1、1流式細胞術的原理及應用流式細胞術的原理及應用臨床實驗診斷教研室臨床實驗診斷教研室 施瓊施瓊2=流式細胞術（流式細胞術（Flow CytometryFlow Cytometry, FC/MFACS, FC/MFACS）是）是一種可以快速、準確、客觀，并且同時檢測單個一種可以快速、準確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞）的多項特性的技術，同時可微粒（通常是細胞）的多項特性的技術，同時可以對特定群體加以分選以對特定群體加以分選=研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、研究對象為生物顆粒，如各種細胞、染色體、微生物、及人工合成微球等微生物、及人工合成微球等=研究的微粒特性包括多種物理及生物學特

2、征，研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征，并加以定量并加以定量34FACS Calibur5BD LSR6FACS Vantage DiVa科研型（大型機）特點：多數字化適用于各類細胞分選4路分選7FACSAria科研型8細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質含量細胞結構特異性抗原（細胞表面/胞漿/核）細胞內細胞因子細胞活性酶活性激素結合位點細胞受體細胞功能9l19341934年，年，MoldavanMoldavan開創流式細胞自動計數的基礎。開創流式細胞自動計數的基礎。l1950s1950s，CoulterCoulter公司設計細胞自動計數器，初步解公司設

3、計細胞自動計數器，初步解決了流動細胞的通路問題。決了流動細胞的通路問題。l19651965年，在細胞分選中應用了超聲震動器。年，在細胞分選中應用了超聲震動器。 l19691969年，年，StanfordStanford、CaliforniaCalifornia大學的研究組發明大學的研究組發明了第一臺較滿意的流式細胞儀。了第一臺較滿意的流式細胞儀。l19721972年，年，FACS-FACS-型儀器試制成功，并在美國建國型儀器試制成功，并在美國建國200200周年紀念會上與人造衛星并列展示。周年紀念會上與人造衛星并列展示。10流式細胞儀的工作原理11FCMFCM的工作系統的工作系統1213=液流

4、系統液流系統=光學系統光學系統激光光源 光收集系統=電子系統電子系統 光電轉換 數據處理系統=細胞分選系統細胞分選系統14液流系統：流動室、液流驅動系統液流系統：流動室、液流驅動系統Injector TipSheath fluid15液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱16光學系統光學系統=入射光系統：入射光系統：激光激光 (Laser)(Laser)是一種相干光源，是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩定光它能提供單一波長、單一方向、同步的穩定光照。照。=發射光系統：發射光系統：散射光和熒光散射光和熒光=光收集系統光收集系統是由若干組透鏡、濾波片和小孔組是由若干組透鏡、濾波片和

5、小孔組成成, ,將產生的光信號引導至檢測將產生的光信號引導至檢測器器17入射光入射光激光光源激光光源單波長、高強度、高穩定性單波長、高強度、高穩定性多采用氬離子激光器或氦氖激光器多采用氬離子激光器或氦氖激光器一般選配一般選配2-42-4根激光，根激光，488nm 488nm 、633nm633nm、355nm355nm和和407nmUV407nmUV激光激光最多檢測最多檢測1313個熒光參數個熒光參數 1819發射光發射光l散射光信號散射光信號 前向散射光前向散射光（fowordfoword scatter, FS scatter, FS）：在激）：在激光束正前方的檢測器，用于檢測細胞或其他粒

6、子光束正前方的檢測器，用于檢測細胞或其他粒子物體的表面屬性，如大小、形狀等。物體的表面屬性，如大小、形狀等。 側向散射光側向散射光（side scatterside scatter， SSSS）：與激光）：與激光束垂直方向的檢測器為側向檢測器，主要用于檢束垂直方向的檢測器為側向檢測器，主要用于檢測細胞內部結構屬性，可獲得細胞內超微結構和測細胞內部結構屬性，可獲得細胞內超微結構和顆粒性質的參數。顆粒性質的參數。l熒光信號熒光信號20散射光FSC（小角散射光)它反應細胞的相對大小和截面積的大小90度角散射光)全血細胞流式全血細胞流式FSC-SSC圖圖它反應細胞的物理特性它反應細胞的物理特性, ,根

