、反饋阻遏、酶的誘導調節、酶的共價修飾等。代謝工程 育種：通過人工誘變，雜交，基因工程的技術改變代謝流，篩選突變株。 控制微生物培養條件，影響其代謝過程，積累目的產物。提綱1. 微生物的代謝類型和自我

2、調節2. 酶活性調節3. 酶合成調節4. 分支生物合成途徑的調節5. 能荷調節6. 代謝調控7. 次級代謝與次級代謝調節8. 代謝工程3.1 微生物的代謝類型和自我調節分解代謝易降解物質優先高分子有機物 低分子CO2合成代謝現有前體物質優先ATPNADH中間體 分解代謝 易降解物質優先，降解時消耗能量少 抑制難降解物質的降解 合成代謝 首先利用周圍現有前體物質 抑制現有前體物質的合成，節約能量代謝調節的宗旨是勤儉節約3.1.2 微生物自我調節部位1. 通過細胞膜調節：親水分子不能通透細胞膜。需要轉運系統進行吸收和外排。2. 控制通量：（1）調節酶量粗調（2）改變現有酶的活性細調3.2 酶活性的

3、調節酶活性的調節： 指在酶分子水平上的一種代謝調節，它是通過改變現成的酶分子活性來調節新陳代謝的速率。酶活性：抑制激活 抑制劑和激活劑可以是外源物，也可是自身代謝物。一般是低分子化合物。 酶活性的激活 在分解代謝途徑中，后面的反應可被較前面的中間產物所促進。 酶活性的抑制 主要是反饋抑制;主要表現在某代謝途徑的末端產物（即終產物）過量時，這個產物可反過來直接抑制該途徑中第一個酶的活性，促使整個反應過程減慢或停止，從而避免了末端產物的過多累積。 3.2.1 酶的激活作用與抑制作用ATP激活CTP抑制3.2.2 酶活性調節的機制1. 變構調節：改變分子的空間構型來調節酶的活性激活劑活性變大抑制劑活

4、性變小2 化學修飾：磷酸化或乙酰化修飾酶來調節酶的活性。檸檬酸檸檬酸裂解酶乙酸 + 草酰乙酸3.2.2 酶活性調節的機制第三章微生物的代謝調節和代謝工程1. 微生物的代謝類型和自我調節2. 酶活性調節3. 酶合成調節4. 分支生物合成途徑的調節5. 能荷調節6. 代謝調控7. 次級代謝與次級代謝調節8. 代謝工程3.3 酶合成的調節 底物一定時，酶的量決定反應的速度。酶量的調節過程中不涉及酶的活性變化。 調節部位在轉錄和翻譯水平上 方式：誘導和阻遏3.3.1 酶合成的誘導作用 組成酶：始終合成的酶。例如糖酵解的酶。 誘導酶：葡萄糖以外的物質的降解大部分需要誘導。 芳香族化合物，環境污染物質。

5、同一個酶可以有多種誘導劑，但誘導能力不同。IPTG (Isopropy-D-thiogalactoside)可以低濃度誘導lac啟動子3.3.2 酶合成的阻遏 末端產物阻遏：普遍存在于氨基酸，核苷酸的合成。3.3.2 酶合成的阻遏分解代謝物阻遏作用（metabolite repression） 葡萄糖和其他碳源混合培養時，葡萄糖的代謝產物阻遏其他碳源的利用。葡萄糖生長曲線時間量木糖3.3.3 酶合成調節的機制 操縱子（Operon）模型：基因在染色體上以操縱子的形式存在。完美的操縱子1. 編碼阻遏物的調節基因 R (regulator)2. 阻遏物結合部位 O (operator)3. 啟動子

6、 P (promoter)4. 結構基因 S (structure gene)乳糖操縱子完美的操縱子1. 編碼阻遏物的調節基因 R (regulator)2. 阻遏物結合部位 O (operator)3. 啟動子 P (promoter)4. 結構基因 S (structure gene)現實完美的東西少MannitolDehydrogenaseMannitolFructoseMannitolMtlTFructose-1PPtsFFructose-1,6BPPfkBGlycolysisMtlDNAD+ NADH?阻遏蛋白結構基因 S調節基因 R棒狀桿菌的甘露醇代謝途徑阻遏物結合部位 O啟動子

7、PF-mtlRT0 50 100DNA (2 nM)MtlR-His (nM)DNA (2 nM)MtlR-His (100 nM)F-mtlR1+ -F-mtlR2+ -F-mtlT1+ -F-mtlT2+ -F-mtlT3F-mtlT4F-mtlR4F-mtlR3F-mtlR5F-mtlR6DNA (10 nM)MtlR-His (900 nM)Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)凝膠遷移怎樣才能知道DNA與蛋白質結合69446001200180024003000360042004800540060006600102030405060GCG

8、GGAATCA CTTGGGACAT GTGAAAAAGT TACCACGGAA ATGTTGTTAG ATCCAGCACTCGCCCTTAGT GAACCCTGTACACTTTTTCA ATGGTGCCTT TACAACAATC TAGGTCGTGA708090100110120TTCTAACATT TTTATGTTAG GTCTTGCTTT TTTATAACAT GATGGCGTTA GATTGTTGTTAAGATTGTAA AAATACAATC CAGAACGAAA AAATATTGTA CTACCGCAAT CTAACAACAA130140150160170180AGTTTCACGT

