1、化學發光法檢測傳染病化學發光法檢測傳染病 更靈敏、更特異、更準確更靈敏、更特異、更準確放免酶聯免疫化學發光熒光免疫60年代70年代80年代90年代免疫標記技術發展免疫標記技術發展國產進口酶促化學發光直接化學發光直接化學發光 化學發光技術的優勢與應用前景化學發光技術的優勢與應用前景 .敏感敏感度高，(10-21mol/L)超過酶免，熒光免疫等方法 .精密精密度，準確準確度超過放免，酶免，熒光免疫等方法 .試劑穩定穩定，無放射性無放射性，污染污染或生物毒性生物毒性； .測定耗時短，方便快速快速提供結果報告； .測定項目齊全項目齊全； 已發展成全自動全自動的測定系統。包被微粒子包被微粒子包被磁珠包被

2、磁珠包被微孔包被微孔包被試管包被試管包被技術的發展包被技術的發展-磁微粒子磁微粒子包被磁微粒包被磁微粒 標記異魯米諾標記異魯米諾Eg:雙抗夾心法分析模式雙抗夾心法分析模式 磁微粒子上包被的抗體與待檢測抗原及異魯米諾標記抗體結合 提升檢測功能靈敏度 增加檢測線性范圍 比吖啶酯更穩定 延長試劑效期微粒包被微粒包被液相反應液相反應磁微粒、直接化學發光反應反應充分速度更快酶標板，板式磁微粒，納米級，均相CLIA板式載量微粒子化學發光法抗體載量優勢微粒子化學發光法抗體載量優勢分配樣品分配樣品,磁顆粒磁顆粒和試劑和試劑孵育孵育使反應物使反應物結合結合在磁場中在磁場中清洗去除清洗去除未結合物質未結合物質加入

3、加入激發液激發液產生產生信號信號信號信號檢測檢測微粒子化學發光原理微粒子化學發光原理磁性微粒子及其分離技術磁性微粒子及其分離技術磁性微粒子技術的優點： 快速分離結合相與游離相 提高與Ag或Ab包被親和力 提高接觸表面積/反應容量比例，實現微量分析 不需要抗體分離步驟，杜絕干擾與交叉反應 允許共價耦合反應，因此可以檢測大/小分子的各種物質成分 能應用各種分析設計與反應模式，擴大應用范圍 如：夾心法，竟爭法，抗體檢測法等 利于檢測自動化與微量分析v 磁微粒子直接化學發光是最新一代免疫檢測新技術最新一代免疫檢測新技術v 具有液相、快速、靈敏、準確液相、快速、靈敏、準確的特點v 通過多中心的臨床評估，

4、基本上驗證了LICA在乙肝、丙肝、梅毒、艾滋、腫瘤標志物、甲狀腺功能等項目的臨床可用性v 多家臨床試驗顯示產品的質量不亞于進口的雅培、羅氏和西門子等廠家的產品媲美。AutolumiS2000微粒子化學發光儀微粒子化學發光儀 全自動化學發光免疫分析系統開發及其產業化，在全自動化學發光免疫分析系統開發及其產業化，在2011年年12月通過國家科學技術委員會的鑒定，鑒定委員會認為：月通過國家科學技術委員會的鑒定，鑒定委員會認為： 該項目具有創新該項目具有創新性和自主知識產權，性和自主知識產權，整體達到國際先進水整體達到國際先進水平。平。v 1）磁性微粒子技術： 便于分離，反應均勻，提高靈敏度v 2）泉