7、據前側向散射光，可以把不同根據前側向散射光，可以把不同類型的細胞群加以區分類型的細胞群加以區分21FALS SensorLaser22FALS Sensor90LS SensorLaser23LaserFreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)Purdue University Cytometry Laboratories24Longpass Shortpass Bandpass460 500 540460 500 540460 500 540光收集系統：濾光片光收集系統：濾光片25 電子系統：光電倍增管（

8、電子系統：光電倍增管（PMTPMT）26FACSCalibur 光路圖27細胞分選系統細胞分選系統28 當含細胞的液滴逐個通過激光束時，受到兩種檢當含細胞的液滴逐個通過激光束時，受到兩種檢測器的檢測測器的檢測: :如果液滴中含有細胞就會激活干涉檢測如果液滴中含有細胞就會激活干涉檢測器器(interference detector)(interference detector)，只有帶有熒光標記細，只有帶有熒光標記細胞的液滴才會激活熒光檢測器胞的液滴才會激活熒光檢測器(fluorescence (fluorescence detector)detector)。當帶有熒光標記的液滴通過激光束時，。

9、當帶有熒光標記的液滴通過激光束時，將兩種檢測器同時激活，引起液滴充電信號使鞘液將兩種檢測器同時激活，引起液滴充電信號使鞘液帶上負電荷。由于液滴帶有負電荷，移動時就會向帶上負電荷。由于液滴帶有負電荷，移動時就會向正極移動，進入到熒光標記細胞收集器中。正極移動，進入到熒光標記細胞收集器中。細胞分選的原理細胞分選的原理29Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector30自發熒光特異熒光特異

10、熒光能量級激發激發態發射激光能量損失31FALS SensorLaser前向散射光前向散射光 32前向散射光前向散射光33FALS Sensor90LS SensorLaser側向散射光側向散射光34側向散射光側向散射光35l每種熒光染料都有特定的激發波長和發射波長，流每種熒光染料都有特定的激發波長和發射波長，流式細胞儀利用不同波長的式細胞儀利用不同波長的光學濾片光學濾片來檢測這些特定來檢測這些特定發射波長的光學信號。發射波長的光學信號。l長通濾片長通濾片允許長于設定波長的光通過允許長于設定波長的光通過 短通濾片短通濾片允許短于設定波長的光通過允許短于設定波長的光通過 帶通濾片帶通濾片允許一定

11、帶寬允許一定帶寬波長的光通過波長的光通過 二向色性濾片二向色性濾片當以當以 4545o o 角角放置濾片時放置濾片時, ,該濾片該濾片可以通過一定波長的光可以通過一定波長的光, ,同時也可以阻斷并折射該波同時也可以阻斷并折射該波長以下的光長以下的光 36=熒光素吸收激光能量熒光素吸收激光能量=熒光素將吸收能量釋放，轉換為熒光素將吸收能量釋放，轉換為 振動能和熱能振動能和熱能 釋放較入射光波長更長的光量子釋放較入射光波長更長的光量子=熒光素與特異抗體結合熒光素與特異抗體結合=熒光抗體與細胞抗原結合越多，產生的熒光信號越強熒光抗體與細胞抗原結合越多，產生的熒光信號越強3738PMTPMTPMTPM

12、T 4DichroicFiltersBandpassFiltersFlow Cytometry PrincipleLaser 1234Flow cell3940常用熒光染料的特性熒光染料 激發波長 (nm) 發射波長(nm) 用途 顏色FITC 488 525 免疫熒光 綠色PE(RD1) 488 575 免疫熒光 橙色ECD 488 620 免疫熒光 橙紅PeCy5 488 675 免疫熒光 紅PI 488 620 DNA染色 橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC 633 67041 進行信號檢測和分析進行信號檢測和分析=當細胞攜帶熒光素標記物當細胞