9、GATTCGCACC ACGAACTAAT CGGAATTGTG AGTTCAGCGC TGAAGCTACGTCAAAGTGCA CTAAGCGTGG TGCTTGATTA GCCTTAACAC TCAAGTCGCG ACTTCGATGC190200210220230240CCAGATTTTG TTGAATCTAA CACGGATTTA ACGTGACGGT TTCTCAGTGT TTTTAGCTTCGGTCTAAAAC AACTTAGATT GTGCCTAAAT TGCACTGCCA AAGAGTCACA AAAATCGAAG250260270280290300TGGCTTTTGG CTTC

10、TGATGC TTTAGCGCTG GACTCAACAT TTAAAACAAA GGTGAACACAACCGAAAACC GAAGACTACG AAATCGCGAC CTGAGTTGTA AATTTTGTTT CCACTTGTGT310320330340350360TGTCAGTACA GCAAAGCGG ACAGTCATGT CGTTTCGCC mtlR+1-10-35-10-35+1mtlTGCMtlR binding site 1MtlR binding site 3MtlR binding site 2CglR0187, mtlR(DeoR type repressor)CglR018

11、6, mtlT(MFS family I, transporter)CglR0185, mtlD(Mannitol 2-dehydrogenase)Mannitol catabolic operon of R strain3.3.3.1 單一效應物調節 負調節3.3.3.1 單一效應物調節 正調節ABD轉錄激活物3.3.3.2 兩種效應物共同調節乳糖和葡萄糖同時存在時葡萄糖優先利用的原則葡萄糖存在時cAMP濃度下降葡萄糖不存在時cAMP濃度上升cAMP結合CRP蛋白誘導其他糖的利用cAMP乳糖同時存在時結構基因轉錄3.3.3.3 弱化調節（Attenuation）精細調控，調節位點在翻譯和轉錄

12、水平上。色氨酸合成的調節細胞內有色氨酸存在時，8090%的翻譯停止。提綱1. 微生物的代謝類型和自我調節2. 酶活性調節3. 酶合成調節4. 分支生物合成途徑的調節5. 能荷調節6. 代謝調控7. 次級代謝與次級代謝調節8. 代謝工程3.4 分支生物合成途徑的調節單一直鏈式代謝途徑的調節比較簡單。一般是最終產物的反饋調節。分支生物合成途徑的情況較為復雜。 為避免在一個分支上的產物過多時不致同時影響另一分支上產物的供應，微生物已發展出多種調節方式。 同工酶 協同反饋 累加反饋 增效反饋 順序反饋 聯合激活或抑制調節 酶的共價修飾 同功酶是指能催化相同的生化反應的酶，它們雖同存于一個個體或同一組織

13、中，但在生理、免疫和理化特性上卻存在著差別。（1）同工酶調節天冬氨酸（1）同工酶調節 指分支代謝途徑中的幾個終產物同時過量時才能抑制共同途徑中的第一個酶的一種反饋調節方式。（2）協同反饋抑制終產物濃度的和 催化分支合成途徑第一步反應的酶有幾種末端產物抑制物，但每一種如過量，按一定百分率單獨抑制共同途徑中的第一個酶活性，總的抑制效果是累加的，各末端產物所起的抑制作用互不影響，只影響這個酶促反應的速率。（3）累積反饋抑制 兩種末端產物同時存在時，可以起著比一種末端產物大得多的反饋抑制作用。 （4）增效反饋抑制 每個分支末端產物抑制分支后的第一個酶，產生部分抑制作用。通過逐步有順序的方式達到的調節。

14、 （5）順序反饋抑制 一個中間產物參加兩個不同的代謝途徑。這個中間產物的量影響兩個代謝途徑。（6）聯合激活或抑制調節 通過共價修飾（小分子）的改變酶的活性。（7）酶的共價修飾活性小活性大提綱1. 微生物的代謝類型和自我調節2. 酶活性調節3. 酶合成調節4. 分支生物合成途徑的調節5. 能荷調節6. 代謝調控7. 次級代謝與次級代謝調節8. 代謝工程3.5 能荷的調節 能荷：高能磷酸鍵的量度。 能荷調節（或稱腺苷酸調節）：指細胞通過改變ATP、ADP、AMP三者的比例來調節其代謝活動。 細胞內3種腺苷酸含量不同，細胞的能荷狀態不同。能荷狀態用“能荷”表示 當細胞內全部為ATP 能荷為100%

15、抑制 當細胞內全部為ADP 能荷為50% 當細胞內全部為AMP 能荷為0% 激活 12能 荷100%ATPADPATPADPAMP3.5 能荷的調節能荷的調節：抑制，激活葡萄糖的代謝合成ATP酶系消耗ATP酶系生長期靜止期能荷的平衡抑制：能荷0.75提綱1. 微生物的代謝類型和自我調節2. 酶活性調節3. 酶合成調節4. 分支生物合成途徑的調節5. 能荷調節6. 代謝調控7. 次級代謝與次級代謝調節8. 代謝工程兩種調節的對比酶合成的調節酶活性的調節不同點調節對象通過酶量的變化控制代謝速率控制酶活性，不涉及酶量變化調節效果相對緩慢快速、精細調節機制基因水平調節，調節控制酶合成酶分子水平調節，調

