1、7 高效液相色譜技術（高效液相色譜技術（HPLC） 高效液相色譜的優點是：檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復性好，定量精度高，應用范圍廣。適用于分析高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差的化合物。其缺點是：價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多。目前的發展趨勢是向生物化學和藥物分析及制備型傾斜。 高效液相色譜（HPLC：High Performance Liquid Chromatography ）是化學、生物化學與分子生物學、醫藥學、農業、環保、商檢、藥檢、法檢等學科領域與專業最為重要的分離分析技術，是分析化學家、生物化學家等用以解決他們

2、面臨的各種實際分離分析課題必不可缺少的工具。國際市場調查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場中占有最大的份額，增長速度最快。 7.1 基本原理基本原理 加樣加樣 流動相流動相 流動相流動相 固定相固定相 流動流動相相 A C B B C A 固定相 柱內填料，流動相 洗脫劑。 HPLC是利用樣品中的溶質在固定相和流動相之間分配系數的不同，進行連續的無數次的交換和分配而達到分離的過程。 按溶質（樣品）在兩相分離過程的物理化學性質可以作如下的分類： 分配色譜： 分配系數 親和色譜： 親和力 吸附色譜： 吸附力 離子交換色譜： 離子交換能力 凝膠色譜（體積排阻色譜）： 分子大小而引起的體積排阻 分

3、配色譜又可分為： 正相色譜：固定相為極性，流動相為非極性。 反相色譜：固定相為非極性，流動相為極性。 用的最多，約占6070。 固定相（柱填料）： 固定相又分為兩類： 一類是使用最多的微粒硅膠； 另一類是使用較少的高分子微球： 優點是強度大、化學惰性、使用pH范圍大 (pH=114)； 缺點是柱效較小，常用于離子交換色譜和 凝膠色譜。 最常使用的全孔微粒硅膠（310m）是化學鍵合相硅膠，這種固定相要占所有柱填料的80。它是通過化學反應把某種適當的化學官能團（例如各種有機硅烷），鍵合到硅膠表面上，取代了羥基（OH）而成。它是近代高效液相色譜技術中最重要的柱填料類型。 使用微粒硅膠要特別注意它的使

4、用pH范圍是 27.5，若過堿（pH8），硅膠會粉碎或溶解；若過酸（pH1），鍵合相的化學鍵會斷裂。有些特殊的健合相可以用于pH 911。 鍵合相使用硅膠作基質的優點是： 硅膠的強度大；微粒硅膠的了孔結構和表面積易人為控制；化學穩定性好。 硅膠 ( SiO2n H2O) ： OH OH SiOSi 重要的鍵合相是：硅烷化鍵合相，它是硅膠與有機硅烷反應的產物。 最常用的鍵合相鍵型是： SiOSiC R1 R1 SiOH + XSiR SiOSiR + HX R2 R2 硅膠 有機硅烷 鍵合相 X Cl，CH3O，C2H5O等。 R 烷：C8H17（即C8填料），C10H21，C18H37等。 R

5、1 、R2 X、CH3等。 最常用的“萬能柱”填料為“C18”，簡稱“ODS”柱，即十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（Octadecylsilyl，簡稱ODS）。這種填料在反相色譜中發揮著極為重要的作用，它可完成高效液相色譜7080的分析任務。由于C18(ODS)是長鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，對各種類型的生物大分子有更強的適應能力，因此在生物化學分析工作中應用的最為廣泛，近年來，為適應氨基酸、小肽等生物分子的分析任務，又發展了CH、C3、C4等短鏈烷基鍵合相和大孔硅膠（2040m）。 按鍵合到基質上的官能團可分為： 反相柱：填料為非極性，官能團為烷烴，例如：C18(ODS)、 C8、

6、C4等。 正相柱：填料為極性，官能團為 CN氰基、NH2氨基等。 離子交換鍵合相： 陽離子官能團：SO3H磺酸基、COOH羧基等。 陰離子官能團：R4N季銨基、-氨基等。 ( 由于硅膠基質的鍵合相只能在pH27.5的范圍內使用，而離子交換色譜要求有更寬的pH范圍，因此其基質現在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。) 流動相： 1. 反相色譜最常用的流動相及其沖洗強度如下： H2O甲醇乙腈乙醇丙醇異丙醇四氫呋喃 最常用的流動相組成是：“甲醇H2O”和“乙腈H2O”，由于乙腈的劇毒性，通常優先考慮“甲醇H2O”流動相。 2. 正相色譜常用的流動相及其沖洗強度的順序是： 正己烷乙醚乙酸乙酯異丙醇 最常用的

7、是正已烷，雖然其價格較貴，但80的順、反和鄰位、對位異構體仍然要用正相色譜來進行分離。 反相色譜中，溶質按其疏水性大小進行分離，極性越大疏水性越小的溶質，越不易與非極性的固定相結合，所以先被洗脫下來。流動相的pH對樣品溶質的電離狀態影響很大，進而影響其疏水性，所以在分離肽類和蛋白質等生物大分子的過程中，經常要加入修飾性的離子對物質，最常用的離子對試劑是三氟乙酸（TFA），使用濃度為0.1，使流動相的pH值為23，這樣可以有效地抑制氨基酸上羧基的離介，使其疏水性增加，延長洗脫時間，提高分辨率和分離效果。 完全離子化的溶質，例如強酸或強堿，其在反相鍵合相上的保留值很低，近于死時間流出，不能進行分析