13、攜帶熒光素標記物, , 通過激光照射區時受到激發通過激光照射區時受到激發, , 產生不同波長的、代表細胞內不同物質的熒光信號產生不同波長的、代表細胞內不同物質的熒光信號=熒光信號由光電接收器接收，轉變為電信號，可分析電熒光信號由光電接收器接收，轉變為電信號，可分析電壓脈沖的高度、面積和寬度壓脈沖的高度、面積和寬度=電脈沖信號經電脈沖信號經A/DA/D轉換成數字信號轉換成數字信號=數字信號傳送到計算機，進行儲存、數字信號傳送到計算機，進行儲存、 作圖、作圖、 統計分析統計分析42數據處理 檢測數據的顯示視測量參數的不同有多種形式檢測數據的顯示視測量參數的不同有多種形式可供選擇可供選擇單參數數據單

14、參數數據 以直方圖的形式表達，其以直方圖的形式表達，其X X軸為測軸為測量強度，量強度，Y Y軸為細胞數目。軸為細胞數目。雙參數或多參數數據雙參數或多參數數據 既可以單獨顯示每個參既可以單獨顯示每個參數的直方圖，也可以選擇二維的散點圖、等高線數的直方圖，也可以選擇二維的散點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。圖、灰度圖或三維立體視圖。43=直方圖分析直方圖分析X軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“通道數”表示，可以與光強度之間線性關系或對數關系Y軸：代表該通道內所出現具有相同光信號特征性細胞的頻率單參數直方圖（Histogram）44=點圖分析點圖分析便于數據統計不同的細胞群可以用不同的顏

15、色標記主要表達方式 Dot Plot45二維等高圖和密度圖46Pseudo 3D Plot3D Plot47流式細胞儀的應用流式細胞儀的應用48 淋巴細胞亞群測定、血小板分析、網織紅細胞分淋巴細胞亞群測定、血小板分析、網織紅細胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、造血干細胞移植監析、白血病和淋巴瘤免疫分型、造血干細胞移植監測、測、 HLA-B27HLA-B27分析、分析、PNHPNH診斷、人類同種異體器官移診斷、人類同種異體器官移植中應用、細胞因子測定、植中應用、細胞因子測定、AIDSAIDS診斷與治療和療效診斷與治療和療效評價、評價、flow-FISHflow-FISH法測定端粒長度法測定端粒長度

16、49 淋巴細胞功能、樹突狀細胞（DC）研究、造血干細胞研究、細胞周期分析、細胞凋亡分析、凋亡相關蛋白分析、細胞功能研究、多藥耐藥基因研究（MDR）、腫瘤相關基因表達研究、RNA測定、DNA測定、總蛋白測定、癌基因和抑癌基因表達產物測定、血管內皮細胞研究5051l首選直接標記抗體首選直接標記抗體l根據儀器型號和抗原表達強弱合理選擇熒光抗體根據儀器型號和抗原表達強弱合理選擇熒光抗體 PEPE最強，適用于弱表達抗原最強，適用于弱表達抗原 FITCFITC最便宜，適用于強表達抗原最便宜，適用于強表達抗原l使用雙標以上抗體必做熒光補償使用雙標以上抗體必做熒光補償52光譜交叉Emission wavele

17、ngth (nm) 530 580 630 680 730 780FITCPEPE-TRPE-CY54 colors - simultaneous collection兩色以上熒光分析存在 光譜交叉53熒光補償方法熒光補償方法所有補償調為“0”調節電壓，用同型對照或陰性對照，使陰性群位于“左下角”依單陽群體調節熒光補償54l制備制備單細胞懸液單細胞懸液是流式細胞分析的基礎。是流式細胞分析的基礎。l標本應標本應新鮮新鮮；采用密度梯度離心分離外周血淋巴細胞，在分；采用密度梯度離心分離外周血淋巴細胞，在分離和洗滌過程中應離和洗滌過程中應避免高速離心避免高速離心而致細胞膜結構破壞。而致細胞膜結構破壞。

18、l常用常用溶血劑溶血劑處理紅細胞。處理紅細胞。l溫度和溫度和pHpH：25-3725-370 0C C，pH 7.0-7.2pH 7.0-7.2。l制備實體組織標本的單細胞懸液時多采用制備實體組織標本的單細胞懸液時多采用機械法機械法，而少用化，而少用化學法或酶消化法。學法或酶消化法。l被檢細胞或顆粒大小被檢細胞或顆粒大小0.20.280um80uml樣品中至少樣品中至少2000020000個細胞，濃度個細胞，濃度10105 5-10-107 7個個/ /毫升毫升55l空白對照：空白對照：l陰性對照：陰性對照： 常用同型抗體對照常用同型抗體對照 單色分析：設同型抗體對照單色分析：設同型抗體對照