5、涌內外壁清洗技術： 最小的交叉污染率v 3）試劑盒蓋設計： 減少人工操作誤差和交叉污染，避免試劑揮發影響結果準確性v 4）試劑冷藏系統： 保證在儀器操作的過程中試劑能夠一直保持穩定v 5）磁性分離技術： 保證了清洗效率，對于靈敏度要求極高的標記免疫分析是十分關鍵的專利，獨有技術專利，獨有技術AutolumiS2000 免疫項目免疫項目甲狀腺功能甲狀腺功能甲狀腺素三碘甲狀腺原氨酸游離甲狀腺素游離三碘甲狀腺原氨酸促甲狀腺素性腺激素性腺激素人絨毛膜促性腺激素催乳素雌二醇卵泡刺激素黃體生成素孕酮睪酮腫瘤標志物腫瘤標志物甲胎蛋白癌胚抗原前列腺特異性抗原游離前列腺特異性抗原糖類抗原125糖類抗原15-3糖

6、類抗原19-92微球蛋白鐵蛋白神經元特異性烯醇化酶人鈣結合蛋白腫瘤相關抗原72-4鱗狀上皮癌相關抗原細胞角蛋白CYFRA 21-1心血管及心肌標志物心血管及心肌標志物N末端腦鈉肽肌鈣蛋白肌酸激酶同工酶C反應蛋白心肌脂肪酸結合蛋白脂蛋白相關磷脂酶A2髓過氧化物酶肌紅蛋白肝纖維化四項肝纖維化四項透明質酸型前膠原N端肽型膠原蛋白層粘連帶白傳染病傳染病乙型肝炎病毒前S1抗原乙型肝炎病毒e抗體乙型肝炎病毒e抗原乙型肝炎病毒核心抗體乙型肝炎病毒表面抗體乙型肝炎病毒表面抗原丙型肝炎抗體（HCV）梅毒抗體（TP）人類免疫缺陷病毒抗體糖代謝類糖代謝類胰島素C-肽全自動、管式、直接化學發光法全自動、管式、直接化學

7、發光法 -特異性強、性能穩定特異性強、性能穩定 超長時間無人值守超長時間無人值守 （1）試劑區）試劑區15個試劑位，個試劑位， （2）樣本區）樣本區12 12 = 144 個樣本位個樣本位 （3）碼垛區一次性裝載）碼垛區一次性裝載720個反應杯個反應杯 測試中可隨時添加，隨時替換測試中可隨時添加，隨時替換AutolumiS2000微粒子化學發光儀微粒子化學發光儀AutolumiS2000微粒子化學發光儀微粒子化學發光儀真正的急診功能，急診樣本，隨到隨測。測試速度高達220測試/小時 原試管上樣，無需倒管。 全封閉反應艙，有效減少外界環境干擾和污染全中文軟件，圖標式界面，操作更簡便綜合測試成本低

8、 管式、微粒子包被技術，反應速度更快，結果更準確。管式、微粒子包被技術，反應速度更快，結果更準確。v ELISA法檢測乙肝表面抗原、梅毒、艾滋、丙肝按照法檢測乙肝表面抗原、梅毒、艾滋、丙肝按照2010年年藥藥典典規定反應時間至少要規定反應時間至少要2小時小時30分鐘；而全自動微粒子化學發光分鐘；而全自動微粒子化學發光試劑則不到試劑則不到30分鐘即可完成。分鐘即可完成。v 穩定性更好穩定性更好v 特異性更好特異性更好 AutolumiS2000微粒子化學發光儀微粒子化學發光儀大部分國際一流廠家也都采用直接發光法：大部分國際一流廠家也都采用直接發光法：羅羅 氏氏西門子西門子雅雅 培培.傳染病試劑傳

9、統酶免法和微粒子化學發光法對比傳染病試劑傳統酶免法和微粒子化學發光法對比方法學項目傳統酶免法微粒子發光法分析敏感度特異性精密度分析敏感度特異性精密度HBsAgadr 0.1IU/mLadw 0.1IU/mLay 0.2IU/mL(-/-)20/20(+/+)3/313.21%adr 0.1IU/mLadw 0.1IU/mLay 0.2IU/mL(-/-)20/20(+/+)3/38.03%HBsAb10 mIU/mL (-/-)20/2012.05%10 mIU/mL(-/-)20/207.45%HBeAg1# 1:642# 1:1283# 1:32(-/-)15/15(+/+)9/1012.