8、。根據離子對色譜的原理將一種與樣品離子電荷（A）相反的離子（B），稱為對離子，加入到流動相中，使其與樣品離子結合生成弱極性的離子對，即中性締合物，從而增強了樣品的疏水性，加大了保留值，改善了分離效果。 流動相的選擇原則是： 樣品易溶，且溶解度盡可能大。 化學性質穩定，不損壞柱子。 不妨礙檢測器檢測，紫外波長處無吸收。 粘度低，流動性好。 易于從其中回收樣品。 無毒或低毒，易于操作。 易于制成高純度，即色譜純。 廢液易處理，不污染環境。 7.2 基本參數基本參數 1. 保留值保留值 進樣 t0 tR 保留時間“ tR”：進樣至出峰的時間。 死時間“ t0”：不被柱子吸附的惰性物質的出峰時間。 死

9、時間“ t0”的測定通常是使用不被柱子保留而又有紫 外吸收的惰性物質，例如：正相色譜常用四氯化碳， 反相色譜常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等。 容量因子“ k ”： 或： “ k ”是比“ tR”還常用的保留值，它與柱子的大小及流速無關，只與溶質在固定相和流動相的分配性質、柱溫以及相空間比（即固定相和流動相之體企積比）有關。“ k ”又定義為在分配平衡時某溶質在兩相中絕對量之比，消除了保留值的波動因素，而平衡常數“ K ”是平衡時物質在兩相中的濃度比。 k值的范圍： 0.4k2030 k25為佳，過大則耗時太長。00,tttkR00,tttkR00,tttkR00,tttkR00,tttkR00

10、,tttkR00,tttkRab00,tttkR溶質在流動相中的量溶質在固定相中的量 k 保留體積：VRtRFC ( FC - 流動相的流速 mL/min ) VR 是在 tR 時間內流動相流過柱子的體積。 調整保留時間：tR tRt0 調整保留體積：VR VRVR0tR FC 選擇性指標“ ”和相對保留值“” 可以更直觀和方便地反映色譜峰分離的好壞： 進樣 tR(1) tR(2) 相對保留值(分離因子)： ( 1.1為好 )1()2(RRtt)1()2()1()2(kkttRR 2. 柱效率：柱效率： 定義： 理論塔板數 ： ( 每米柱 ) 標準偏差，曲線拐點處峰寬的 1/2h 2 一半，即

11、峰高0.607處峰寬的一半。 W1/2 為便于測量，改用半峰寬： 1/2h W1/2( 或2t1/2 ) Wb 最常用的計算式： 另一計算式： ( Wb不如W1/2容易測量，因而此式用的較少。)2RtN22/154.5WtNR216bRWtN 理論塔板高度： ( L 柱長) 經驗式： H2dP ( dP10 H20 N5萬 ) ( dP5 H10 N10萬 ) dP柱填料的顆粒直徑 柱效的測定和計算： 以反相柱為例，流動相用87(V/V)的甲醇:水，樣品用苯、聯苯、萘等，加快記錄儀的走紙速度，測出半峰寬W1/2，并由走紙速度換算為與 tR 相同的單位 “分” 或 “秒” ，代入公式，計算出柱效

12、N。 提高柱效的方法： 固定相填料要均一，顆粒細，裝填均勻。 流動相粘度低。 低流速。 升高柱溫。NLH 3. 不對稱因子不對稱因子“Tf”： 用于形容色譜峰拖尾和前伸的程度，多數為拖尾峰。 h 進樣 進樣 A B 0.1h 拖尾 前伸 ( A、B如上圖所示) 通常 Tf1.21.3 ，若 Tf2 則峰不合格。 峰拖尾的原因是硅膠基質上的SiOH羥基未被全部鍵合而與溶質發生反應。 改進拖尾要用封尾技術：即用小分子的含甲基的物質再次對硅膠進行鍵合，封閉硅羥基；還可在流動相中加入帶 NH2氨基(對羥基敏感)的物質，將殘余的羥基掩閉。ABTf 分辨率： tR(1) tR(2) 進樣 W1/2(1)

13、W1/2(2) tW1 tW2 4. 分離度分離度 K1和和 K3 HPLC的目的和要求是：峰要盡可能窄（W1/2小），峰間距大（tR相差大）。 基線分離度 K1 ： ( 基線分離時用K1。) H h 2112)(2WWRRSttttR 峰高分離度： ( K31 基線分離，K3 更反映了實際分離度。)1(2/1)2(2/1)1()2(1WWttKRR HhHK3 5. 線速度：線速度：溶劑在柱中移動的速度。溶劑在柱中移動的速度。 mm/sec ( L柱長 t0 死時間) H(m) 粗粒 如右圖所示，用實驗可找到最佳的線速度： 細粒 即圖中的A點：u1 mm/sec 此處不用流量而用線速度，是因

14、為流量與 柱徑有關，而線速度與柱徑無關。 請記住不同柱內徑的最佳流量： A B u(1mm/sec) 柱內徑 流量 線速度 5 mm 1.0 mL/min 1 mm/sec ( B奌： u2 mm/sec ) 2 mm 0.2 mL/min 1 mm/sec 1 mm 50 L/min 1 mm/sec 由 “1 mm/sec ” 最佳線速度可計算出適合各種柱徑的最佳流量。 由上表可以看出，用5mm柱，一天要用一并昂貴的乙腈，若用1mm柱，則一個月才用一并。0tLu 5. 保留值方程：保留值方程： 正相色譜： lnkablnCbcCb 反相色譜： lnkacCb 離子交換色譜： lnkablnCb ( Cb強沖洗劑濃度 ) ( 對于不同溶質 a、b、c 系數不同 ) ( 反相色譜是線性方程 ) 正相色譜： 反相色譜： lnk lnk Cb Cb lnk lnk 萘 四氫呋喃/水 D 甲醇/水 苯 Cb D Cb (甲醇/水) D點：同樣的容量因子，四氫呋喃 D點：萘非極性強，k大，斜率陡 用量少 lnk 甲 lnk 乙 C A B Cb A A D A Cb A點甲、乙二溶質分不開