19、多色分析：同型對照，單陽性對照多色分析：同型對照，單陽性對照（用于儀器校正）（用于儀器校正）l陽性對照：陽性對照：檢測陰性時檢測陰性時56l單細胞懸液的制備：胰酶消化單細胞懸液的制備：胰酶消化l抗體或標記分子的染色：抗原抗體反應抗體或標記分子的染色：抗原抗體反應l非特異結合的去除：洗滌和封閉非特異結合的去除：洗滌和封閉 封閉：血清和同型抗體封閉：血清和同型抗體57l熒光染料濃度的控制：熒光染料濃度的控制：合適的熒光染料濃度是保證合適的熒光染料濃度是保證最佳信號產生的重要技術指標。最佳信號產生的重要技術指標。 1 110106 6/ml/ml細胞細胞，用，用2020l l熒光標記的單克隆抗體（熒

20、光標記的單克隆抗體（0.1-1 0.1-1 g/ ml)g/ ml)。l常用固定劑：常用固定劑：細胞周期測定時應將細胞用細胞周期測定時應將細胞用PBSPBS洗滌洗滌三次后用三次后用70%70%冰乙醇固定，在冰乙醇固定，在4 40 0 C C保存數月；熒光染保存數月；熒光染色后不能及時上機檢測，可用色后不能及時上機檢測，可用1-4%1-4%多聚甲醛固定，多聚甲醛固定， 4 40 0 C C保存。保存。58l同型對照：同型對照：為陰性對照；實驗中選用的大鼠或小為陰性對照；實驗中選用的大鼠或小鼠源性標記單抗，就一定選用相同源性的標記單鼠源性標記單抗，就一定選用相同源性的標記單抗作為同型對照來調整設置

21、電流電壓。抗作為同型對照來調整設置電流電壓。l上機前一般需過目：上機前一般需過目：200-300200-300目目l全程質控：全程質控：從樣品制備和標記、溶血、洗滌、儀從樣品制備和標記、溶血、洗滌、儀器質控和上機檢測，需全程質控。器質控和上機檢測，需全程質控。59 樣品培養細胞新鮮組織石蠟包埋單細胞 懸液 標記熒光抗體檢測表型測定細胞分選流式細胞術操作流程統計學 分析繼續培養60 細 胞 周 期 分 析（DNA 倍體分析）61lPIPI（碘化丙啶）是一種（碘化丙啶）是一種DNADNA結合劑，能非特異性嵌結合劑，能非特異性嵌入到入到死細胞死細胞的的DNADNA、RNARNA上；細胞經上；細胞經T

22、riton X-100Triton X-100或或NP-40NP-40打孔，把染料引入細胞內，經過一段時間打孔，把染料引入細胞內，經過一段時間染色后，用染色后，用FCMFCM檢測，可判斷檢測，可判斷DNADNA的相對含量。的相對含量。62上機63去甲斑蟊素對肝癌細胞周期的作用去甲斑蟊素對肝癌細胞周期的作用64G0-G1SG2-MFluorescence Intensity# of EventsA typical DNA Histogram of cell proliferation65圈門去除細胞碎片，分析細胞凋亡圈門去除粘連體，分析細胞周期66細胞凋亡分析 67l在形態上，早期細胞核固縮，染

23、色體邊集在核在形態上，早期細胞核固縮，染色體邊集在核膜內側顯新月體形、核碎裂；膜內側顯新月體形、核碎裂；細胞漿和細胞器細胞漿和細胞器密度增高、細胞體積變小密度增高、細胞體積變小；細胞膜皺折卷曲，；細胞膜皺折卷曲，但早期細胞膜的完整性未受到破壞但早期細胞膜的完整性未受到破壞l凋亡細胞的凋亡細胞的FSCFSC降低，降低，SSCSSC增加。增加。l細胞壞死時，細胞腫脹，細胞壞死時，細胞腫脹，FSCFSC增大，增大，SSCSSC也增大也增大68lDNADNA含量分析含量分析lAnnexinAnnexin-檢測法檢測法lTUNELTUNEL檢測檢測l與凋亡相關的蛋白測定，如與凋亡相關的蛋白測定，如APO