10、04%1# 1:642# 1:1283# 1:32(-/-)15/15(+/+)10/108.03%HBeAb1# 1:322# 1:643# 1:64(-/-)15/15(+/+)9/1012.31%1# 1:322# 1:643# 1:64(-/-)15/15(+/+)10/108.20%HBcAb1# 1:1282# 1:1283# 1:256(-/-)15/15(+/+)14/1514.03%1# 1:1282# 1:1283# 1:256(-/-)15/15(+/+)15/1510.34%HCVL1、L2陽性，L3陰性，L4陰性(-/-)29/30(+/+)29/3010.05%L1

11、、L2陽性L3陽性，L4陰性(-/-)30/30(+/+)30/307%HIVS1, S2陰性,S3,S4,S5,S6陽性(-/-)18/20(+/+)20/2014.34%S1陰性, S2,S3,S4,S5,S6陽性(-/-)20/20(+/+)20/2010%TPL1、L2陽性，L3陰性，L4陰性(-/-)20/20(+/+)10/1011.26%L1、L2陽性L3陽性，L4陰性(-/-)20/20(+/+)10/107.98%參比試劑：雅培參比試劑：雅培I2000乙肝靈敏度特異性符合率HBsAg97.92%100%99.78%Anti-HBs95.98%97.38%96.69%HBeAg

12、95.24%100%99.59%Anti-HBe90.77%97.21%95.36%Anti-HBc91.54%98.9%94.48%試劑性能多中心臨床評估（乙肝）試劑性能多中心臨床評估（乙肝）免疫測定試劑的關鍵點免疫測定試劑的關鍵點v 作為免疫反應，抗原抗體的選擇是整個免疫分析特異性作為免疫反應，抗原抗體的選擇是整個免疫分析特異性和總體表現的關鍵和總體表現的關鍵 如何選擇好一個抗體如何選擇好一個抗體(單克隆或多克隆單克隆或多克隆)去檢測一個被檢去檢測一個被檢物質，而不與非常相似結構的其它代謝產物有交叉反應物質，而不與非常相似結構的其它代謝產物有交叉反應,或著是一些沒有臨床意義的分解產物等，這

13、是分析設計或著是一些沒有臨床意義的分解產物等，這是分析設計的重點中之重點。的重點中之重點。 批內、批間的分析重現性批內、批間的分析重現性。AFPHBsAg4.50%1.79%4.91%2.14%HCV12345MeanSDCV批內批內86.1186.3688.4087.9086.4386.271.551.79%批間批間74.59 73.63 69.64 71.90 71.96 71.01 3.20 4.50%HBsAg12345MeanSDCV批內批內72.59 71.25 76.50 75.05 78.03 76.61 1.642.14%批間批間0.22 0.22 0.23 0.22 0.2

14、3 0.23 0.01 4.91%批內批間微粒子化學發光試劑的精密度微粒子化學發光試劑的精密度相關性相關性相關系數相關系數線性系數線性系數HIV顯著相關0.990.98HCV顯著相關0.930.99參比試劑：雅培參比試劑：雅培試劑性能多中心臨床評估試劑性能多中心臨床評估相關性相關性相關系數相關系數線性系數線性系數HIV顯著相關0.970.92HBsAg顯著相關0.960.95N=500，參比試劑：雅培I2000試劑性能多中心臨床評估試劑性能多中心臨床評估 丙型肝炎抗體診斷試劑丙型肝炎抗體診斷試劑丙肝病毒復雜的基因結構： 決定了抗體譜的差異，從而為丙肝抗體檢測敏感度的提高帶來了困難。丙肝診斷試劑