16、節酶活性相同點細胞內兩種方式同時存在，密切配合，高效、準確控制代謝的正常進行。提綱1. 微生物的代謝類型和自我調節2. 酶活性調節3. 酶合成調節4. 分支生物合成途徑的調節5. 能荷調節6. 代謝調控7. 次級代謝與次級代謝調節8. 代謝工程3.6 代謝調控人為的代謝調控 原則：經濟合理地利用資源，合成積累目的產物。 辦法1.通過發酵條件控制，影響其代謝過程2.改變細胞的滲透性 3.改變菌種的遺傳特性 4.代謝工程：利用基因工程技術，擴展和構建、連接，形成新的代謝流。（也稱途徑工程）3.6.1 發酵條件的控制3.6.1.1 各種發酵條件對微生物代謝的影響 同一種微生物在同樣的培養基中進行培養

17、時，只要控制不同的發酵條件，就可能獲得不同的代謝產物。 如：啤酒酵母在中性和酸性條件下培養，可將葡萄糖氧化生成乙醇；當在培養基中加入亞硫酸氫鈉或在堿性條件下培養時，則并不產生乙醇。 葡萄糖 葡萄糖-6-磷酸 果糖-6-磷酸 果糖-1，6-二磷酸二羥丙酮磷酸 甘油醛-3-磷酸 (2) 1，3-二磷酸甘油酸 (2) 3-磷酸甘油酸 (2) 2-磷酸甘油酸 (2) 磷酸烯醇式丙酮酸 (2) 丙酮酸 (2) 乙醛 (2) 乙醇酵母利用葡萄糖的發酵 I, II, III型弱堿性環境,歧化反應2 NADH乙醇+乙酸亞硫酸氫鈉+乙醛=磺化羥基乙醛（不溶）NADH3-磷酸甘油甘油I型II型III型甘油歧化反應

18、CH3CHO + CH3CHO CH3COOH + CH3CH2OH+3-1+12e+1 控制不同的發酵條件，影響微生物自身的代謝調節系統，從而改變其代謝方向，使之按人們所需要的方向進行，高濃度積累所需要的產物。 許多與蛋白質、糖類或其他物質降解有關的酶類都是誘導酶，在發酵過程中加入相應的底物作為誘導物，可以有效地增加這些酶的產量。木霉發酵生產纖維素酶槐糖半纖維素酶木糖青霉素酰化酶苯乙酸乙內酰胺酶底物類似物為誘導物3.6.1.2 使用誘導物3.6.1.3 添加生物合成的前體 例：鄰氨基苯甲酸僅參與色氨酸的最后階段的合成，如果在發酵中加入鄰氨基苯甲酸，雖然色氨酸對第一個酶的反饋抑制仍然存在，但對

19、由鄰氨基苯甲酸合成色氨酸并無影響，使色氨酸的合成可以不斷進行，從而大幅度提高了發酵產量。3.6.1.4 培養基成分和濃度的控制 培養基即要保證微生物機體生長需要，又要利于代謝產物的合成。須考慮培養基的組成和濃度，盡量避免培養基使用不當引起的分解代謝阻遏。 在發酵培養基中通常采用適量的速效和遲效碳源。速效的過多會引起老廢物（酸）的積累。1. 用甘油代替果糖作為碳源培養嗜熱脂肪酵母，可以使淀粉酶的產量提高25倍以上；2. 用甘露糖代替乳糖作為培養熒光假單胞菌的碳源，使纖維素酶產量提高1500倍以上。 遲效代替速效碳源的例子3.6.2 改變細胞透性 在發酵過程中，可以控制使用那些影響細胞膜通透性的物

20、質作為培養基的成分，有利于代謝產物分泌出來，避免了末端產物的反饋調節。改變細胞的通透性的方法：限制培養基中生物素濃度在15mg/L，控制細胞膜中脂質的合成；加入青霉素，抑制細胞壁肽聚糖合成中肽鏈的交聯；加入甘氨酸，是細胞壁松散還可加入表面活性劑如Tween80或陽離子表面活性劑，將脂類從細胞壁中溶解出來，使細胞壁疏松，通透性增加；控制Mn2+、Zn2+的濃度，干擾細胞膜或細胞壁的形成。另外，還可以通過誘變育種的方法，篩選細胞透性突變株。降低培養基中的積累物質的濃度離子交換樹脂，蒸發，結晶, pH3.6.3 菌種遺傳特性的改變 改變微生物的遺傳特性，即改變酶的活性或酶的合成系統，使之對反饋調節不敏感，達到過量生產代謝產物的目的。抗反饋阻遏抗反饋抑制營養缺陷型 ABCDRSPABCDR阻遏蛋白結構酶基因ABCDRSPABCDR結構酶基因反饋阻遏（轉錄水平）抗ABCDRS