24、 2.7APO 2.7，Bcl-2, Bcl-2, Bax, Fas, FasLBax, Fas, FasL等檢測等檢測69DNA DNA 含量分析含量分析 凋亡的細胞因核酸內切酶的活性增強，使凋亡的細胞因核酸內切酶的活性增強，使DNADNA分裂成一些小分裂成一些小片段，這些小片段因細胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡片段，這些小片段因細胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡細胞的細胞的 DNADNA含量相對減少，因此在含量相對減少，因此在DNADNA的直方圖上出現一個位于的直方圖上出現一個位于 G1G1峰左側的小峰（峰左側的小峰（亞亞G1G1峰峰），稱為），稱為APAP峰。峰。 FCMFCM

25、的的DNADNA分析檢測細胞凋亡存在一定的局限性。比如，機分析檢測細胞凋亡存在一定的局限性。比如，機械處理的腫瘤標本常有許多碎片，在械處理的腫瘤標本常有許多碎片，在 DNADNA直方圖上出現較寬的雜直方圖上出現較寬的雜信號峰，使凋亡細胞被信號峰，使凋亡細胞被“淹沒淹沒”其中，不少文獻將其中，不少文獻將G1G1峰前的所有峰前的所有信號均算為凋亡細胞，可能會過高計算凋亡細胞的數量；因此在信號均算為凋亡細胞，可能會過高計算凋亡細胞的數量；因此在評價細胞早期凋亡時，該指標不夠靈敏。評價細胞早期凋亡時，該指標不夠靈敏。7071AnnexinAnnexin 磷脂結合蛋白作為探針識別細胞膜表面磷脂結合蛋白作

26、為探針識別細胞膜表面磷脂酰絲氨酸磷脂酰絲氨酸 細胞凋亡早期，細胞表面發生變化，細胞膜內部的細胞凋亡早期，細胞表面發生變化，細胞膜內部的磷脂酰絲氨酸（磷脂酰絲氨酸（PSPS）可以遷移到細胞外層表面。巨噬細胞就）可以遷移到細胞外層表面。巨噬細胞就是通過識別凋亡細胞表面的磷脂酰絲氨酸將凋亡細胞或凋亡是通過識別凋亡細胞表面的磷脂酰絲氨酸將凋亡細胞或凋亡小體吞噬，保護機體避免因細胞內部暴露引起的炎癥反應。小體吞噬，保護機體避免因細胞內部暴露引起的炎癥反應。AnnexinAnnexin 是一種是一種CaCa離子依賴的、對離子依賴的、對PSPS有高度親和力的磷脂有高度親和力的磷脂結合蛋白，可作為探針識別細胞

27、膜是否有結合蛋白，可作為探針識別細胞膜是否有PSPS而識別凋亡細胞，而識別凋亡細胞，由于壞死細胞也可能在膜表面出現由于壞死細胞也可能在膜表面出現PSPS，故需要同時進行染料，故需要同時進行染料（PIPI）排斥實驗，凋亡細胞膜完整，不能染色。）排斥實驗，凋亡細胞膜完整，不能染色。AnnexinAnnexin-檢測檢測72Annexin V/PI雙染活細胞為（Annexin V-/PI-）壞死細胞為（Annexin V+/PI+）凋亡細胞（Annexin V+/PI-）7374Phosphatidylserine exposure on outer leaflet of membrane bila

28、yer during apoptosis757677雙陰：活細胞 Annexin V-PE單陽：早期凋亡細胞雙陽：晚期凋亡細胞 7-AADd單陽：壞死細胞784. Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) MediateddUTP Nick End Labeling (TUNEL) AssaySchematic Representation of the Principle of TUNEL AssayThe enzyme TdT catalyses a template-independent addition of bromolated deoxyuridinetriphosphates (Br-dUTP) to the 3-hydroxyl (-OH) ends of double- and single-strandedDNA. After Br-dUTP incorporation, DNA break sites are identified by a FITC-labeledanti-BrdU monoclonal ant