15、目前存在的問題丙肝診斷試劑目前存在的問題v1、灰區標本的困惑、灰區標本的困惑v2、陽性標本的漏檢、陽性標本的漏檢問題形成的技術原因問題形成的技術原因-灰區的形成灰區的形成1、重組抗原的原因、重組抗原的原因 （1）融合蛋白）融合蛋白 （2）大腸桿菌雜蛋白）大腸桿菌雜蛋白2、第二抗體的非特異反應、第二抗體的非特異反應 （1）酶標抗體對固相載體的直接吸附）酶標抗體對固相載體的直接吸附 酶標二抗對于丙肝抗體是非特異的，和各種人酶標二抗對于丙肝抗體是非特異的，和各種人IgG均能反應均能反應結合。結合。 （2）個別標本中）個別標本中IgG濃度過高濃度過高 多聚體的混合：多聚體的混合：E-E、E-Ab、E-

16、Ab-E、E-Ab-E-Ab ，既，既引起本底背景，又阻遏抗原抗體反應引起本底背景，又阻遏抗原抗體反應 問題形成的技術原因問題形成的技術原因-陽性標本的漏檢陽性標本的漏檢1、關于靈敏度的兩個概念、關于靈敏度的兩個概念 （1）分析靈敏度）分析靈敏度 決定因素：決定因素： a.單個抗原決定族的抗原性強弱。單個抗原決定族的抗原性強弱。 b.試劑盒的信號放大能力試劑盒的信號放大能力 （2）流行病學敏感度）流行病學敏感度 決定因素：決定因素： a.抗原片段的種類是否齊全。抗原片段的種類是否齊全。 b.是否含構像抗原。是否含構像抗原。 c.分析靈敏度的高低。分析靈敏度的高低。CE1 E2/NS1NS2NS

17、3 NS4a NS4b NS5aNS5b丙型肝炎病毒的基因結構丙型肝炎病毒的基因結構ELISA-1st RIBA-1stELISA-2stRIBA-2stELISA-3stRIBA-3stC22-3C22-3NS5NS5C100C1005-1-1C33CC100C33CC1005-1-1C33CC33CC100C1005-1-1 2、抗原片段種類不全3、包涵體抗原，抗原性弱、包涵體抗原，抗原性弱4、缺乏構像表位、缺乏構像表位5、原核表達分子量小，抗原表位有限、原核表達分子量小，抗原表位有限6、抗原非糖基化，穩定性差、抗原非糖基化，穩定性差7、信號放大能力有限、信號放大能力有限8、固相載體形成的

18、空間位阻、固相載體形成的空間位阻問題形成的技術原因問題形成的技術原因-陽性標本的漏檢陽性標本的漏檢威高新型丙肝化學發光試劑的關鍵技術威高新型丙肝化學發光試劑的關鍵技術1、包被和標記實現雙特異，以降低假陽性、包被和標記實現雙特異，以降低假陽性率，并提高分析敏感度。率，并提高分析敏感度。2、通過整體系統優化，進一步擴大陰陽反、通過整體系統優化，進一步擴大陰陽反差，使結果判讀涇渭分明。差，使結果判讀涇渭分明。威高新型丙肝化學發光試劑技術策略威高新型丙肝化學發光試劑技術策略-灰區的解決灰區的解決1、酵母真核表達抗原，高效減少灰區標本、酵母真核表達抗原，高效減少灰區標本 eg: E.coli與與Pich

19、ia pastoris 檢測檢測國標國標國標品國標品表達載體表達載體N2N4N24P1P5P21大腸桿菌大腸桿菌（原核表達）（原核表達）0.2600.1490.2350.7422.6590.706畢赫酵母畢赫酵母（真核表達）（真核表達）0.0600.0140.0171.7362.8331.619Anti HCV重組重組 NS3 NS3 抗原抗原v NS3 HCVNS3 HCV病毒的最重要的抗原病毒的最重要的抗原v 通過通過酵母真核系統酵母真核系統成功的表達成功的表達NS3NS3抗原抗原, , 多重折疊以達到多重折疊以達到高度的免疫活性高度的免疫活性 v 高純度高純度; ; 易于直接標記易于直接

20、標記2、針對、針對Fab端的單特異性抗體標記物端的單特異性抗體標記物一般二抗一般二抗和和單特異抗體單特異抗體的對比的對比 國標二抗類型P27L3N2N4N18N24L4一般單抗0.5600.1600.2300.1620.0710.2140.065單特異抗體0.8920.3210.0650.0430.0140.1020.009 3、板式固相載體升級為管式磁微粒子包被、板式固相載體升級為管式磁微粒子包被 包被量更富足包被量更富足 管式液相反應更充分管式液相反應更充分 更有效的解決空間位阻效應更有效的解決空間位阻效應 4、光信號檢測，提高信噪比、光信號檢測，提高信噪比 信號放大代替靶標放大，減少靶標

21、放大帶來的非特異性信號放大代替靶標放大，減少靶標放大帶來的非特異性反應，遠遠大于反應，遠遠大于ELISA的信噪比。的信噪比。新型丙肝化學發光試劑新型丙肝化學發光試劑-降低漏檢率降低漏檢率1、在、在CORE、NS3、NS4、NS5的基礎上增加了的基礎上增加了E1區區，保證抗原片段的齊全，保證抗原片段的齊全2、pichia pastoris表達系統帶來以下優勢表達系統帶來以下優勢 （1）非包涵體而可溶性表達，抗原性強）非包涵體而可溶性表達，抗原性強 （2）因糖基化而提高穩定性）因糖基化而提高穩定性 （3）分子量大，抗原表位豐富）分子量大，抗原表位豐富 （4）具有構像抗原表位，而提高檢出率）具有構像

22、抗原表位，而提高檢出率3、磁微粒子標記抗原增加抗原抗體的反應強度、磁微粒子標記抗原增加抗原抗體的反應強度新型丙肝化學發光試劑新型丙肝化學發光試劑檢測國家參考品符合率對比檢測國家參考品符合率對比方法學陽性符合率 陰性符合率 最低減出限ELISA30/3029/303/4CLIA30/3030/303/4新型雙特異丙肝化學發光診斷試劑新型雙特異丙肝化學發光診斷試劑臨床驗證報告臨床驗證報告方法學真陽性檢出率假陽性率酶免試劑146/15019/2000新型雙特異150/1503/2000丙肝化學發光試劑臨床對比試驗報告丙肝化學發光試劑臨床對比試驗報告對照試劑：雅培對照試劑：雅培I2000SR試驗單位：

23、包頭市中心醫院試驗單位：包頭市中心醫院雅雅 培培總計總計陽性陽性陰性陰性威威高高陽陽性性404陰陰性性11314總計總計51318NONO。雅培雅培CUTOFF = 18000CUTOFF = 18000威高威高CUTOFF = 5040CUTOFF = 5040RLURLUscoscoRLURLUscosco17200.0415970.317225200.1420720.411318000.117490.347412600.0717230.342514400.0818750.372618000.1018790.373721600.1223130.45985400.0315120.300990

24、00.0516170.321107200.0416020.3181110800.0618390.365125400.0315220.302137200.0416170.32114340201.8939410.7821522644012.5822200644.04916340201.8922654844.951722644012.585488610.89181382407.6811823823.46RIBA試驗結果：陰性。定性檢測項目結果判讀定性檢測項目結果判讀-有反應性和無反應性有反應性和無反應性v 定性項目一般以陰陽性作為結果判斷的基礎。v 陰陽性判讀基于量化的結果，主觀進行陰陽性的定義。v 真正的確認的陰陽性需要通過金標準測量方法才能確證。v HCV的確證實驗RIBA（重組免疫印跡法）v HIV的確證實驗Western-Blot（蛋白質印跡法）v 感染初期，可能使用確證實驗也無法得出準確的陰陽性結論。v 檢驗方法的局限性，使用有反應性和無反應性來評估該樣本針對該檢測方法的檢測結果。v 半定量檢